Микробиология. практикум микробиология ворд. Практикум министерство науки и высшего образования российской федерации

• Название: Практикум министерство науки и высшего образования российской федерации
• Анкор: Микробиология
• Дата: 03.02.2022
• Размер: 3.98 Mb.
• Имя файла: практикум микробиология ворд.docx
• Тип: Практикум; #350290
• страница: 15 из 23

ОСНОВЫ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

Современная микробиология тесно взаимодействует с биотех- нологией и генетикой. В частности, бактерии являются широко ис- пользуемыми платформами для наработки терапевтических бел- ков, а в свое время эксперименты на кишечной палочке помогли расшифровке генетического кода. Поэтому необходимо познако- мить студентов с рядом молекулярно-биологических и биотехноло- гических манипуляций с модельным организмом Escherichia coli(кишечной палочкой).

Лабораторная работа № 11

Выделение и очистка плазмидной ДНК методом щелочного лизиса

Основные теоретические положения

Для бактерий, кроме нуклеоида, характерно также наличие внехромосомных кольцевых ДНК – плазмид. Данные кольцевые молекулы имеют размеры от нескольких тысяч до нескольких де- сятков тысяч пар оснований. Они способны реплицироваться неза- висимо от деления бактериальной клетки и находятся в ней в коли- честве от нескольких до нескольких десятков штук. Кроме того, бактерии в ряде случаев способны обмениваться плазмидами друг с другом в процессах трансформации, конъюгации и трансдукции. Некоторые плазмиды, названные R-плазмидами (R – resistance), несут в себе гены устойчивости к антибиотикам. Обмен плазмида- ми между патогенными и непатогенными бактериями приводит к появлению и распространению множественной устойчивости к антибиотикам. Особенно это опасно в группе нозомикальных (внутрибольничных) инфекций. Однако способность плазмиды

к независимой репликации, а также обмен плазмидами между клет- ками делают их удобным инструментом для генной инженерии.

Плазмиды используют в молекулярной генетике в качестве векторов – молекул доставки необходимых исследователю генов в клетку. В дальнейшем это приводит к синтезу гетерологичных белков. Плазмида как молекула-челнок в молекулярной биологии обладает несколькими обязательными структурными элементами:

• 
  Точка ori– точка начала репликации.
  
• 
  Сайты рестрикции, служащие для разрезания плазмиды и ее модификации (подробнее об этом см. в лабораторной работе № 15).
  
• 
  Ген устойчивости к антибиотику, позволяющий проводить селективное выращивание трансформированных клеток на среде с антибиотиком для проверки встраивания плазмиды.
  
• 
  Маркерный ген (необязательная часть), служащий дополни- тельным индикатором успешной интеграции плазмиды в клетку. В качестве маркерных генов в последнее время все чаще выступают флуоресцирующие белки – в частности, зеленый флуоресцирую- щий белок (GFP). Его экспрессия позволяет визуально установить наличие плазмиды в клетке.
  
• 
  Промотор и находящийся под его контролем целевой ген. До- ставка этих двух компонентов в клетку является основной целью всей процедуры.
  

Выделение ДНК и манипуляции с ней – основа работ в моле- кулярной генетике. В зависимости от организма, из которого экстра- гируется ДНК, выделяют некоторые особенности реактивов и про- цедур. В любом случае в процессе выделения ДНК необходимо пройти несколько обязательных этапов:

1. 
   Лизис клеток – разрушение клеточной стенки, клеточной мембраны и других возможных оболочек клетки.
   
2. 
   Депротеинизация клеточного лизата – ферментативное рас- щепление белков или их осаждение.
   
3. 
   Центрифугирование в различных растворах для удаления из лизата мешающих компонентов на основе их растворимости.
   
4. 
   Осаждение ДНК.
   
5. 
   Очистка ДНК.
   
6. 
   Растворение ДНК в растворе для хранения, например, в TE-буфере.
   

