Микробиология. практикум микробиология ворд. Практикум министерство науки и высшего образования российской федерации
 Скачать 3.98 Mb.
|
Лабораторная работа № 14Получение компетентных клеток кишечной палочки химическим методомОсновные теоретические положенияПроцесс поглощения экзогенной ДНК бактериальными клет- ками, сопровождающийся приобретением ими новых генетичес- ких маркеров, называют генетическойтрансформацией. Это один из трех возможных способов естественной передачи ДНК от одной бактериальной клетки к другой. Поглощение ДНК бактериофагов называется трансфекцией фаговой ДНК. Поглощение плазмид- ной ДНК называется трансформацией. Трансформации и транс- фекции подвергаются только компетентные клетки. Компетент- ность – состояние бактериальных клеток, при котором они способ- ны сорбировать экзогенную ДНК на своей поверхности и погло- щать ее. Это происходит за счет наличия на поверхности бактери- альной клетки особых факторов компетенции. Экзогенная ДНК может быть интегрирована в бактериальную хромосому или су- ществовать в виде внехромосомного элемента. Для многих грамположительных бактерий компетентность является естественным свойством, которое становится максимально выраженным на определенных этапах роста культуры. У важных для генной инженерии грамотрицательных клеток E.coliестествен- ная компетентность отсутствует, и клетки приобретают ее лишь в искусственных условиях. Установлено, что при низких темпера- турах и в присутствии двухвалентных катионов экзогенная ДНК может с высокой эффективностью проникать внутрь бактериальных клеток. Частоту трансформации клеток E. coli можно повысить разными способами. Наиболее популярными являются тепловой шок, введение в инкубационную смесь одновалентных катионов (Rb+) или выращивание бактериальных клеток на среде с повышен- ным содержанием ионов Mg2+ (10–20 мМ). Современные методики трансформации бактериальных клеток позволяют получать до 107–108 трансформантов на 1 мкг плазмид- ной ДНК. Цель работы: освоить методику приготовления компетент- ных к генетической трансформации клеток. Оборудование и реактивыЖидкая среда LB для культивирования E.coli. Антибиотик тетрациклин. Буфер 1: 50 мМ CaCl2, 10 мМ Tris-HCl pH 8,0. Буфер 2: 10 мМ KCl, 75 мМ CaCl2, 15 % глицерин. Чашка Петри с культурой E. coli(штамм XLI-blueили другие). Стерильные конические колбы и пробирки. 7 Стерильные пипетки, микробиологические петли. Шейкер-инкубатор. Центрифуга с охлаждением. Ход работыЗасеять на ночь культуру E.coliв пробирку с 5 мл среды LB, содержащей антибиотик тетрациклин в концентрации 15 мкг/мл. Утром перенести 1 мл ночной культуры в колбу объемом 100 мл с 20 мл среды LB c тетрациклином. Наращивать в течение 2 ч при 37 °С на шейкере до оптической плотности, равной 0,3 (при = 600 нм). Перенести в пластиковую пробирку (типа Falcon), уравнове- сить и отцентрифугировать при 2500 об./мин. 10 мин. в центрифуге с охлаждением. Слить супернатант, перевернуть пробирку на фильтроваль- ную бумагу и дать стечь остаткам среды. Поместить пробирку с клетками в стакан со льдом. Аккурат- но ресуспендировать клетки в 10 мл охлажденного буфера 1. Центрифугировать 5–7 мин. при 2500 об/мин. на центрифуге с охлаждением. Слить надосадочную жидкость. Поместить пробирку на ледя- ную баню и добавить 2 мл охлажденного буфера 2. Расфасовать приготовленные компетентные клетки по охлаж- денным стерильным микропробиркам по 150 мкл. Использовать в тот же день или хранить в морозильной камере не более недели. Для длительного хранения компетентные клетки следует помещать в низкотемпературные морозильники (кельвинатор) при темпера- туре –72 °С. Вопросы для самоподготовкиЧто такое химическая компетентность клеток? Какими способами, кроме химического, может быть достигнуто состояние компетентности? Как повысить компетентность клеток? На какой стадии роста клетки обладают наибольшей компетент- ностью? Какие изменения происходят в надмембранных структурах и плаз- матической мембране клетки при придании ей компетентности? |