Ответы на экзамен по вирусологии. 1. определение вируса. Отличия и сходство с клеточными организмами. Вирусы
 Скачать 0.59 Mb.
|
|
31. ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМОВ И РЕПЛИКАЦИЯ ВИРУЛЕНТНЫХ Т-ЧЕТНЫХ И Т-НЕЧЕТНЫХ БАКТЕРИОФАГОВ (Т4, Т7). Бактериофаг Т7 (нечетный бактериофаг): • Вирион Т7: - имеет икосаэдрическую головку (72 капсомера, триангуляционное число = 7), хвост и фибрилы - диаметр – 50 нм - полный отросток – 15 нм (не способный к сокращению), заканчивается 6- угольной базальной пластиной, к каждой из вершин которой крепятся длинные фибрилы (с их помощью адсорбируется на клеточной стенке бактерии) • Геном Т7: - Двунитевая линейная ДНК, - Прямые концевые повторы 160 пар нукл., - Организован в 3 группы генов (поделен на 3 оперона) Истинно ранние гены – приходится 20% генома Отложено ранние - приходится 25% генома Поздние – приходится 55% генома. Т7 проникает в клетку по внутреннему каналу отростка. Бактериофаг пробивает бактериальную клеточную стенку и ДНК поступает в клетку. Репликация начинается с того, что РНК-полимераза фага открывает промотор и синтезирует комплементарную РНК длиной несколько десятков нт. Именно это РНК – затравка для ДНК-полимеразы. Как только ДНК-полимераза подходит к затравке, она вытесняет Т7 РНК полимеразу фага. Далее начинается синтез ДНК. Во всех дальнейших процессах активное участие принимает вирус-специфическая хеликаза-праймаза, которая одновременно расплетает цепи и синтезирует все остальные затравки для отстающей цепи. Далее после прочтения всей последовательности материнской ДНК, образуется 2 молекулы: (1) вновь образовавшаяся молекула с РНК-затравкой и дочерняя молекула и (2) молекула с абсолютно такой же структурой. Затравка удаляется и в результате получается 2 молекулы, у одной из которых конец тупой, а у другой – остается недореплицированным. Эта проблема возникает при репликации любых двунитевых ДНК, когда в качестве затравки используется олигорибонуклеотид. После удаления РНК-затравок, за счет прямых кольцевых повторов на концах молекулы образуются липкие концы, и молекула отжигается. Затем происходит внесение разрезов. Образуется свободный 3’- гидроксил и достройка молекул. В результате образуется 2 генома, соответствующих по длине материнским. Бактериофаг Т4 (четный) Особенности генома • модификация нт оснований (модифицирован цитозин – превращен в гидроксил метил цитозин с целью защиты от клеточных ферментов и от фаговых эндонуклеаз) • концевая избыточность • кольцевые перестановки (в икосаэдрическую головку бактериофага упаковывается 103% единиц генома, т.е. длина генома больше, чем это необходимо) • следствие упаковки дочерних геномов по механизму HEAD-FULL 32. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФАГОВ В ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ В КАЧЕСТВЕ ВЕКТОРОВ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ. Генная инженерия - ветвь биотехнологии по созданию рекомбинативных ДНК (рекДНК) из различных видов организмов и вирусов, способных размножаться в реципиентной клетке или организме и детерминировать образование биологически активных веществ, обеспечивающих потребности народного хозяйства, биологии и медицины в частности. Конструирование комбинативных генетических структур, детерминирующих образование биологически активных веществ или других продуктов, основано на использовании двух методов - выделении (вырезании) генов и их синтезе – первый этап. Передача и клонирование генов. На втором этапе генноинженерных работ выделенные и синтезированные гены с помощью рестриктаз вводят в кольцевые специализированные ДНК-векторы и сшивают их ДНК-лигазой в единую рекДНК, способную проникать в соответствующие клетки и благодаря наличию в векторах специфических ДНКрепликаторов, промоторов и терминаторов размножаться и избирательно накапливать генные продукты, что называют клонированием молекул ДНК. В зависимости от того, в каких клетках реплицируются векторы, их делят на векторы прокариот, эукариот и челночные, содержащие репликаторы генетически