Перечень вопросов для подготовки к экзамену по дисциплине Основы молекулярной биомедицины
 Скачать 1.51 Mb.
|
|
Перечень вопросов для подготовки к экзамену по дисциплине «Основы молекулярной биомедицины» 1. Дайте определение дисциплине молекулярная биомедицина и укажите, ее основные разделы. Укажите цель дисциплины и перечислите основные задачи. Назовите основные приоритеты развития современной молекулярной медицины Дисциплина основы молекулярной медицины представляет собой фундаментальную основу для изучения механизмов развития патофизиологических процессов и их коррекции. Молекулярная медицина включает в себя три раздела: 1. Молекулярная диагностика, 2. Молекулярную профилактику. 3. Индивидуальная фармакотерапия (генная терапия). Данный курс включает в себя целостное теоретическое рассмотрение строения и функций включает в себя анализ молекул углеводов, белков, липидов, гетероциклических соединений, карбонильных соединений, биохимию нуклеиновых кислот, современные молекулярные методы, используемые для диагностики и исследования, метаболизм углеводов, пути передачи сигнала и элементарное биологическое окисление. Целью молекулярной медицины является выявление молекулярных основ этиологии и патогенеза как наследственных, так и других заболеваний, в обеспечении предсказания генетической предрасположенности к конкретным соматическим и онкологическим заболеваниям задолго до их возникновения. Основные задачи молекулярной биомедицины: • идентификация генома и метаболических путей, ответственных за заболевания, • изучение генома здоровых людей для предсказания предрасположенности здорового человека к различным заболеваниям, • разработка молекулярной классификации болезней, • определение индивидуальной лекарственной чувствительности Основные приоритеты развития молекулярной медицины • Технология «сравнительного взаимодействия», ее суть определить механизмы межклеточного взаимодействия. Обнаружить «каналы» взаимодействия и использовать эти знания в медицине. • Наномедицина – теоретически позволяет доставлять лекарства в живую клетку. • Эпигенетика – позволяет определить наличие онкологического заболевания на основе генетического теста. • «Диффузионное изображение» - позволяет использовать технологии сканирования головного мозга для диагностики и последующего лечения таких заболеваний как шизофрения, болезнь Альцгеймера и т.п. • «Нанобиомеханика» - рассматривает человеческое тело как машину и анализирует процессы механического взаимодействия отдельных клеток. 2. Раскройте сущность метода культивирования клеток, с какой целью он применяется. Культивирование клеток представляет собой метод, состоящий в выделении клеток и выращивании их in vitro, полученных из тканей или целых органов животных, микроорганизмов или растений. Культура клеток является одним из основных инструментов, используемых в клеточной и молекулярной биологии, обеспечивая превосходные модельные системы для изучения нормальной физиологии и биохимии клеток (например, изучение метаболизма, старение), воздействия лекарств и токсичных соединений на клетки, а также мутагенеза и канцерогенеза. 3. Опишите виды микроскопии, от чего зависит разрешающая способность микроскопа. Существует два принципиально различных типа микроскопов – световой микроскоп и электронный микроскоп. Разновидности световой микроскопии: Обычная световая микроскопия Ультрафиолетовая микроскопия Люминесцентная микроскопия Фазово-контрастная микроскопия Темнопольная микроскопия Интерференционная микроскопия Поляризационная микроскопия Разновидности электронной микроскопии • Трансмиссионная микроскопия • Сканирующая микроскопия: - растровая электронная микроскопия (отображает исследуемый объект за счет тонкого сфокусированного электронного пучка (зонда), который формируется и осуществляет сканирование при помощи колонны микроскопа.) - зондовая сканирующая микроскопия - атомно-силовая сканирующая микроскопия Разрешающая способность микроскопа является наиболее важной характеристикой оптической системы и определяет еѐ способность различать мелкие детали исследуемого образца. 