Микробиология. практикум микробиология ворд. Практикум министерство науки и высшего образования российской федерации

• Название: Практикум министерство науки и высшего образования российской федерации
• Анкор: Микробиология
• Дата: 03.02.2022
• Размер: 3.98 Mb.
• Имя файла: практикум микробиология ворд.docx
• Тип: Практикум; #350290
• страница: 18 из 23

Лабораторная работа № 15

Трансформация компетентных клеток E.coli

плазмидной ДНК

Основные теоретические положения

Трансформация – один из трех возможных способов обмена ДНК между бактериями, в том числе различных видов. Как уже из- вестно, трансформации могут подвергаться только компетентные клетки. Изначально плазмида должна адсорбироваться на клетке. Адсорбция совершается на специальные поверхностные рецепто- ры, где ДНК связывается с белками и за счет них проникает в клет- ку. В этом процессе одна нить ДНК необратимо разрушается бел- ками за счет нуклеазной активности, а вторая нить проникает в клетку. От внутриклеточных нуклеаз однонитевую ДНК защища- ют специальные белки, они же обеспечивают контакт ДНК и хромо- сомной ДНК и рекомбинации с ней. Так происходит при транс- формации хромосомной ДНК.

При трансформации ДНК плазмидной разница лишь в том, что плазмида не интегрируется в основной геном бактериальной клетки.

Цель работы: придать бактериальным клеткам новое свой- ство – устойчивость к антибиотику посредством трансформи- рования компетентных клеток плазмидой с геном устойчивости к антибиотику.

Оборудование и реактивы

1. 
   Стерильные чашки Петри, микробиологические пипетки, шпатель Дригальского.
   
2. 
   Среда LB.
   
3. 
   Антибиотики тетрациклин и ампициллин.
   
4. 
   Аликвота компетентных клеток E.coli.
   
5. 
   Плазмидная ДНК.
   

Ход работы

1. 
   Подготовить стерильные чашки с агаризованной средой, содержащей антибиотики ампициллин (конечная концентрация 100 мкг/мл) и тетрациклин (конечная концентрация 12,5 мкг/мл).
   
2. 
   Разморозить на льду компетентные клетки E.coli.
   
3. 
   1 мкл плазмидной ДНК развести в 20 мкл дистиллированной воды и смешать с компетентными клетками.
   
4. 
   Выдержать смесь на льду в течение 30 мин.
   
5. 
   Поместить клетки с ДНК в термостат на 42 °С на 2 мин. (теп- ловой шок).
   
6. 
   Добавить 1 мл среды LB и выдержать клетки 60 мин. в термо- стате на 37 °С. Через каждые 15 мин. перемешивать клетки.
   
7. 
   Центрифугировать суспензию клеток 30 сек. при 5000 об/мин.
   
8. 
   Слить половину надосадочной жидкости, а вторую половину использовать для ресуспендирования бактерий.
   
9. 
   Отобрать микропипеткой 100 мкл клеток, смешанных с плаз- мидной ДНК, и втирать в чашки Петри с агаром (круговыми движе- ниями до полного впитывания жидкости).
   
10. 
    Инкубировать в течение суток в термостате при 37 °С.
    
11. 
    На следующий день провести подсчет числа выросших коло- ний. Убедиться, что бактерии приобрели устойчивость к ампицил- лину. Ген данного признака закодирован на плазмидной ДНК.
    

Вопросы для самоподготовки

1. 
   Что представляет собой плазмида? Какие части в ней выделяют?
   
2. 
   Назовите основные этапы трансформации клеток, дайте им био- логическое объяснение.
   
3. 
   Для чего в промышленности применяют генетическую трансфор- мацию бактерий? Приведите примеры биотехнологических производств.
   
4. 
   Где могут быть локализованы гены резистентности к антибиоти- кам? Где в приведенном примере находились гены резистентности к тет- рациклину и к ампициллину? Какое значение это имеет в биотехнологии и медицине?