неродственных организмов. В генной инженерии их получают от естественных репликонов: плазмид, бактериофагов, фаго-плазмид и вирусов. Чаще всего из этих векторов используются плазмиды бактерий, особенно те, которые дают не 4-6 копий, как плазмида pSClOl кишечной палочки. В клетки животных гены вносят при помощи векторов, сконструированных на основе полиома-, папилома-, герпес-, адено-, ретровирусов и особенно вируса SV-40 и поксвируса осповакцины, в геном которого встраивают около 10% чужеродного генетического материала от его общей массы. В тех случаях, когда подобрать вектор невозможно, прибегают к безвекторной передаче генов путем трансформации. Правда, передать гены таким образом удается только бактериям, включая их в питательную среду. Частота трансформации бактерий прежде всего определяется степенью родства нуклеотидного состава ДНК донора и реципиента, на основе которого формируется трансформант, но зависит также от рН, ионного и белкового состава питательной среды, температуры культивирования и наличия особого фактора компетентности, имеющего структуру полипептида. Компетентность бактерий, дрожжей, растительных клеток можно увеличить с помощью ферментов, разрушающих полисахаридный каркас оболочек и превращающих их в сферо- и протопласты. И, наконец, некоторые возможности передачи генов открывает микрохирургия, позволяющая вводить чужеродную ДНК в ядра клеток.В результате интенсивного развития генной инженерии всего лишь за последнюю четверть XX в. получены клоны многих генов пептидных гормонов, инсулина, интерферона человека, овальбумина, коллагена, глобина, транспортных и рибосомаль-ных РНК, гистонов и некоторых других. Особый интерес для биологии и профилактической медицины представляют вакцины будущего на основе безвредных рекомбинантных вирусов, в геномы которых введены гены широко распространенных инфекционных вирусов, кодирующих один или несколько специфических антигенов. Все это явилось предпосылкой для создания «банков генов» про- и эукариот на основе эталонных штаммов эшерихий и винных дрожжей. 33. СТАДИИ РЕПЛИКАЦИИ ВИРУСОВ: АДСОРБЦИЯ (РЕЦЕПТОРЫ ВИРУСОВ), ПРОНИКНОВЕНИЕ, ДЕПРОТЕИНИЗАЦИЯ ВИРУСНОЙ ЧАСТИЦЫ, СИНТЕЗ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ ВИРУСНЫХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И БЕЛКОВ, СБОРКА ВИРИОНОВ, ВЫХОД ВИРУСНЫХ ЧАСТИЦ ИЗ КЛЕТКИ. Репродукцией вирусов называют процесс размножения вирусных частиц в чувствительных к ним клетках. В цикле репродукции четыре стадии: 1) подготовительную, или инициальную, включающую фазы адсорбции вируса на клетке, проникновения и раздевания в клетке; 2) собственно репродуктивную стадию образования структурных белков и вирионных нуклеиновых кислот; 3) сборку вирионов; 4) заключительную, сопровождающуюся выходом зрелых вирусных частиц из клетки. 1. Подготовительная стадия репродукции. Взаимодействие вирусов с клетками определяется наличием у них биологического сродства (тропизма), и прежде всего специфических рецепторов. С них и начинается «узнавание» вирусом чувствительных клеток. Находятся они на поверхности наружной мембраны клеток в большом количестве. По химической структуре рецепторы разнородны - молекулы-белки, углеводные или липидные компоненты протеидов. Адсорбция вирусов на соответствующих рецепторах осуществляется с помощью имеющихся у них прикрепительных белков. У простых вирусов прикрепительные белки содержатся в капсидах, у сложных - в суперкапсидах, например в шипах или булавовидных утолщениях у коронавирусов. фаза проникновения вируса в цитоплазму клетки двумя способами - пассивным путем виропексиса или активным путем слияния (интеграции) вирусной оболочки с клеточной мембраной. Виропексис -своеобразную форму эндоцитоза, при котором вирус проникает в клетку путем впячивания мембраны с образованием вокруг него вакуоли и поэтапным ее слиянием вначале с более крупной цитоплазматической вакуолью, а далее - с лизосомой или же с внутриклеточными мембранами, включая ядерную. Второй путь интеграция вирусных оболочек с наружной мембраной. Отмечается