4. Сущность метода ПЦР. ПЦР – полимеразная цепная реакция ПЦР используют для амплификации определенного фрагмента ДНК из сложной смеси исходного материала, обычно называемого ДНК-матрицей, и во многих случаях для ПЦР нет нужды в высокой степени очистки ДНК. 5. Объясните сущность и области применения метода секвенирования. Секвенирование биополимеров (белков и нуклеиновых кислот — ДНК и РНК) — определение их аминокислотной или нуклеотидной последовательности. В результате секвенирования получают формальное описание первичной структуры линейной макромолекулы в виде последовательности мономеров в текстовом виде. Размеры секвенируемых участков ДНК обычно не превышают 100 пар нуклеотидов и 1000 пар нуклеотидов при секвенировании по Сенгеру. В результате секвенирования перекрывающихся участков ДНК получают последовательности участков генов, целых генов, тотальной мРНК или полных геномов организмов. Для секвенирования нуклеиновых кислот применяют следующие методы: 1 Секвенирование по Сенгеру; 2 Пиросеквенирование; 3 Бисульфитный метод; 4 Метод Маскама и Гилберта (химический метод); 5 Секвенирование нового поколения (NGS); 6. Опишите сущность метода гибридизации и ДНК-зондов. Метод основан на специфическом взаимодействии (гибридизации) двух образцов ДНК: меченого ДНК-зонда и участка плазмидной или хромосомной ДНК. Образовавшиеся двухцепочечные ДНК отделяют от одноцепочечных и определяют присутствие метки. В качестве контроля используют ДНК известного штамма микроорганизма. Степень реассоциации таких гомологичных одноцепочечных ДНК принимают условно за 100 %. При 60- 100 % гомологии ДНК можно говорить о принадлежности сравниваемых бактерий к одному виду. Разработаны два способа гибридизации: в растворе или с использованием нерастворимого носителя. Гибридизация на носителях применяется значительно шире: анализируемый образец связывается с нитроцеллюлозным или нейлоновым фильтром. Существует несколько разных методов мечения комплекса между зондом и ДНК-мишенью. Традиционным способом является радиоактивное мечение зонда с помощью введения в ДНК радиоактивных изотопов 33Р, 32Р, 35S. После гибридизации образцы-мишени выявляют с помощью радиоавтографии. Этот метод обладает высокой чувствительностью и позволяет обнаруживать около 1 пг ДНК. Недостаток радиоактивных зондов — их нестабильность из-за непродолжительного времени жизни изотопов (32Р — 14,5 сут) и быстрого радиолиза зонда. Использование изотопов с более продолжительным периодом полураспада приводит к снижению чувствительности и удлиняет время, необходимое для радиоавтографии. Кроме того, для работы с изотопами необходимы специально оснащенные лаборатории. Наиболее широко используют нерадиоактивное мечение. Для нерадиохимической детекции применяют методы, основанные на присоединении к зондам остатков биотина. Метод обладает более низкой чувствительностью, чем радиохимический. Повысить чувствительность можно, увеличив число остатков биотина, введенных в зонды. Метод дот-гибридизации. В случаях, когда необходимо установить наличие или отсутствие в ДНК выявляемой последовательности, применяют метод дот-гибридизации. В этом случае очищенную денатурированную ДНК наносят непосредственно на фильтр, иммобилизуют, гибридизируют с зондом и регистрируют на автографах положительные сигналы. Методы ДНК (или РНК)-зондов основаны на реакции гибридизации нуклеиновых кислот — способности односпиральных комплементарных цепей ДНК или РНК формировать двуспиральные структуры. Реакция может протекать между комплементарными молекулами вида: ДНК + ДНК, ДНК + РНК, РНК + РНК. Методы ДНК-зондов сводятся к следующему: - Получение односпирального фрагмента ДНК определенного вируса и его метки — это ДНК-зонд; - выделение из исследуемого материала нуклеиновых кислот и их денатурация; - контакт образовавшихся односпиральных молекул ДНК (или РНК) с ДНК- зондом при 55—65 °С, приводящих к образованию двуспиральных молекул (гибридизация) в случаях их взаимной комплементарности; - удаление всех негибридизированных односпиральных молекул нуклеиновых кислот (отмывают или добавляют нуклеазы); - обнаружение (по метке) образовавшихся двуспиральных молекул нуклеиновых кислот, которые и будут указывать на наличие в исследуемом материале того вируса, на который был получен ДНК-зонд. Если использовали радиоактивный зонд, то результаты учитывают методом авторадиографии или путем подсчета импульсов в счетчике. Методы ДНК (РНК)-зондов из диагностической практики постепенно вытесняются новым методом — полимеразной цепной реакцией. 7. Дайте определение и опишите принцип метода клонирования генов. Клонирование генов – это процедура, включающая выделение и амплификацию отдельных генов в реципиентных клетках, про- и эукариотических. Эти клетки, содержащие нужный ген, можно использовать для получения: а) большого количества белка, кодируемого данным геном; б) большого количества самого гена в высокоочищенном виде. Процесс клонирования генов включает в себя несколько стадий: 1. Получение необходимого гена: а) путем расщепления геномной ДНК с помощью рестриктаз (эндонуклеазы, расщепляющие молекулу ДНК в строго определенном месте); б) путем химического синтеза только небольших фрагментов ДНК (так как зная последовательность аминокислотных остатков в белковой молекуле, можно всегда определить последовательность нуклеотидов в фрагменте ДНК, кодирующем данный белок, в соответствии с генетическим кодом). Так, путем химического синтеза был получен ген, ответственный за синтез соматостатина; в) из клеток организма выделяют молекулы иРНК и с помощью фермента обратной транскриптазы (РНК-зависимая ДНК-по-лимераза) снимают ДНК- копии необходимого гена. Например, из островных клеток поджелудочной железы были выделены иРНК, несущие информацию о синтезе инсулина. А из клеток, инфицированных вирусами, выделены и РНК, несущие информацию о синтезе интерферона. 