Микробиология. практикум микробиология ворд. Практикум министерство науки и высшего образования российской федерации
![]()
|
Лабораторная работа № 8Определение и описание чистой культурыОсновные теоретические положенияПосле получения чистой культуры первое, что необходимо сде- лать – проверить ее чистоту. Анализ нужно проводить по нескольким параметрам: однородность роста бактерий по поверхности скошенной ага- ризованной среды; однородность морфологии выросших колоний; однородность морфологии клеток (за исключением некото- рых полиморфных бактерий, то есть тех, чья форма варьирует в из- вестных пределах). Кроме того, необходимо высевать чистую культуру на пита- тельные среды различного состава, который отличается для раз- ных бактерий. Естественно, разделение основывается на метабо- лизме. Чистоту культуры автотрофов необходимо проверять на сре- дах без полиуглеродных соединений. Также ее можно проверить и отрицательным отбором – высеять исследуемую культуру на ту среду, на которой она расти не должна, и убедиться в отсутствии роста. Когда есть уверенность в чистоте выделенной культуры, можно приступать к ее описанию. Необходимо указать морфологические и биохимические параметры колоний и клеток бактерий (табл. 3). В большинстве случаев этого будет недостаточно для определе- ния бактерии до вида или даже до рода, что связано со сложностя- ми в систематике бактерий. Существует два возможных подхода к систематике бактерий: исторически первый – фенотипическая систематика Д. Берджи, а также филогенетическая систематика. В 1923 г. вышло первое издание «Определителя бактерий Берджи», с тех пор он модифи- цировался и переиздавался множество раз. В основе данной клас- сификации лежат морфологические, физиологические и биохими- ческие особенности бактерий и архей. В фенотипической система- тике Берджи среди всех прокариот выделяются четыре категории на основе строения их клеточной стенки – имеющие клеточную стенку грамположительные эубактерии, имеющие клеточную стен- ку грамотрицательные эубактерии, эубактерии, не имеющие кле- точной стенки и архебактерии. Дальнейшее дробление этих кате- горий происходит не на основе родственных связей бактерий, а ис- ключительно на их общих фенотипических свойствах. На втором уровне систематики бактерий Берджи выделяют 35 групп на осно- ве отношения к кислороду, формы клеток, их подвижности и спо- собности образовывать особые структуры (чехлы, эндоспоры, пло- довые тела и т. д.). Для более точного определения (до рода или вида) необходимо в первую очередь провести множество биохимических тестов – на способность бактерии утилизировать различные углеводы, бел- ки, липиды; на наличие или отсутствие некоторых ферментов; на условия культивирования и т. д. Например, для дифференциации медленнорастущих бактерий рода Mycobacterium до вида необхо- димо проверить наличие пяти ферментов, рост при 25 и 45 °С, спо- собности к гидролизу твина, восстановлению нитратов, накопле- нию никотиновой кислоты, фотохромогенность, скотохромогенность, устойчивость к действию восьми различных веществ. Таким обра- зом, видно, что использование подобной системы для идентифи- кации бактерий громоздко и требует множества времени, сил и ре- сурсов. Тем не менее, до изобретения и массового использования секвенирования это был единственный достоверный способ иден- тификации бактерий. Второй вариант систематики бактерий и архей – филогенети- ческая систематика, основанная на изучении эволюционных взаи- моотношений различных таксономических групп организмов меж- ду собой. Иными словами, цель филогенетики – выяснить филоге- нетические связи, то есть то, как давно данные виды (или другие таксоны) разошлись на эволюционном древе. Появлению подобной системы предшествовало множество накопленных в молекулярной биологии знаний (строение ДНК, центральная догма молекулярной биологии) и в эволюции (синтетическая теория эволюции, моле- кулярные часы), а также новые технические возможности (выделе- ние ДНК, ПЦР, секвенирование по Сэнгеру). Для идентификации микроорганизма в филогенетической систематике требуется вы- делить ДНК, секвенировать ген 16S-рРНК и расположить получен- ную последовательность на эволюционном дереве, сравнив с уже известными геномами из баз данных. Данная лабораторная работа рассчитана на два занятия. По ее итогам бригадой сдается отчет: описываются приготовление пита- тельных