он лишь у тех видов вирусов, которые наделены белками слияния. Как и прикрепительные, белки слияния содержатся в капсидах простых и суперкапсидах сложных вирусов. Способность к репродукции вирусы приобретают только после освобождения их нуклеиновых кислот от оболочек, что принято называть фазой раздевания (депротеинизации). Осуществляется раздевание вирусов ферментами поверхностных плазматических мембран клеток-хозяев при слиянии с ними вирусных оболочек, а при виропексисе - ферментами лизосом и внутриклеточных цитоплазматическйх и ядерных мембран. Конечными продуктами раздевания у ряда вирусов являются, правда, не голые нуклеиновые кислоты, а НК, связанные с внутренним вирусным белком (пикорна-, аденовирусы), нуклеокапсидом (вирус гриппа) или сердцевиной (аденовирусы). 2. Собственно репродуктивная стадия, включающая фазы транскрипции, трансляции и репликации, у разных групп вирусов и семейств неодинакова. 3.Сборка вирионов. Хорошо известно лишь то, что при формировании простых вирусов в ее основе лежит самопроизвольный механизм белок-нуклеиновой сборки. У сложно устроенных вирусов сборка происходит поэтапно и во многом зависит от того, где происходит их репликация - в цитоплазме или ядре. Начинается она всегда с формирования нуклеокапсидов (сердцевин) и синтеза суперкапсидных белков. При этом образование первых происходит в специальных структурах клеток, или «фабриках», индуцированных вирусами, а вторых — в полирибосомах, связанных с внутриклеточными мембранами. Затем нуклеокапсиды, глико- и липопротеиды суперкапсидов РНК-вирусов мигрируют в места их сборки, которыми обычно являются мембраны эндоплазматических сетей, а чаще - поверхно¬стные мембраны клеток. Связывание нуклеокапсидов с суперкапсидными субъединицами может происходить без или с участием матриксных мембранных М-белков вирионов, способных к белок-белковым и белоклипидным взаимодействиям. Процесс сборки ДНК-содержащих вирусов еще сложнее. Начинаясь с формирования сердцевин или нуклеокапсидов, протекает через образование неполных форм вирионов с разным содержанием ДНК в капсидах и незрелых вирионов с полностью ненарезанными в них предшественниками полипептидов, свойственных зрелым формам вирионов. При окончательном формировании зрелых вирионов в их внешние оболочки часто включаются липиды, углеводы, белки и даже ферментные системы клеток-хозяев. Заключительная стадия репродукции. 4.Конечным этапом репродукции вирусов является выход сформированных вирионов из инфицированных клеток. При этом возможны два пути их освобождения: 1) отпочковывание от клеток, присущее сложным вирусам, имеющим липопротеидную оболочку; 2) разрушение клеток, которое в основном вызывают безоболочечные простые пикорна-, рео-, парво-, паповаи аденовирусы. 34. РЕПЛИКАЦИЯ ВИРУСНЫХ ДВУНИТЕВЫХ ДНК-ГЕНОМОВ (ВИРУСОВ I КЛАССА ПО БАЛТИМОРУ). Класс I: вирусы, содержащие двуцепочечную ДНК для репликации попадают в ядро клетки, так как им требуется клеточная ДНК-полимераза. Также репликация ДНК этих вирусов сильно зависит от стадии клеточного цикла. В некоторых случаях вирус может вызывать деления клетки, что может приводить к раковому перерождению. Примерами таких вирусов являются Herpesviridae, Adenoviridae и Papovaviridae. У представителей семейства Poxvirus геномная ДНК реплицируется не в ядре. Репликация на примере Herpesviridae. Заражение начинается с прикрепления вируса к клеточным рецепторам. Вирус проявляет большое сродство к клеткам слизистой оболочки эпителия. Вслед за этим происходит слияние оболочки вируса с плазматической или эндосомной мембраной, и лишенный оболочки капсид переносится к порам в ядерной мембране, через которые ДНК вируса попадает в ядро. Транскрипция и репликация вирусной ДНК, а также сборка капсидов происходят в ядре. Вирусная ДНК транскрибируется в ходе репродуктивного цикла клеточной РНК-полимеразой II при участии на всех стадиях цикла ряда вирусных факторов. Синтез продуктов вирусных генов строго регулируется; экспрессия вирусных генов координирована и представляет собой последовательно