Помимо «ручных» методов, существуют методы выделения ДНК с использованием готовых растворов в специальных мини-колон- ках с сорбентом, селективно связывающим плазмидную ДНК. Та- кие коммерческие наборы чаще всего создаются для медицинских целей. Выделение ДНК возбудителя и последующая ПЦР с ней – один из самых быстрых способов обнаружить патоген.

Выделение именно плазмидной ДНК основано на том, что при добавлении раствора 2 (см. ниже) pH поднимается до щелоч- ных значений (pH  12), и денатурации подвергается как неболь- шая плазмидная ДНК, так и крупная нуклеоидная (хромосомная) ДНК. Но крупная хромосомная ДНК денатурирует необратимо вследствие фрагментации ДНК в таких условиях, тогда как ДНК плазмиды при возвращении pH к нейтральным показателям при до- бавлении раствора 3 (см. ниже) ренатурирует.

Довольно часто количественную и качественную оценку пре- парату выделенной ДНК в первом приближении дают при гель- электрофорезе, следующем, как правило, сразу за процедурой выде- ления. Для этого визуально сравнивают на соседних дорожках геля интенсивность свечения в ультрафиолете полученного образца с об- разцом известной концентрации. Определить концентрацию ДНК, а также степень ее чистоты можно с помощью спектрофотометра, что точнее и быстрее. Для этого измеряют оптическую плотность раствора ДНК при длине волны 260 нм. Одна (каждая) оптическая единица соответствует концентрации ДНК в 50 мкг/мл. Спектро- фотометрия (абсорбционная) – физико-химический метод иссле- дования растворов и твердых веществ, основанный на изучении спектров поглощения в ультрафиолетовой (200–400 нм), видимой (400–760 нм) и инфракрасной (> 760 нм) областях спектра. Основ- ная зависимость, изучаемая в спектрофотометрии, – зависимость интенсивности поглощения падающего света от длины. В сооответ- ствии с законом Бугера – Ламберта – Бера оптическая плотность

раствора прямо пропорциональна концентрации поглощающего вещества. Нуклеиновые кислоты поглощают ультрафиолетовое (УФ) излучение в области 240–290 нм с максимумом при 260 нм. Хромо- форами служат азотистые основания нуклеиновой кислоты (НК), особенно пиримидиновые. Пиримидины поглощают УФ-свет при- мерно в 10–20 раз интенсивнее, чем хромофоры белковых молекул – триптофан, тирозин и фенилаланин. Для оценки чистоты препара- та ДНК, свободного от РНК, проводят измерения оптической плот- ности раствора при длинах волн 260, 280 и 235 нм, то есть на макси- мумах поглощения растворов ДНК, белков и полисахаридов соответ- ственно. Значение соотношения А260/280 для чистой ДНК должно быть больше, чем 1,8, значение А260/235 – больше, чем 2,2.

Цель работы: научиться выделять внехромосомную ДНК бактерий для последующих рестрикции, электрофореза и транс- формации; изучить количество выделенной плазмидной ДНК и ее чистоту.

Оборудование и реактивы

1. 
   Микроцентрифуга.
   
2. 
   Культура бактерий с плазмидой.
   
3. 
   рН-метр.
   
4. 
   Аналитические весы.
   
5. 
   Вортекс.
   
6. 
   Реактивы: глюкоза, ЭДТА, додецилсульфат натрия (ДСН, SDS), гидроксид натрия, трис-аминометан, ацетат калия, соляная кисло- та, лизоцим, изопропанол.
   
7. 
   Пластиковые микропробирки.
   
8. 
   Автоматические пипетки и наконечники для них.
   
9. 
   Микропланшетный спектрофотометр TecanМ200Pro.
   
10. 
    Микропланшет NanoQuant.
    
11. 
    Марлевые салфетки и вата.
    
12. 
    Этанол.
    
13. 
    Дистиллированная вода.
    
14. 
    Буфер ТЕ.
    

Ход работы

1. 
   Приготовить растворы для лизиса:
   

• 
  Раствор 1 (10 мл): 10 мМ ТрисHCl, pH 7,4, 5 мМ ЭДТА, 50 мМ глюкозы, 2 мг/мл лизоцима.
  
