МБ з13. Патогенные иерсинии
 Скачать 41.11 Kb.
|
|
Согласно принятой в настоящее время схеме различают 8 серологических вариантов Y.pseudotuberculosis, однако некоторые авторы выделяют от 13 до 65 субтипов, отличающихся по антигенной структуре. Для возбудителя псевдотуберкулеза характерно преимущественное распространение в Европе штаммов серовара 1 (70%), 2 (15%), 3-5 (15%). В Северной Америке и Канаде 95% всех выделенных штаммов отнесены к сероварам 3 и 1b. Серовар 6 изредка встречается в Японии. Преобладание штаммов Y.pseudotuberculosis серовара 1 объясняется двумя моментами. Во-первых, наличием дополнительной плазмиды pVM 82 (молекулярной массой 82 МД), содержащей фрагмент ДНК молекулярной массой 25 МД, который кодирует температурозависимую супрессию антителообразования к двум (60 и 90 кД) из четырех основных антигенов псевдотуберкулезного микроба, следствием чего является антигенная мимикрия, создающая условия для возникновения вспышек заболевания. Во-вторых, присутствием в хромосоме гена irp 2, кодирующего высокомолекулярный белок - сидерофор HMVP 2. При оценке распространенности сероваров псевдотуберкулезных иерсиний в нашей стране и их связи с заболеваниями не исключена возможность разночтений, так как типовые монорецепторные сыворотки до настоящего времени не производятся, а гипериммунные сыворотки часто дают внутривидовые перекрестные реакции из-за наличия антигенных связей между различными сероварами Y.pseudotuberculosis, что можно объяснить наличием общих структурных компонентов клеточной стенки псевдотуберкулезных бактерий. У Y.pseudotuberculosis обнаружено 7 структурных сахаров, из которых 5 (абеквоза, тивелоза, паратоза, колитоза, аскарилоза) являются общими для всех серологических вариантов. Установлено структурное подобие липида А и иммунодоминантной группы липолисахаридов Y.pseudotuberculosis сероваров 1а, 1b, 3, 5, 6 и показано, что липид А липополисахарида этих серовариантов перекрестно реагирует с антисывороткой к липиду А серовара 1b. Антигены липополисахаридной и белковой природы являются в настоящее время неотъемлемыми компонентами в производстве тест-систем для обнаружения и типирования возбудителя псевдотуберкулеза, поэтому наличие перекрестных реакций с диагностическими сыворотками именно к этим фракциям способно существенно снижать специфичность типирования псевдотуберкулезных бактерий. Использование жгутиковых и капсульных антигенов в целях типирования весьма ограничено, хотя и показана возможность применения Н-антигенов в лабораторной и эпидемиологической диагностике иерсиниозов. С целью преодоления негативных моментов, присущих серотипированию на основе агглютинационных тестов, возможно применение типовых фагов для определения сероваров Y. pseudotuberculosis. Однако это сопряжено с рядом трудностей, обусловленных биологическими особенностями не только самого возбудителя псевдотуберкулеза (выраженная диссоциация культур-продуцентов, перекрестная активность), но и бактериофагов как таковых. В конечном итоге не удалось получить стандартные стабильные наборы моноспецифических бактериофагов против сероваров псевдотуберкулезных бактерий. Поливалентный бактериофаг приобрел значение диагностического препарата только для определения видовой принадлежности культур Y.pseudotuberculosis. Ввиду того, что традиционные фенотипические тесты не обеспечивают эффективного эпидемиологического маркирования изолятов псевдотуберкулезных бактерий, Н.В. Михайлов (1997) провел генотипирование штаммов Y.pseudotuberculosis методом полимеразной цепной реакции с универсальными праймерами (УП-ПЦР) и установил, что возбудителем псевдотуберкулеза у людей на территории России и Украины в 65% случаев являются штаммы серовара 5, и только в 35% - штаммы серовара 1. R-антиген Y.pseudotuberculosis - общий с антигеном возбудителя чумы. Общие антигены обнаружены у Y.pseudotuberculosis и сальмонелл серогрупп В и D, что чревато диагностическими ошибками при использовании только иммунологических методов диагностики. Антигенный перекрест между Y.pseudotuberculosis и Y.enterocolitica незначителен (около 30 общих антигенов). По О-антигену