развернутый во времени каскад событий. Несколько более 50 хорошо представленных генных продуктов образуют по меньшей мере пять групп, отличающихся друг от друга по характеру регуляции синтеза на транскрипционном и посттранскрипционном уровне. Некоторые из генных продуктов относятся к ферментам или ДНК-связывающим белкам, непосредственно вовлеченным в синтез ДНК. Основная масса вирусной ДНК синтезируется по механизму катящегося кольца. Одновременно могут происходить изомеризация и упаковка ДНК. Сборка вируса складывается из нескольких стадий: внутри уже сформировавшихся капсидов упаковывается ДНК, вирусы созревают и выходят из клетки через плазматическую мембрану. Прикрепление. Герпесвирусы прикрепляются к специфическим рецепторам на клеточной поверхности, которые еще не идентифицированы. Прикрепление вируса активирует белок, находящийся на поверхности вируса и вызывающий слияние оболочки вируса с плазматической мембраной. Предполагают, что происходит именно слияние оболочки с плазматической мембраной, а не фагацитоз. Выход вирусной ДНК из капсида. После проникновения в клетку капсид транспортируется к порам в ядерной мембране, а затем под контролем вирусных факторов вирусная ДНК выходит в нуклеоплазму. На ранних стадиях заражения вирусом дикого типа у ядерных пор легко обнаруживаются пустые капсиды. Следуя аналогии с заражением аденовирусом, можно предположить, что транспорт капсидов герпесвирусов к ядерным порам осуществляется при участии цитоскелета. Родительская вирусная ДНК накапливается в ядре 35. РЕПЛИКАЦИЯ ВИРУСНЫХ ОДНОНИТЕВЫХ (+)ДНК-ГЕНОМОВ. Вирусы семейств Circoviridae и Parvoviridae реплицируют геномную ДНК в ядре и в ходе репликации образуют интермедиат — двуцепочечную ДНК. Репликация на примере Parvoviridae. Поглощенный парвовирус поставляет геном в ядро клетки, где однонитевая ДНК преобразуется в двунитевую ДНК клеточными факторами и ДНК-полимеразой. Двунитевая ДНК-версия вирусного генома требуется для транскрипции и репликации. Репликация происходит только в растущих клетках. Вирусные белки синтезируются в цитоплазме и затем возвращаются в ядро, где собираются вирионы. В результате ядро и цитоплазма клетки дегенерируют. Вирусы освобождаются в результате лизиса клетки. 36. РЕПЛИКАЦИЯ ВИРУСНЫХ ДВУНИТЕВЫХ РНК-ГЕНОМОВ. Класс III: вирусы, содержащие двуцепочечную РНК представители класса III реплицируют геномную РНК в цитоплазме и используют полимеразы хозяина в меньшей степени, чем ДНК-вирусы. Класс III включает в себя два семейства — Reoviridae и Birnaviridae. Репликация моноцистронная, геном сегментирован, каждый ген кодирует один белок. На примере Reoviridae. У ротавирусов наружный капсид включает белки VP4 (шипы, выступающие на поверхности вириона, являющиеся гемагглютинином и прикрепительным белком) и VP7 — основной компонент наружного капсида, являющийся типоспецифическим антигеном. Ротавирусы и ортореовирусы активизируются протеолизом (инфекционные субвирусные частицы — ИСЧ) с увеличением их инвазионной способности. Вирионы реовирусов могут адсорбироваться (с помощью белка сигма-1) на клетке и проникать рецептор-опосредованным эндоцитозом в цитоплазму, где под влиянием ферментов лизосом происходит частичная депротеинизация — разрушение наружного капсида с образованием субвирусных частиц. Возможно проникновение вирусов в клетку другим механизмом, например, инфекционных субвирусных частиц, не содержащих белка сигма-1. ИСЧ ротавирусов проникают через клеточную мембрану; механизм проникновения неизвестен. ИСЧ освобождают сердцевину в цитоплазме, и ферменты сердцевины инициируют продукцию иРНК. С каждого фрагмента геномной РНК считывается индивидуальная иРНК. Транскрипция генома проходит в две фазы (ранняя и поздняя). Минус нить РНК используется как матрица. Сборка вирионов происходит в цитоплазме. Вирусы выходят при лизисе клетки. 