• 
  Раствор 2 (10 мл): 0,2 М NaOH, 1 % SDS.
  
• 
  Раствор 3 (10 мл): 3 М ацетат калия.
  

2. 
   Налить в пробирки типа эппендорф по 100 мкл раствора 1.
   

Подписатьэппендорфы!

3. 
   В стерильных условиях собрать стерильной петлей с чашки Петри небольшое количество бактериальной культуры. Перенести в эппендорф с раствором 1.
   

ИЛИ

3. 
   Осадить клетки из культуральной среды. Для этого поместить 1,5 мл «ночной культуры» E. coli в 1,7 мл микроцентрифужную пробирку и центрифугировать в течение 2 мин при 10 000 об/мин. Удалить супернатант выливанием через край. Повторить осаждение в эту пробирку еще два раза. Подписатьэппендорфы!
   
4. 
   Центрифугировать 10 с дополнительно, отобрать остатки куль- туральной среды микропипеткой. Добавить 100 мкл раствора 1.
   
5. 
   Ресуспендировать культуру в буфере до образования гомо- генной суспензии. Закрыть крышку, 2–3 мин перемешивать гомо- генат, переворачивая пробирку в руках. При этом происходит раз- рушение клеточной стенки под действием лизоцима. Вортекс ис- пользовать не рекомендуется.
   
6. 
   Добавить 200 мкл (двойной объем) раствора 2. Закрыть крыш- ку эппендорфа и аккуратно перемешать легким встряхиванием или перевернуть эппендорф несколько раз. Вортекс использовать не ре- комендуется, так как плазмида может порваться.
   
7. 
   Выдержать 10 мин. при комнатной температуре. Происходят лизис бактерий и щелочная денатурация ДНК.
   
8. 
   Добавить 150 мкл (1,5 объема) охлажденного раствора 3. Ак- куратно перемешать встряхиванием. Оставить на 10 мин в холо- дильнике при +4 – +8 °С.
   
9. 
   Поместить эппендорфы в микроцентрифугу, осадить в тече- ние 5 мин. при максимальных оборотах (14 500 об./мин.).
   
10. 
    Супернатант, содержащий плазмидную ДНК, аккуратно, не за- девая осадок, отобрать и перенести в чистую подписанную пробирку.
    
11. 
    Добавить 1 мл холодного изопропанола. Аккуратно пере- мешать. Осаждение проводить в течение 1 ч при –20 °С.
    
12. 
    Осадить плазмиду центрифугированием в течение 10 мин. при максимальной скорости центрифуги. Супернатант вылить че- рез край, его остатки после короткого центрифугирования отобрать микропипеткой.
    
13. 
    Добавить 300 мкл 70 % этилового спирта для отмывания осадка от соли. Перемешать и центрифугировать 2 мин. Удалить спирт. Осадок подсушить на воздухе. Нужно избегать пересушива- ния осадка, так как это снижает его растворимость.
    
14. 
    Растворить осадок ДНК в 25–50 мкл ТЕ-буфера.
    
15. 
    Проверить количество и чистоту выделенной ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле (10 мкл, лабораторная работа № 12) или на спектрофотометре.
    
16. 
    Внести в рабочую тетрадь основные принципы выделения ДНК хромосомной и плазмидной.
    

Спектрофотомерия препаратов ДНК

1. 
   Включить персональный компьютер и спектрофотометр. Кнопка включения прибора находится на задней стенке. Когда при- бор включен, на его верхней панели в правом нижнем углу горит зеленый индикатор.
   
2. 
   Запустить программу I-control 1–10. Когда программа загру- зится, зайти на панели управления на вкладку Instrument, нажать кнопку Connectи выбрать в появившемся окне установленную мо- дель прибора. Нажать ОК. Теперь прибор готов к работе.
   
3. 
   В нижнем левом углу открывшегося диалогового окна вы- брать закладку Applications. Автоматически выбрана программа для определения качества и количества нуклеиновых кислот с ис- пользованием планшета NanoQuant.
   