сред, постановка накопительной культуры, ее свойства, выделение чистой культуры, ее характеристика и идентификация бактерий. Цель работы: описать полученную чистую культуру различ- ными способами и определить до физиологической группы/рода/ вида ее принадлежность. Оборудование и реактивыМикроскоп, иммерсионное масло. Предметные стекла, штатив к ним. Спиртовки и зажигалки. Микробиологические петли. Фильтровальная бумага и вата. Выделенная чистая культура бактерий. Реактивы для окраски по Граму: свежий генциановый фиоле- товый, свежий реактив Люголя, водный раствор фуксина или саф- ранина, 95 % спирт. Реактивы для окраски по Цилю – Нельсону: феноловый фук- син Циля, метиленовый синий, 5–10 % раствор H2SO4. Реактивы для окраски эндоспор по Пешкову: метиленовый синий. Красители: водный раствор сафранина, метиленовый синий, тушь. Ход работыПроверить частоту выделенной культуры. В стерильных ус- ловиях пересеять полученную чистую культуру с чашки Петри на скошенный агар. Для этого нужно прокалить и остудить петлю и, работая рядом с пламенем спиртовки, приоткрыть чашку Петри, отобрать бактерии с изолированной колонии, закрыть чашку Петри. Открыть пробирку, обжечь горлышко, опустить петлю на дно пробирки и, поднимаясь вверх, распределить бактерии по поверх- ности скошенного агара (рис. 12). Обжечь горлышко пробирки, закрыть ватной пробкой, прока- лить петлю. Подписать пробирку (день и пара практики, номер бри- гады, дата), поставить в термостат (30 °С). ![]() Рис. 12. Техника посева на скошенный агар Охарактеризовать колонию – указать ее размер, форму са- мой колонии, ее края и профиля, текстуру, пигментацию и т. д. За- полнить соответствующие графы табл. 3. Справочный материал указан в рис. 13–15. Т а б л и ц а 3 Описание полученной культуры ![]() Описаниеколонии ![]() ![]() Морфологияклеток О к о н ч а н и е т а б л. 3
![]() ![]() Биохимические свойства 1 2 3 ![]() 4 5 6 Рис. 13. Форма колоний: 1– точечная; 2– круглая; 3– нитчатая; 4– нерегулярная; 5– ризоидная; 6– веретеновидная ![]() 1 2 3 ![]() 4 5 6 Рис. 14. Форма профиля колонии: 1– плоская; 2– приподнятая; 3– выпуклая; 4– подушкообразная; 5– с выпуклостью; 6– блюдцевидная ![]() ![]() 4 5 Рис. 15. Форма края колонии: 1– целый; 2– волнистый; 3– лопастной; 4– выемчатый; 5– нитчатый Закончить заполнение табл. 3. Для этого приготовить в соот- ветствии с уже известными протоколами следующие препараты: Препарат бактерий, окрашенных по Граму. Отметить как не- посредственно окраску по Граму, так и размер, форму и сочетание клеток. Препарат бактерий, окрашенных по Цилю – Нильсену. Отме- тить кислотоустойчивость/некислотоустойчивость исследуемых клеток. Препарат бактерий, окрашенный на эндоспоры. Отметить наличие или отсутствие эндоспор. Препарат бактерий, окрашенный на капсулы. Отметить нали- чие или отсутствие капсул. Живой препарат бактерий. Отметить подвижность/неподвиж- ность клеток. Изучить биохимическую активность исследуемых бактерий на примере тестов на наличие каталазы и оксидазы. Наличие каталазы определяется внесением суспензии иссле- дуемой культуры микробиологической петлей в асептических ус- ловиях в каплю 3 % перекиси водорода на предметном стекле. Если через 1–5 мин в капле начинают образовываться пузырьки газа, то бактерии являются каталаза-положительными. Наличие оксидазы определяется внесением суспензии исследуе- мой культуры бактерий на фильтровальную бумагу, смоченную раствором свежеприготовленного 1 % раствора солянокислого тет- раметил-n-фенилендиамина. Если в течение минуты после внесе- ния бактерий развивается фиолетовая окраска, то бактерии явля- ются оксидаза-положительными. Воспользовавшись определителем бактерий Берджи и по- лученными данными, попробовать определить группу бактерий, род или даже вид (в редких случаях). В некоторых случаях возможно определить только физиологическую (экологическую) группу бак- терий. Внести в табл. 3 результат идентификации бактерий с дока- зательствами. Указать также физиологическую группу бактерий, выделенную на этапе накопительной культуры, и те тесты, кото- рые необходимо было бы провести, чтобы более точно опреде- лить бактерии. Сделать и записать вывод о проделанной работе. Вопросы для самоподготовкиНа каких принципах базируется фенотипическая систематика? В чем особенности филогенетической систематики? Какая систематика в настоящее время активнее используется в на- учном мире и почему? |