37. РЕПЛИКАЦИЯ ВИРУСНЫХ ОДНОНИТЕВЫХ (+)РНК-ГЕНОМОВ. Класс IV: вирусы, содержащие одноцепочечную (+)РНК Непосредственно на (+) геномной РНК вирусов IV класса может идти синтез белка на рибосомах клетки хозяина. Вирусы классифицируют на две группы, в зависимости от особенностей РНК: • у вирусов с полицистронной мРНК трансляция приводит к образованию полипротеина, который затем разрезается на зрелые белки. С одной цепи РНК может синтезироваться несколько разных белков, что снижает длину генов. • вирусы со сложной трансляцией — синтез белка идет со сдвигом рамки считывания, также используется протеолитический процессинг полипротеинов. Эти механизмы обеспечивают синтез разных белков с одной цепи РНК. Примеры вирусов данного класса включают представителей семейств Astroviridae, Caliciviridae, Coronaviridae, Flaviviridae, Picornaviridae, Arteriviridae и Togaviridae. Picornaviridae. Вирус взаимодействует с рецепторами на поверхности клетки. С помощью этих рецепторов осуществляется перенос вирусного генома в цитоплазму, сопровождающийся потерей VP4 и освобождением вирусной РНК из белковой оболочки. Геном вируса может поступить в клетку путем эндоцитоза с последующим выходом нуклеиновой кислоты из вакуоли или путем инъекции РНК через цитоплазматическую мембрану клетки. На конце РНК имеется вирусный протеин - VPg. Геном используется, как и РНК, для синтеза белка. Один большой полипротеин транслируется с вирусного генома. Затем полипротеин расщепляется на индивидуальные вирусные протеины, включая РНК-зависимую полимеразу, синтезирует минус-нить матрицу с поверхности. Структурные белки собираются в капсид в него включается геном, образуя вирион. Время, необходимое для прохождения полного цикла размножения, - от заражения до окончания сборки вируса - обычно составляет 5-10 ч. Их величина зависит от таких факторов, как рН, температура, тип вируса и клетки-хозяина, метаболическое состояние клетки, число частиц, заразивших одну клетку. Вирионы освобождаются из клетки посредством ее лизиса. Репродукция происходит в цитоплазме клеток. В культуре под агаровым покрытием вирусы образуют бляшки. 38. РЕПЛИКАЦИЯ ВИРУСНЫХ ОДНОНИТЕВЫХ (-)РНК-ГЕНОМОВ. Класс V: вирусы, содержащие одноцепочечную (−)РНК Геномные РНК вирусов класса V не могут быть транслированы на рибосомах клетки хозяина, предварительно требуется транскрипция вирусными РНК-полимеразами в (+)РНК. Вирусы пятого класса классификации по Балтимору классифицируют на две группы: • вирусы, содержащие несегментированный геном, на первом этапе репликации происходит транскрипция (−)РНК вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразой в моноцистронную мРНК, и далее синтезируются дополнительные копии (+)РНК, служащие матрицами для синтеза геномных (−)РНК. Репликация геномных РНК таких вирусов осуществляется в цитоплазме. • вирусы с сегментированными геномами, репликация геномных РНК которых происходит в клеточном ядре, вирусная РНК-зависимая РНК-полимераза синтезирует моноцистронные мРНК с каждого сегмента генома. Наибольшим отличием данной группы вирусов от другой группы пятого класса состоит в том, что репликация осуществляется в двух местах. Представители данного класса входят в состав семейств: Arenaviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Bunyaviridae, Filoviridae, Deltaviridae и Rhabdoviridae. На примере Filoviridae. Филовирусы - вирус Марбург и вирусы Эбола , возбудители лихорадок Марбург и Эбола - имеют форму нитей диаметром 80-100 нм. Нуклеокапсид обладает спиральной симметрией, внешняя оболочка образуется из липидов клеточной мембраны клетки- хозяина. Геном представлен линейной минус-цепью РНК, содержит около 19000 нуклеотидов и кодирует 7 белков. Поверхностный гликопротеид (GP) образует шиловидные отростки внешней оболочки, способствующие проникновению вируса в клетку. Высокий уровень гликозилирования гликопротеида - по-видимому, одна из причин низкого содержания нейтрализующих антител в сыворотке больных. Два белка матрикса - VP40 и VP24 - участвуют в отпочковывании и раздевании вируса. Капсид образован главным структурным белком - нуклеопротеидом (NP) и малым структурным белком - VP30. Шестым белком является РНК-полимераза (как и у остальных вирусов, содержащих минус- цепь РНК). |