4. 
   В выпадающем меню Tipe выбрать тип образца, который нужно проанализировать: деспирализированная геномная ДНК (dsDNA), РНК (RNA), суперспирализированная плазмидная ДНК (ssDNA). Для работы необходим вариант ssDNA.
   
5. 
   Провести калибровку прибора. Для этого взять планшет, снять крышку. Нанести на каждую из лунок по 2 мкл буфера ТЕ и накрыть планшет крышкой. Поставить планшет в прибор, нажав на зеленую кнопку на верхней поверхности спектрофотометра. В диалоговом окне нажать кнопку Start Blanking. После заверше- ния калибровки в верхней части диалогового окна кнопка Startначнет подсвечиваться зеленым цветом.
   
6. 
   Подготовить планшет к измерению. Для этого открыть его, стереть сухим ватным тампоном калибровочный буфер, удалить остатки буфера, протерев планшет изнутри тампоном, смоченным в воде, а после – тампоном, смоченным в этаноле. Дать испарить- ся этанолу.
   
7. 
   Нанести образцы для анализа. Вносить по 2 мкл в лунку, ис- пользуя новый наконечник для каждого образца. Поместить план- шет в прибор, нажать в диалоговом окне кнопку Start. Через не- сколько минут измерение будет закончено, после чего автоматичес- ки откроется электронная таблица, в которой будут указаны номер лунки, концентрация нуклеиновых кислот в данной лунке (в нг/мкл, что соответствует мкг/мл), соотношение оптических плотностей при длине волны 260 нм и 280 нм. Это показатель качества и чис- тоты выделение ДНК. Он должен быть больше, чем 1,8.
   
8. 
   Очистить планшет от образцов ДНК с помощью ватного там- пона, воды и этанола, как указано в п. 6, и убрать его в футляр.
   
9. 
   Сохранить результаты на флеш-карте, закрыть программу, отключить прибор и компьютер.
   

Вопросы для самоподготовки

1. 
   Какие основные участки входят в плазмиду, какие функции они выполняют?
   
2. 
   Какие стадии выделения ДНК вы знаете? В чем принцип выделения плазмидной ДНК?
   
3. 
   Какую роль выполняют плазмиды в бактериальной клетке? Как их можно использовать в биотехнологии?
   
4. 
   Для чего используют фенол и хлороформ при выделении ДНК?
   
5. 
   Что такое лизоцим? Для чего его добавляют в раствор 1?
   

Лабораторная работа № 12 Электрофорез плазмидной ДНК в агарозном геле

Основные теоретические положения

Метод электрофореза широко используют в биологии и меди- цине для разделения заряженных молекул биополимеров – белков и нуклеиновых кислот. Суть метода заключается в том, что заряжен- ные частицы в растворе под действием электрического поля начи- нают двигаться. При помещении на их пути трехмерных сетчатых структур – гелей (акриламидного, агарозного, крахмального) ско- рость движения частиц замедляется пропорционально их размеру (массе), что и приводит к их разделению. Более маленькие (а зна- чит, и легкие) молекулы движутся быстрее, чем молекулы больше- го размера. ДНК – слабая кислота и под действием электрического тока двигается к аноду, заряженному положительно.

На первом этапе электрофореза необходимо приготовить ага- розный гель. Готовится он добавлением агарозы в TAE буфер. Для полного растворения агарозы смесь нагревают до 95 °С. Пока гель находится в жидком состоянии, в него добавляют бромистый этидий и разливают в форму, не забывая ставить гребенку для обра- зования лунок. Бромистый этидий впоследствии встроится (ин- теркалирует) между парами нуклеотидов, что позволит визуализи- ровать ДНК в ультрафиолетовом свете. Очень важна на этом эта- пе концентрация агарозы. Она может варьировать от 0,3 до 2,0 %. Чем больше концентрация агарозы, тем меньше образующиеся по- ры и тем меньшего размера молекулы ДНК гель способен разделять. Следующим этапом электрофоретического разделения являет-

ся внесение образцов ДНК в лунки. Для этого используют буфер при внесении образцов в гель. Он содержит глицерин или сахарозу, необходимые для того, чтобы ДНК сразу опустилась на дно лунки, и краситель, позволяющий отследить движение электрофоретичес- кого фронта. Параллельно с образцами обычно в одну из лунок вно- сится маркер ДНК – смесь нуклеотидов известной длины (рис. 18). Маркер служит показателем успешности электрофореза.