2. Ввод выделенного или полученного фрагмента ДНК в состав векторной молекулы ДНК – получение рекомбинантной ДНК. Вектор – это нечто вроде молекулярного «такси», способного переносить чужую ДНК внутрь бактериальной клетки таким образом, чтобы она могла там реплицироваться. Существует два основных типа векторов: бактериальные плазмиды (чаще ответственные за устойчивость к двум и более антибиотикам) и умеренные дефектные (способные к осуществлению трансдукции) бактериофаги. Плазмиду расщепляют с помощью рестриктазы в сторого определенном месте. После расщепления ее концы, как и концы выделенной для клонирования ДНК, с помощью концевой трансферазы «доращивают» так, чтобы концевые участки плазмиды были комплементарны встраиваемой ДНК (или еще говорят «липкими»). Далее, благодаря взаимодействию «липких» последовательностей и с помощью специальных ферментов ДНК- лигаз осуществляют сшивку (лигирование) ДНК-вставки и плазмидной ДНК. Полученная в результате новая кольцевая молекула ДНК называется уже рекомбинантной ДНК. 3.Ввод рекомбинантной ДНК в состав клетки-реципиента. Клетки, выбранные для клонирования генов могут быть как про-, так и эукариотическими. Чаще всего для этой цели используют бактерии, поскольку их культивирование не представляет большой проблемы (E. coli, В. subtilis и др.). Но если ген выделен по методике 1, то его необходимо клонировать в клетках эукариотов, например, дрожжей. Ввод рекомбинантной ДНК осуществляют путем трансформации (проницаемость клеточной стенки бактерий увеличивается в разбавленном растворе хлористого кальция) или трансдукции (в случае использования в качестве вектора бактериофага). 4.Отбор трансформированных клеток. Поскольку не все бактериальные клетки в реакционной смеси будут трансформированы, необходимо произвести отбор клеток, содержащих рекомбинантные бактерии. Отбор обычно основан на том, что плазмиды обеспечивают резистентность к тем или иным антибиотикам, а, следовательно, бактерии, содержащие плазмиды, будут размножаться в присутствии соответствующего антибиотика. 5. Культивирование трансформированных клеток. Культивирование отобранных клеток необходимо для наращивания биомассы с целью амплификации генов в клетках-реципиентах. 6. Выделение белкового продукта гена или выделение встроенной ДНК из очищенных плазмид. 8. Перечислите методы иммунохимического анализа и укажите их преимущества перед другими методами. Наиболее известными методами иммунохимического анализа являются: Иммуноферментный анализ с колориметрической детекцией; Иммуноферментный анализ с хемилюминесцентной детекцией; Иммуноферментный анализ с флуоресцентной детекцией; Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ; Электрохимический иммуноанализ; Проточно-инжекционный анализ; Иммуноанализ с использованием каппилярного электрофореза; Тест-системы на основе иммуноафинных колонок; Имуунохроматографический анализ; Метод «Bar-code»; Мультопараметрический «сендвич»-анализ Иммуноферментный и другие варианты иммуноанализа основаны на взаимодействии антигена с антителом, то есть реакции антигенных детерминант с антигенсвязывающим фрагментом антител. При сравнении иммунохимического анализа, основанного на реакции антиген–антитело, с другими аналитическими методами целесообразно отметить ряд преимуществ иммуноаналитических методов: - обнаружение целевого аналита, либо группы сходных по структуре соединений в широком диапазоне определяемых концентраций; - невысокая стоимость одного анализа; - возможность использования для быстрого скрининга за счет одновременного анализа нескольких проб; - экономическая эффективность методов; - быстрота и простота анализа и, следовательно, высокая производительность; - отсутствие высокотехнологичного оборудования; - невысокие требования к квалификации оператора, возможность быстрого обучения; - возможность использования во внелабораторных условиях, организации мониторинга в полевых условиях. 