Y.enterocolitica выделяют свыше 70 сероваров возбудителя. Наиболее значимыми в патологии человека являются О3, О9, реже О5 и О8. Довольно часто встречаются нетипируемые штаммы Y.enterocolitica. Серовар О9 имеет тесные антигенные связи с бруцеллами. Культуры Y.enterocolitica по ферментации ксилозы, салицина (эскулина), трегалозы, а также по образованию индола разделяют на 5 биоваров (табл.28.3), однако, следует отметить, что их биохимическая характеристика не всегда однородна. Биовар 1 разделен на 2 биогруппы 1А и 1В в связи с отсутствием ферментации салицина биогруппой 1В, а также гидролиза эскулина и отсутствием фермента пирозинамидазы. В биогруппу 1В входят в основном патогенные иерсинии. Иерсинии относятся к гетеротрофным факультативным анаэробам, температурный оптимум +28оС, оксидазоотрицательны и каталазоположительны, отличаются выраженными психрофильными и олиготрофными свойствами, могут развиваться при отсутствии азота и углерода, усваивая эти химические элементы из аммиака и летучих соединений углерода в атмосфере. Таблица 28.3 Биовары Y.enterocolitica
Температурный фактор является одним из важнейших, определяющих изменчивость иерсиний и их резистентность. Селективная ценность низких температур дала возможность Д.Патерсону и Р.Куку предложить метод холодового обогащения, то есть культивирования иерсиний в биосубстратах при температурах бытового холодильника. Иерсинии не образуют сероводород. Хемоорганотрофы, хорошо растут на простых питательных средах, углеводы сбраживают без образования газа. В жидкой среде иерсинии образуют равномерное помутнение, при дальнешем культивировании среда просветляется и образуется слизистый или порошковидный осадок. На плотных питательных средах образуют гладкие колонии в S-форме, реже – шероховатые R-формы. Для дифференциации видов иерсиний используются биохимические тесты (табл. 28.4). Основы эпидемиологии иерсиниозов. Эпидемиология иерсиниозов изучена недостаточно. Сочетание паразитических и сапрофитических свойств способствует распространению этих микроорганизмов в природе, они не только выживают во внешней среде, но и размножаются в различных ее объектах (воде и почве). Иерсинии широко распространены среди диких и домашних животных, птиц, людей. Основными носителями возбудителей псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза среди животных являются грызуны и отчасти птицы, выделяющие иерсиний с экскрементами. Остро болеют кишечным иерсиниоэом домашние свиньи, в связи с этим считают, что свиное мясо может быть фактором передачи Yersinia enterocolitica. Таблица 28.4 Основные дифференциальные признаки иерсиний
В последнее время довольно часто выделяют патогенные для человека кишечные иерсинии сероваров 03 и 09 от коров и коз. Из лабораторных животных к возбудителю псевдотуберкулеза наиболее чувствительны морские свинки и белые мыши, в то время как кишечные иерсинии для лабораторных животных практически не патогенны. Псевдотуберкулез следует отнести к зооантропоонозам с природной очаговостью, он проявляется чаще в виде эпидемических вспышек в конце зимы. Псевдотуберкулез не относится к контагиозным инфекциям, поскольку человек практически не является источником инфекции, так как выделяет незначительное количество возбудителя. Заражение человека иерсиниями в основном происходит алиментарным путем. Факторами передачи являются пищевые продукты, вода. Сезонность связана со значительным накоплением иерсиний в овощах за время длительного их хранения при относительно низких температурах. Роль грызунов при этом ничтожна, так как овощи могут быть первично инфицированы иерсиниями через корневую систему. В последнее время в распространении кишечного иерсиниоза основным считается водный фактор, причем значительная часть заболеваний кишечным иерсиниозом связана со спорадическими случаями (80%). При кишечном иерсиниозе широко распространено так называемое «здоровое носительство» иерсиний. Больные этой инфекцией регистрируются в течение всего года с некоторым сезонным подъемом в марте - мае. Краткие сведения о клинике и патогенезе иерсиниозов. Иерсинии проникают в организм через рот с пищей