Длинные фрагменты

Короткие фрагменты


Рис. 18. Процесс электрофореза
После внесения всех образцов в гель включают источник тока, и начинается непосредственно электрофорез. В процессе электро- фореза более короткие фрагменты проще проходят через порис- тую структуру геля и оказываются ближе к аноду (рис. 18).

Конечным этапом работы является визуализация результатов в трансиллюминаторе в УФ-спектре.

Цель работы: освоить метод электрофореза нуклеиновых кислот в агарозном геле. Установить качество выделения плаз- мидной ДНК.

Оборудование и реактивы

1. 
   Буфер для электрофореза – ТАЕ ( 50).
   
2. 
   Агароза.
   
3. 
   Бромистый этидий (Внимание!Данное вещество является канцерогеном! Работать только в перчатках! Не проливать на стол!).
   
4. 
   Буфер для внесения с красителем бромфеноловым синим.
   
5. 
   Камера для горизонтального электрофореза с заливочным столиком.
   
6. 
   Источник постоянного тока.
   
7. 
   Электроплитка.
   
8. 
   Автоматическая пипетка с наконечниками.
   
9. 
   Трансиллюминатор.
   

Ход работы

1. 
   Приготовить буфер для электрофореза из стока (концентра- та). Для этого взять 20 мл ТАЕ ( 50) и довести дистиллированной водой до 1 л.
   
2. 
   Приготовить агарозный гель. Для этого взять 1 г агарозы, по- местить в коническую колбу объемом 250 мл, добавить 100 мл бу- фера ТАЕ ( 1). Довести буфер до кипения, дождаться полного раст- ворения агарозы. После ее охлаждения до 70 °C добавить 5 мкл раствора бромистого этидия (1 % раствор) и тщательно перемешать.
   
3. 
   Собрать заливочный столик, выровнять его, поставить гре- бенку.
   
4. 
   Залить расплавленную агарозу ровным слоем, избегая по- явления пузырьков воздуха.
   
5. 
   Дождаться полимеризации и остывания геля, аккуратно вы- нуть гребенку. Достать застывший гель из формы, поместить его в электрофоретическую камеру, предварительно заполненную  1 TAE-буфером.
   
6. 
   К 5–10 мкл выделенной плазмидной ДНК добавить 0,5–1 мкл буфера, перемешать, аккуратно внести в лунки геля.
   
7. 
   После внесения образцов закрыть камеру крышкой, подклю- чить электроды к источнику тока.
   
8. 
   Включить электрический ток, выставив на источнике напря- жение от 60 до 90 В и силу тока 20–40 мА. Проводить электрофорез в течение 1–1,5 ч.
   
9. 
   Отключить напряжение, достать гель (вперчатках!) и пере- нести на стекло трансиллюминатора. Закрыть защитной крышкой и включить ультрафиолет. Для начала убедится в успешности элек- трофоретического разделения, просмотрев разделение маркера. Пронаблюдать светящиеся полосы: рядом с лунками – плазмид- ная ДНК, облака на противоположной стороне – продукты дегра- дации РНК.
   
10. 
    Внести в рабочую тетрадь основные принципы проведения электрофоретического разделения ДНК в агарозном геле.
    

Вопросы для самоподготовки

1. 
   Какие типы гелей используются в электрофорезе биополимеров? Какие они имеют свойства, достоинства и недостатки?
   
2. 
   Как возможно визуализировать ДНК в геле, после электрофореза?
   
3. 
   Для чего используют буфер для внесения и маркер молекулярных масс?
   
4. 
   Почему для электрофореза и приготовления геля используют специальные буферы, а не дистиллированную воду? Почему буфер имеет щелочную рН, а не кислую?
   
5. 
   Каким методом, кроме электрофореза, можно установить качество выделенной ДНК и ее концентрацию?