Микробиология(Закарян). Первая. Общая микробиология. Глава место микроорганизмов среди
 Скачать 2.06 Mb.
|
|
ЧАСТЬ ВТОРАЯ ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Лабораторная диагностика инфекционных заболеваний проводится по следующим направлениям: 1) обнаружение возбудителя заболевания в патологическом материале; 2) обнаружение специфических антител в сыворотке крови больного (серологическая диагностика); 3) выявление у больного повышенной чувствительности к возбудителю с помощью аллергических проб. Обнаружение и идентификацию возбудителя заболевания проводят, используя микроскопический, микробиологический и биологический методы. Микроскопический метод используется для обнаружения возбудителя непосредственно в патологическом материале. Может применяться как самостоятельный метод в отношении некоторых микроорганизмов с характерной морфологией. С помощью микроскопического метода можно сделать заключение при обнаружении гонококков в гное, менингококков в спинномозговой жидкости, палочек туберкулеза, а также простейших: плазмодиев малярии, лейшманий, дизентерийной амебы. Микроскопия применяется как обязательный этап исследования при микробиологическом методе. Микробиологический метод применяется для выделения чистой культуры микробов и их идентификации по ряду признаков: морфологии, способности окрашиваться красителями (тинкториальные свойства), характеру роста на питательных средах (культуральные свойства), ферментации углеводов, белков и других веществ (биохимические свойства) и по антигенной структуре. Для эпидемиологического анализа проводят внутривидовую идентификацию - определение серовара, фа-говара, биовара. С целью назначения рациональной антибиотикоте-рапии определяют чувствительность выделенной культуры к антибиотикам. Для экспресс-диагностики применяют РИФ со специфическими сыворотками. Метод позволяет выявить возбудителя в исследуемом материале в течение нескольких часов. В последнее время для идентификации микробов применяют методы, основанные на исследовании состава ДНК. Для этого существует несколько методов. 1) Определение процентного соотношения гуанин + цитозин/ аденин + тимин (Г+Ц/А+Т) (см. главу 4). 2) Определение последовательности нуклеотидов в ДНК микроба. С этой целью путем нагревания вызывают разделение ДНК на две нити, добавляют ДНК-зонд - участок известной ДНК, меченный радиоактивной меткой, или ферментом, или биотином. ДНК-зонд присоединяется к од- ной из нитей исследуемой ДНК, если он комплементарен, то есть соответствует ей. Присоединение обнаруживается по наличию метки. 3) Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет увеличить количество исследуемой ДНК с помощью фермента полимеразы и таким образом обнаружить даже небольшие количества ДНК. Биологический метод заключается в заражении животных исследуемым материалом с последующим выделением чистой культуры или в обнаружении токсина и определения его вида и типа. Серологические методы направлены на выявление специфических антител в сыворотке крови пациента. Для этого используют реакции иммунитета. С целью выявления динамики нарастания титра антител исследуют парные сыворотки, полученные от пациента в начале болезни и через 1-3 недели. Аллергический метод применяется для выявления повышенной чувствительности к возбудителю путем постановки внутрикожных проб с аллергеном. Взятие материала на исследование и пересылка его в лабораторию. Результат микробиологического исследования во многом зависит от правильного взятия и пересылки материала в лабораторию. Выбор материала зависит от характера заболевания и локализации патологического процесса. Исследуют мокроту, гной, испражнения, мочу, кровь и др. Материал следует брать до лечения антибиотиками, в достаточном количестве, в стерильную посуду, с соблюдением приемов, обеспечивающих стерильность. Посуда и инструменты для взятия материала не должны содержать следов дезинфицирующих веществ. Испражнения собирают в стерильные картонные тарелки; используют также судна, обработанные дезинфицирующим раствором и тщательно промытые горячей водой. Мочу берут стерильным катетером. Рвотные массы собирают в стерильные банки, мокроту в стерильные банки с пробкой или в чашки Петри. Гнойное отделяемое ран берут стерильным ватным тампоном или исследуют тампоны, извлеченные из ран при перевязках. Соскобы со слизистых оболочек зева и носа - стерильным ватным тампоном на проволоке. Специальные приемы используются при коклюше (метод кашле-вых пластинок), при исследовании на менингококковое носительство (носоглоточный тампон). Материал для исследования на неспорообразующие анаэробы при взятии и пересылке тщательно