Микробиология. практикум микробиология ворд. Практикум министерство науки и высшего образования российской федерации
 Скачать 3.98 Mb.
|
Лабораторная работа № 13Рестрикция плазмидной ДНКОсновные теоретические положенияСреди ферментов, используемых в генной инженерии и моле- кулярной биологии, большое значение имеют эндонуклеазы ре- стрикции – рестриктазы. Эти ферменты, впервые открытые как часть системы рестрикции – модификации ДНК у бактерий, специ- фически гидролизуют молекулы двуцепочечных ДНК при наличии в них определенных последовательностей нуклеотидов. Названия рестриктаз складываются из первых букв видовых названий бак- терий, в которых они обнаружены, например Eco– E.coli. Цифры, следующие за буквенными обозначениями, отражают последова- тельность открытия соответствующих рестриктаз в клетках бакте- рий одного вида, например HaeI, HaeII и HaeIII из Haemophilusinfluenzaebiogroupaegyptius. Все рестриктазы делят на три класса. РестриктазыIклассаиспользуют несимметричные сайты узна- вания и расщепляют ДНК в произвольных местах в пределах от нескольких сотен до нескольких тысяч пар нуклеотидов от сай- та узнавания. На практике данные классы рестриктаз практичес- ки не используется, так как получаемые фрагменты ДНК случайны. У рестриктазIIклассасовпадают сайты узнавания и расщеп- ления, и эти ферменты чаще всего используется в молекулярной генетике. Эти рестриктазы узнают палиндромные последователь- ности. Результат работы подобных рестриктаз предсказуем и под- дается анализу. РестриктазыIIIпромежуточноготипаузнают сайт рестрик- ции и разрезают ДНК, отступив от него на определенное количе- ство пар нуклеотидов. Большинство рестриктаз специфически узнают на ДНК тетра- и гексануклеотидные последовательности, называемые сайтамирестрикции. В большинстве случаев гидролиз молекулы ДНК про- исходит на сайтах рестрикции с образованием так называемых «лип- ких концов» (рис. 19). Это очень важно, так как подобные «липкие концы» могут самостоятельно или с помощью ферментов лигаз сшиваться между собой. Используется это в молекулярной биоло- гии для встраивания нужных генов в нужную плазмиду, если и учас- ток ДНК с этим геном, и плазмида были обработаны одной и той же рестриктазой.  Рис. 19. Сайт рестрикции EcoRIЧем короче олигонуклеотидная последовательность сайта рестрикции, узнаваемого рестриктазой, тем чаще он встречается в случайной последовательности нуклеотидов. Для большинства сайтов, узнаваемых рестриктазами, характерно наличие в них сим- метрии, то есть узнаваемые ими последовательности представляют собой палиндромы, например у рестриктазы EcoRI – 5'-GAATTC-3'. Поскольку такие участки комплементарны сами себе и друг другу и могут между собой взаимодействовать, их и называют «липкими концами». Как и любые другие ферменты, рестриктазы обладают опре- деленной активностью, которая зависит от множества факторов. Она измеряется в единицах активности: одна единица активнос- ти рестриктазы полностью гидролизует 1 мкг ДНК фага за 1 ч при температуре инкубации 37 °С. Для своей работы рестриктазам необходимы ионы Mg2+ и pH в определенных пределах. Такие усло- вия обеспечиваются буферными растворами на основе Tris–HCl, Tris-ацетата и т. д. Цель работы: изучить эндонуклеазы рестрикции и их роль в молекулярной биологии и биотехнологии, освоить методику ре- стрикционного анализа. Оборудование и реактивыПлазмидная ДНК. Рестриктазы. Буфер ( 10 буфер для рестриктазы EcoRI): 500мМ Tris–HCl, рН 7,5. Термостат. Микропробирки. Автоматические пипетки с наконечниками. Лед. Буфер для внесения с красителем бромфеноловым синим. Камера для горизонтального электрофореза с заливочным столиком. Источник постоянного тока. Электроплитка. Трансиллюминатор. Ход работыВ реакционную смесь добавить следующие компоненты: 3–7 мкл плазмидной ДНК (0,5–1 мкг); 2 мкл буфера для рестрикции (10-кратный); 1 мкл рестриктазы; Н20 до 20 мкл. Рестриктазу (как и любой другой фермент) следует хранить при –20 °С в морозильнике. Доставать ее оттуда необходимо строго перед добавлением в реакционную среду и в последнюю очередь и держать всегда во льду. После добавления сразу же убрать обрат- но морозильник. Реакцию рестрикции провести в объеме 20 мкл в течение 2–3 ч в термостате при температуре 37 °С. По окончании проведения рестрикции к реакционной смеси добавить краситель и провести анализ разделением образовавших- ся фрагментов в 1 % агарозном геле. В рабочей тетради отметить теоретические основы рестрик- ционного анализа, методику его проведения и полученные результаты. Вопросы для самоподготовкиЧто такое палиндром? Что такое «липкие концы»? На какие классы делятся рестриктазы? Чем они отличаются? Какое значение имеют в биотехнологии? Как в биотехнологиях используют рестриктазы? |