или водой. Инкубационный период при кишечном иерсиниозе составляет 2-3 суток, при псевдотуберкулезе - около недели. В патогенезе иерсиниозов первостепенную роль играет адгезия бактерий к слизистой оболочке кишечника и их последующая инвазия внутрь эпителиальной клетки. Вирулентные свойства иерсиний полностью проявляются лишь в условиях роста при +37оС и определяются набором хромосомных и плазмидных генов. К хромосомным белкам следует отнести инвазин, энтеротоксин, сидерофор, а также белок Аil, обеспечивающий помимо инвазии и адгезии, резистентность к сыворотке крови. Довольно часто патогенные свойства иерсиний зависят от наличия плазмиды вирулентности – рYV, размеры которой составляют 47 MД. Данная плазмида имеется как у бактерий вида Y.pseudotuberculosis, так и у Y.enterocolitica. Она опосредует поверхностную агглютинацию и клеточную адгезию, синтез и высвобождение белков. Для сохранения данной плазмиды в лабораторных условиях рекомендуется культивировать иерсинии при +37оС, концентрации Са++ - 445 мкмоль и рН 5,5. Штаммы, обладающие данной плазмидой, проявляют следующие фенотипические свойства в зависимости от температуры: зависимость от Са ++; аутоагглютинационную активность; продукцию белков наружной мембраны (ОМРs); продукцию V- и W-антигенов; повышенную гидрофобность клеточной поверхности. Плазмида вирулентности также кодирует белки наружной мембраны – YOPs, адгезины – Yad, липопротеины - Ylp. Плазмида 82 MД присуща только 1 серовару псевдотуберкулезного микроба. Штаммы, несущие эту плазмиду, обусловливают более тяжелое течение инфекции в связи с выраженным иммуносупрессивным действием. Маркером вирулентноти иерсиний является также отсутствие у штаммов пиразинамидазной активности. Особо следует остановиться на характеристике белков наружной мембраны – YOPs (Yersinia outermembrane proteins), среди которых различают белки-эффекторы, направленные внутрь клетки-мишени, порообразующие белки, необходимые для переноса эффекторов. К эффекторным белкам относят белки YOPe, являющиеся цитотоксинами, YOPh - ингибиторы фагоцитоза, Ypk/YOPo - протеинкиназу, YOPg - обеспечивающие апоптоз клеток лимфоидной ткани, YOPt - цитотоксины, приводящие к изменению цитоскелета, YOPm - ингибирующие активность тромбоцитов. Среди порообразующих белков различают YOPb - контактный гемолизин и YOPd, участвующий в переносе белков первой группы. Общим регулятором YOP является белок VirF, он термозависим и обусловливает возможность экспрессии YOP только при +37оС и без ионов Са ++. Способность псевдотуберкулезных иерсиний синтезировать суперантиген YPM обусловливает генрализацию инфекционного процесса, развитие узловатой эритемы, синдрома Кавасаки. Из-за множественности и неспецифичности симптомов иерсиниозы, как правило, проходят под другими диагнозами: скарлатина, энтероколит, пищевая токсикоинфекция, аппендицит, ревматизм и др. Довольно трудно дифференцировать на основании только клинических симптомов желтушные формы псевдотуберкулеза от вирусных гепатитов А и Е. Только микробиологическое исследование позволяет выявить эти часто встречающиеся заболевания и провести целенаправленные лечебные и противоэпидемические мероприятия. Псевдотуберкулез протекает в виде скарлатиноподобной, абдоминальной, желтушной, артралгической и смешанной форм. Кишечный иерсиниоз включает в себя следующие клинические формы: гастроинтестинальную, абдоминальную, генерализованную, вторично-очаговую. Описаны также септические формы иерсиниозов. Микробиологическая диагностика иерсиниозов. Микробиологическая диагностика иерсиниозов основана на бактериологическом (культуральном) и иммунологическом исследовании. В последние годы с успехом используются молекулярно-генетические методы. Возбудители иерсиниозов выделяются из организма главным образом с испражнениями, где они обнаруживаются как во время болезни, так и в период рецидивов. Высеваемость иерсинии на первой неделе болезни довольно высока и достигает 50-70%. Выделить иерсинии из крови удается только при тяжелом течении и септической форме заболевания. Применение антибиотиков до начала бактериологического исследования резко снижает