9. Назовите методы определения строения белков. Для определения первичной структуры белка прежде всего разделяют его полипептидные цепи, затем определяют аминокислотный состав цепей, N- и С-концевые аминокислотные остатки и последовательность аминокислот. Полипептидные цепи подвергают специфическому расщеплению протеолитическими ферментами (например, трипсином, который гидролизует связи по остаткам лизина и аргинина, или протеазой из Staphylococcus aureus, гидролизующей связи по остаткам глутаминовой кислоты) или химическими реагентами (например, бромцианом, расщепляющим связи, образованные остатками метионина, гидроксиламином – между остатками аспарагина и глицина). Смесь образовавшихся фрагментов разделяют и для каждого из них определяют аминокислотную последовательность. Основным методом исследования аминокислотной последовательности пептидов и белков является их деградация с помощью фенилизотиоцианата (метод Эдмана); при происходит последовательное отщепление N-концевых аминокислотных остатков в виде фенилтиогидантоинов, которые поглощают свет в УФ-области с максимумом поглощения 265–270 нм. С помощью специального прибора – секвенатора – удаётся осуществить автоматическое отщепление и идентификацию фенилтиогидантоинов. Для этих же целей применяют масс-спектрометрию. В последние годы для установления первичной структуры белков в основном пользуются данными о последовательности нуклеотидов в их структурных генах. Для определения содержания канонических элементов вторичной структуры в белках используют методы кругового дихроизма и дисперсии оптического вращения. О пространственном расположении атомов в молекуле белка судят на основании рентгеноструктурного анализа его кристаллов. С помощью дифференциальной спектроскопии, спектроскопии комбинационного рассеяния и флуоресценции изучают изменение конформации белка в процессе функционирования или при изменении внешних условий. Прямую информацию о пространственном строении белка в растворе даёт метод ядерно-магнитного резонанса. 10. Объясните сущность масс-спектрометрических методов анализа. Масс-спектрометрия – один из самых востребованных методов физико- химического анализа, который предполагает перевод молекул исследуемых компонентов анализируемого образца в ионизированное состояние, последующее эффективное разделение образовавшихся как положительных, так и отрицательных ионов и их надежную регистрацию. 11. Объясните сущность и укажите разновидности хроматографических методов анализа. Основные методы хроматографии, применяемые в молекулярной медицине Эксклюзионная (ситовая) хроматография Ионообменная хроматография Тонкослойная хроматография Газовая хроматография Газовая хроматография используется во многих областях медицины и биологии: в гигиене и экологии для определения содержания вредных примесей в воздухе, воде и пищевых продуктах; в токсикологии и судебной медицине для диагностики отравлений техническими жидкостями (хлорпроизводными углеводородов, алкоголем и его суррогатами) и пестицидами самой различной структуры; в фармакологии и фармации для контроля качества препаратов, исследования метаболизма лекарственных средств. Жидкостная хроматография в медицине и биологии Современные методы ВЭЖХ позволяют анализировать как смеси ионов или молекул, так и смеси ферментов, белков и даже вирусов. ВЭЖХ обладает высокой эффективностью колонок и селективностью разделения, хроматографическое разделение проводится в мягких условиях (низкая температура, инертный растворитель, отсутствие контакта с кислородом), что очень важно при анализе термически и химически неустойчивых биологически активных соединений. Аффинная хроматография Аффинная хроматография представляет собой один из наиболее специфических методов выделения реакционноспособных соединений, в частности, ферментов, и даже таких надмолекулярных агрегатов, как вирусы. Эксклюзионная хроматография Эксклюзионная (ситовая) хроматография – метод, основанный на различной способности молекул разного размера проникать в поры нейтрального геля или пористого тела, которые служат неподвижной фазой. Метод, в котором неподвижной фазой служит гель, называется гель-проникающей хроматографией. Ионообменная хроматография Этот вариант жидкостной хроматографии основан на способности разделяемых ионов в растворе к ионному обмену с ионитом, который представляет собой нерастворимую полимерную матрицу, несущую химически связанные ионогенные группы. Противоионы удерживаются на матрице за счет сил электростатического взаимодействия и могут обмениваться на ионы разделяемой смеси, присутствующие в подвижной фазе. Тонкослойная хроматография В методе ТСХ хроматографирование веществ происходит в тонком слое сорбента (оксид алюминия) нанесенного на твердую плоскую подложку их алюминия или полимера (хроматографическая пластинка). Разделение в этом методе происходит на основе сорбции-десорбции. ТСХ в качестве подвижной фазы использует либо чистые вещества (этилацетат, бензол, этанол), либо смеси веществ в определенном соотношении. |