оберегают от соприкосновения с воздухом. Кровь для посева берут с соблюдением правил асептики, предварительно протерев кожу 70% спиртом, стерильным шприцем из локтевой вены в количестве 5-10 мл и сразу же засевают во флакон с жидкой питательной средой, количество которой должно быть в 10 раз дырка эпидермальный и S. saprophyticus - сапрофитный стафиркокк. Заболевания чаще вызывают золотистые, реже - эпидермальные, еще реже - сапрофитные стафилококки. Морфология, культуральные, биохимические свойства. Стафилококки имеют шаровидную форму, в чистой культуре располагаются в виде гроздьев винограда, в мазках из гноя располагаютсяя поодиночке, попарно, небольшими скоплениями (цветная вклейка рис. 25). Факуль- тативные анаэробы, лучше растут в аэробных условиях, при рН 7,2-7,8, на простых питательных средах. Оптимальная температура для роста 37 о С. В жидких питательных средах образуют равномерное помутнение, на плотных средах образуют гладкие, выпуклые, блестящие, с ровными краями колонии. Благодаря образованию пигмента колонии могут быть золотистого, палевого, лимонно-желтого, белого цвета. Пигментообразование лучше всего выражено на средах с добавлением молока. Стафилококки могут размножаться на средах с большим количеством (8-10%) хлорида натрия, поэтому солевые среды применяются в качестве элективных: молочно-солевой агар, желточно-солевой агар. Стафилококки сбраживают углеводы с образованием кислоты без газа, обладают протеолитическими свойствами. S. aureus отличаются от двух других видов тем, что продуцируют фермент, вызывающий свертывание плазмы крови (плазмокоагулазу), ферментируют маннит в ана- эробных условиях, продуцируют токсины и ферменты патогенности (табл. 4). Наличие пигмента не является таксономическим признаком. Антигены. Стафилококки содержат целый ряд полисахаридных и белковых антигенов. Классификация по антигенной структуре не получила практического применения. Фаговары. По чувствительности к типовым бактериофагам стафилококки делятся на фаговары. Фаготипирование проводится с помощью международного набора бактериофагов. Токсинообразование. Патогенные стафилококки продуцируют экзотоксины. Гемолизины вызывают гемолиз эритроцитов разных видов животных и человека. Основным из них является альфа-гемолизин, на основе которого приготовлен стафилококковый анатоксин. Стафилококки, продуцирующие гемолизин, образуют на кровяном агаре колонии, окруженные бесцветной зоной гемолиза. Лейкоцидины разрушают лейкоциты. Эксфолиатины вызывают пузырчатку новорожденных, отслойку эпителия кожи с образованием пузырей, "синдром ошпаренной кожи". Обнаружен токсин, вызывающий токсический шок (ТТШ). Энтеротоксины, вызывающие пищевую интоксикацию, в отличие от других экзотоксинов, термостабильны, не разрушаются при кипячении. Ферменты, обладающие патогенным действием: гиалуронидаза, лецитиназа, плазмокоагулаза. Стафилококки, устойчивые к пенициллину и другим b-лактамным антибиотикам, продуцируют b-лактамазу. дырка ях, при постоянной циркуляции стафилококков среди больных могут формироваться так называемые "госпитальные" стафилококки определенных фаготипов, высоковирулентные, обладающие множественной лекарственной устойчивостью, нечувствительные к дезинфицирующим средствам. Особенно большое значение в возникновении внутрибольничных инфекций имеют стафилококки, устойчивые к пенициллину, метициллину. Заболевания у человека. Стафилококковые заболевания чаще возникают в результате заражения извне, реже - как эндогенная инфекция. Стафилококки, главным образом, S. epidermidis, являются представителями нормальной микрофлоры кожи человека, дыхательных путей и пищеварительного тракта. У здоровых людей довольно часто встречается носительство S. aureus, главным образом, на слизистой оболочке носа. Установлено, что только небольшая часть людей постоянно свободна от золотистого стафилококка. У большинства они обнаруживаются периодически, часть людей являются постоянными бактерионосителями. Имеется категория носителей, у которых постоянно и в большом количестве обитают S. aureus с признаками "госпитальных" штаммов. Такие носители, особенно среди медицинского персонала, а также больные со стафилококковыми заболеваниями, являются основным источником стафилококковых инфекций в больницах. Инфекция передается, главным образом, контактным путем или через воздух. Стафилококки вызывают разнообразные гнойно-воспалительные заболевания: гнойничковые поражения кожи и подкожной клетчатки, ангины, отиты, пневмонии, уретриты, холециститы, энтероколиты, сепсис и т.