результативность обследования. Основным материалом для диагностического лабораторного исследования являются фекалии, в зависимости от формы заболевания могут быть исследованы также удаленные мезентериальные лимфатические узлы, аппендикс, гной из полостей и абсцессов, моча и смывы из зева. По эпидемиологическим показаниям исследуют материалы от диких животных и грызунов: содержимое кишечника, печень, селезенку, лимфатические узлы. Овощи исследуются на наличие иерсиний путем взятия смывов с поверхности (на границе здоровой и пораженной частей). Исследуют также мясные, рыбные продукты и молоко. Материал следует немедленно доставлять в лабораторию, а если это невозможно, его следует хранить при температуре не выше +3-5°С. В этом случае плотный материал необходимо залить 2-3 мл охлажденной стерильной воды или физиологического раствора. Фекалии рекомендуется исследовать ежедневно в течение первых 3 суток болезни, а затем через 3-5 суток для контроля эффективности лечения. Прямой посев фекалий на плотные питательные среды неэффективен из-за обильного роста банальной микрофлоры. Однако при наличии опыта в ходе обычного исследования фекалий на среде Эндо можно выявить колонии кишечных иерсиний, реже – Y.рseudotuberculosis. После прямого посева испражнений на дифференциально-диагностическую среду Серова также иногда удается выделить иерсинии в первые дни болезни. Выделение иерсиний из биосубстратов наиболее эффективно с помощью методических приемов, основанных на использовании биологических особенностей этих микроорганизмов. Учитывая, что возбудители иерсиниозов могут гораздо быстрей, чем другие бактерии, накапливаться в голодной среде на холоду, в качестве среды обогащения целесообразно использовать 1/15 М фосфатный буферный раствор (ФБР) с рН 7,6-7,8; 1% забуференную пептонную воду (ЗПВ) с рН 7,2; буферно-казеиновую дрожжевую среду (БКД). Поэтому исследуемый материал обязательно засевают в жидкую среду накопления. Пробирки с посевами немедленно помещают в холодильник при температуре +3-5°С, где они должны находиться до отправки в лабораторию. В лаборатории из среды обогащения следует сделать первый высев на плотную питательную среду, для чего пробирки инкубируют в холодильнике не более 10 сут, производя через каждые 3 сут высев из них на плотную питательную среду. Таким образом, окончательный отрицательный ответ не можен быть выдан ранее 10 сут с начала исследования. С целью повышения эффективности культурального метода перед последним высевом материала на плотные питательные среды целесообразно проводить щелочную обработку проб. Метод основан на относительной резистентности к щелочи иерсиний по сравнению с другими энтеробактерями. Плотными средами служат дифференциально-диагностическая среда Серова (предпочтительно), дифференциально-диагностическая питательная среда для выделения возбудителей иерсиниоза и псевдотуберкулеза, сухая (СБТС), среда Эндо, среды CIN, DYS, дезоксихолатный агар, агар Мак-Конки, питательный агар. При целенаправленном выделении Y.еnterocolitica в питательный агар рекомендуется добавить ампициллин из расчета 25 ЕД/мл среды. На среде Серова колонии иерсиний через 42 ч средних размеров (1-3 мм), с матовой поверхностью, имеют перламутровый блеск, плотной консистенции, при снятии петлей перемещаются по поверхности среды, центр их при этом легко крошится. Колонии других кишечных бактерий на этой среде более крупные (3-5 мм), уплощенные, блестящие, с неровным краем, маслянистой консистенции. Дифференцировать колонии Y. pseudotuberculosis и У. еnterocolitica на среде Серова довольно сложно. На СБТС колонии Y. pseudotuberculosis вырастают в виде мелких голубовато-зеленых колоний (до 2 мм) с фестончатым краем, выпуклые с приподнятым центром и суховатой матовой поверхностью на синем фоне среды. Колонии Y. еnterocolitica и других видов иерсиний на этой среде более крупные (до 4 мм), выпуклые, сухие с матовым налетом, голубого цвета. Колонии других энтеробактерий изменяют окраску среды, приобретая желтый цвет и характерную морфологию (выпуклые, сочные), благодаря чему они легко дифференцируются от иерсиний. На питательном агаре колонии Y. еnterocolitica растут быстро и мало отличаются от колоний других энтеробактерий. В первые сутки роста ряд морфологических особенностей можно выявить у колоний Y. Pseudotuberculosis. В это время они мелкие (до 1 мм), полупрозрачные, серовато-желтого цвета, блестят при косом освещении. При малом увеличении видна выпуклая неровная поверхность колоний со слегка запавшим и смятым краем. По мере роста колонии иерсиний теряют отличительные признаки, а посторонняя микрофлора подавляет их рост. Для дальнейшего изучения подозрительные колонии, выросшие на плотных питательных средах, отсевают на скошенный столбик любой полиуглеводной среды с мочевиной. После инкубации пробирок при температуре +37оС на другой день для дальнейшего исследования на иерсинии отбирают только уреазоположительные культуры. При исследовании малозагрязненных посторонней микрофлорой субстратов (лимфатические узлы, паренхиматозные органы, аппендиксы и др.), наряду с методикой накопления производят посев суспензии нативного материала на плотную среду (среды Серова, Эндо, мясо-пептонный агар). Кровь в соотношении 10 частей крови на 100 частей питательной среды засевают в среды накопления (ФБР, БКД и т.д.) и инкубируют при 28 или 370С в течение 10 сут, периодически производя высевы на плотные питательные среды. Тесты окончательной идентификации иерсиний включают пробу с цельным поливалентным псевдотуберкулезным бактериофагом при температуре +280С методом стерильного пятна, ферментацию углеводов, теста на индолообразоване и образование сероводорода ( на среде Олькеницкого), отношение к аргинину, орнитину и лизину. Серологическую принадлежность выделенных культур спределяют в зависимости от наличия соответствующих видов типоспецифических сывороток. Этиологическое значение атипичных иерсинии должно быть подтверждено обнаружением серологических сдвигов в крови больных в реакции агглютинации с аутокультурой. Среди Y.еnterocolitica наряду с безусловно патогенными штаммами сероваров 03; 04,32; 05; 05,27; 06,30; 07,8; 08; 09 биоваров 1 и 1У, реже 1 и Ш, выделяется довольно много непатогенных иерсиний, поэтому определение патогенных свойств Y. еnterocolitica является обязательным. Наряду с такими важными признаками как кальцийзависимость, способность к аутоагглютинации, целесообразно проводить посев на среду CRMOX (Congo red magnesium oxalate). Патогенные Y. еnterocolitica на этой среде образуют колонии красного цвета, в то время как непатогенные иерсинии формирую более крупные и бесцветные колонии. Иммунологические методы следует разделить на иммуноиндикационные, направленные на обнаружение антигенов иерсиний в биосубстратах и объектах внешней среды, и (иммуно)серологические методы, направленные на выявление специфических антител (иммуноглобулинов различных классов) в сыворотке крови больных. Наиболее популярным методом обнаружения антигенов иерсиний является твердофазный метод иммуноферментного анализа (ИФА). Для выявления специфических антител в сыворотке крови и их динамики традиционно используют развернутую реакцию агглютинации (РА). Минимальный диагностический титр равен 1/160 – 1/200. Следует отметить, что РА выявляет антитела лишь со 2-й недели болезни, поэтому гораздо большее диагностическое значение имеет динамика титров антител. В то же время реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации – РНГА, выявляет антитела в гораздо ранние сроки, однако динамика увеличения титров антител здесь менее наглядна. Для дифференцировки специфического иммунного ответа, возникающего в острой фазе болезни, от имеющихся в сыворотке так называемых фоновых антител, наиболее целесообразно использовать ИФА для определения специфических иммуноглобулинов различных класов – М и G. Наличие IgM-антител свидетельствует об острой инфекции. Для аллергической диагностики иерсиниозов целесообразно использование таких диагностических аллергенов как псевдотуберкулин и энтероиерсин. Специфичекая профилактика иерсиниозов не разработана. Возбудители псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза проявляют высокую чувствительность к левомицетину и ампициллину. |