д. Особенно велика их роль в акушерской практике и в хирургии. Стафилококки нередко являются причиной гнойно-воспалительных заболеваний у новорожденных, маститов у рожениц, гнойных послеоперационных осложнений, постинъекционных абсцессов. Возбудителями чаще всего являются S. aureus. S. epidermidis вызывает заболевания такие, как инфекционный эндокардит и другие, главным образом, у ослабленных больных, в отделениях интенсивной терапии, где заражение может происходить через системы для внутрисосудистых вливаний, различные катетеры из полимерных соединений. S. saprophyticus являются частой причиной острых инфекций мочевыводящих путей у молодых женщин. Особое место занимают пищевые интоксикации, возникающие в результате употребления в пищу продуктов (чаще всего молочных и сладких блюд), в которых произошло размножение стафилококков и накопление энтеротоксина. Этот токсин термоустойчив, и даже после термической обработки продукты, содержащие энтеротоксин, могут вызвать пищевое отравление. Стафилококки могут явиться причиной токсического шока. Впер- вые вспышка этого синдрома возникла в США в 1983 году, у женщин, пользующихся во время менструации гигроскопичными гигиеническими тампонами. У заболевших наблюдалось повышение температуры тела, гиперемия слизистых оболочек, боли в мышцах, кожная сыпь с шелу- шением, падение кровяного давления. Заболевание возникало только при использовании тампонов, выпускаемых одной из фирм. БЫЛО установлено, что случаи токсического шока возникали вследствие ряда причин: тампоны содержали карбоксиметилцеллюлозу с глюкозой и соединениями натрия, обладали сунерадсорбирующимп свойствами, поэтому чрезмерно высушивали слизистую оболочку и травмировали ее; при инфицировании стафилококками происходило их быстрое раз- множение в благоприятной среде, чему способствовало присутствие натрия в составе тампона. После запрета на продажу продукции этой фирмы вспышка прекратилась. В дальнейшем токсический шок наблюдался у хирургических больных, особенно при использовании гигрос- копичных перевязочных материалов определенных сортов. Было установлено, что токсический шок вызывают стафилококки, продуцирующие экзотоксин, названный токсином токсического шока (ТТШ). Иммунитет. Человек обладает в некоторой степени врожденной устойчивостью к стафилококкам благодаря защитным свойствам кожи, фагоцитозу, наличию нормальных антител. После перенесенного заболевания иммунитет непродолжительный. Характерна склонность к рецидивам. Восприимчивость к стафилококковой инфекции возрастает при травмах, диабете, действии ионизирующих излучений. Стафилококковые заболевания не относятся к острозаразным, больных лечат не в клиниках инфекционных болезней, а в других отделениях больниц. Лабораторная диагностика. Материалом для исследования являются гной, слизь из зева и носа, мокрота, кровь, испражнения, моча; при пищевых отравлениях - рвотные массы, промывные воды желудка, пищевые продукты. Микроскопия мазка из исследуемого материала позволяет обнаружить грамположительные кокки и отметить их количество. Для выделения чистой культуры производят посевы на элективные для стафилококка среды (молочно-солевой или желточно-солевой агар) и среды для стрептококка (кровяной агар). В случае, если выделена чистая культура стафилококка, определяют видовую принадлежность по признакам: плазмокоагулаза, анаэробное сбраживание и аэробное окисление глюкозы и маннита, гемолиз на кровяном агаре, наличие лецити-назы, ДНК-азы. Определяют чувствительность к антибиотикам. В целях эпидемиологического анализа проводят фаготипирование. При пищевых отравлениях определяют наличие энтеротоксина в пищевом продукте с помощью специфических антисывороток или биопробы на котятах. Профилактические и лечебные препараты. Стафилококковый анатоксин нативный, применяется для активной иммунизации с целью лечения при хронических заболеваниях. Стафилококковый анатоксин очищенный адсорбированный прменяется, главным образом, для про- филактики. Иммуноглобулин человеческий противостафилококковый содержит стафилококковый антитоксин, приготовлен из крови доноров, иммунизированных стафилококковым анатоксином. Применяется для создания пассивного иммунитета с целью лечения. Стафилококковый антифагин (вакцина) - для создания активного иммунитета с целью лечения. Стафилококковый бактериофаг жидкий. Применяется наружно, внутрикожно, внутримышечно для лечения. Стрептококки. Стрептококки впервые были обнаружены Т. Бильротом в 1874 г. при рожистом воспалении и Л. Пастером в 1879 г. при гнойных заболеваниях и сепсисе. Выделены в чистой культуре Ф. Розенбахом в 1894 г. В медицине наиболее важное значение имеют: Streptococcus pyogenes (пиогенный стрептококк), S. pneumoniae (пневмококк), S. faecalis (энтерококк). Пиогенные (гноеродные) стрептококки Морофология, культуральные, биохимические свойства. Клетки стрептококков имеют шаровидную или овальную форму, размеры 0,5-1 мкм. Располагаются цепочками. Спор не образуют, жгутиков не имеют, в организме иногда образуют микрокапсулу, грамположительны (цветная вклейка рис. 26). Факультативные анаэробы. На простых питательных средах растут плохо. Культивируют в сахарном бульоне и на кровяном агаре, при рН 7,2-7,6, оптимальная температура роста для них 37°С. В сахарном бульоне образуют придонный и пристеночный рост, оставляя среду прозрачной, на плотных средах растут в виде мелких точечных колоний. По характеру роста на кровяном агаре различают стрептококки: р-гемолитические, образующие вокруг колоний бесцветную зону полного гемолиза; альфа-гемолитические, окруженные зеленоватой зоной вследствие превращения гемоглобина в метгемоглобин; гамма- стрептококки - не-гемолитические. Антигены. По полисахаридному С-антигену клеточной стенки стрептококки разделяют на 20 серологических групп, обозначаемых латинскими буквами от А до V. Заболевания человека чаще вызывают стрептококки группы А. Внутри серогрупп стрептококки разделяют на серовары по белковым антигенам М, Р и Т. Серовары обозначают цифрами. Антигенами являются также экзотоксины и ферменты, выделяемые стрептококками. Токсинообразование, факторы патогенности. Стрептококки продуцируют несколько экзотоксинов. 1) Гемолизины (стрептолизины): О-стрептолизин - белок, антиген, но антитела к нему не обладают защитным действием; S-стрептолизин - небелковый токсин, не является антигеном, повреждает лейкоциты. 2) Эритрогенин А - скарлатинозный, термолабильный, вызывает явления, характерные для начального этапа скарлатины. Продукцию этого токсина кодирует профаг (геном умеренного фага). Токсин белковой природы, антиген. Эритрогенпн А стрептококков всех сероваров одинаков в антигенном отношении. Антитела к нему (антитоксины) обладают защитными свойствами. 3) Эритрогенин S, термостабильный - аллерген, вызывает реакцию ги- перчувствительности замедленного типа. Ферменты, оказывающие патогенное действие: гпалуронидаза способоствует распространению в организме; стрептокнназа (фибринолизин) разрушает фибрин, выпадающий в очаге воспаления, и таким образом способствует генерализации процесса. Ферменты являются антигенами. На поверхности клеток стрептококков имеется М-протеин. обладающий антифагоцитарным действием. Устойчивость. В окружающей среде стрептококки менее устойчивы, чем стафилококки. На различных предметах, в пыли они сохраняются в течение нескольких дней, но утрачивают патогенность. Низкие температуры переносят хорошо. При 56°С погибают через 30 минут. Де- зинфицирующие средства в обычных концентрациях убивают стрептококки в течение 15 минут. Заболевания у человека. Во внешней среде стрептококки встречаются реже, чем стафилококки. В организме здорового человека стрептококки обнаруживаются в полости рта, в верхних дыхательных путях, на коже, в кишечнике. Заболевания могут возникать в результате аутоинфекции, особенно у людей с ослабленным иммунитетом, или при заражении извне (экзогенная инфекция). Источником заражения являются больные люди и бактерионосители, путь заражения - воздушно-капельный или контактный. Стрептококки вызывают разнообразные заболевания. Это ангина, хронический тонзиллит, рожистое воспаление кожи, скарлатина, гнойные поражения кожи и подкожной клетчатки, нефрит, ревматизм, гнойный отит, септический процесс. Стрептококки могут быть причиной вторичной инфекции при гриппе, кори, коклюше, дифтерии, при острых респираторных вирусных инфекциях. Не было обнаружено различий между стрептококками, вызывающими такие разные по клинической картине заболевания. Только в отношении скарлатины известно, что эту болезнь вызывают стрептококки группы А, продуцирующие эритрогенин. Иммунитет. Невосприимчивость после перенесенных стрептококковых заболеваний (кроме скарлатины) очень слабая. Во время болезни образуются антитела, но защитного значения они не имеют, так как антитоксический иммунитет (антитела против эритрогенина А) защищает только от скарлатины, а антимикробный иммунитет (против белка М) является типоспецифическим. Напротив, у людей, перенесших стрептококковую инфекцию, развивается повышенная чувстви- тельность к возбудителю и в результате - склонность к рецидивам и повторным стрептококковым заболеваниям: повторные ангины, рожистое воспаление, хронический тонзиллит, нефрит, ревматизм. В развитии ревматизма имеют значение явления аутоиммунитета - образование антител к собственным тканям организма. Имеет значение также сохранение в организме L-форм стрептококков. |