Микробиология. практикум микробиология ворд. Практикум министерство науки и высшего образования российской федерации

• Название: Практикум министерство науки и высшего образования российской федерации
• Анкор: Микробиология
• Дата: 03.02.2022
• Размер: 3.98 Mb.
• Имя файла: практикум микробиология ворд.docx
• Тип: Практикум; #350290
• страница: 12 из 23

Лабораторная работа № 8

Определение и описание чистой культуры

Основные теоретические положения

После получения чистой культуры первое, что необходимо сде- лать – проверить ее чистоту.

Анализ нужно проводить по нескольким параметрам:

• 
  однородность роста бактерий по поверхности скошенной ага- ризованной среды;
  
• 
  однородность морфологии выросших колоний;
  
• 
  однородность морфологии клеток (за исключением некото- рых полиморфных бактерий, то есть тех, чья форма варьирует в из- вестных пределах).
  

Кроме того, необходимо высевать чистую культуру на пита- тельные среды различного состава, который отличается для раз- ных бактерий. Естественно, разделение основывается на метабо- лизме. Чистоту культуры автотрофов необходимо проверять на сре- дах без полиуглеродных соединений. Также ее можно проверить и отрицательным отбором – высеять исследуемую культуру на ту среду, на которой она расти не должна, и убедиться в отсутствии роста.

Когда есть уверенность в чистоте выделенной культуры, можно приступать к ее описанию. Необходимо указать морфологические и биохимические параметры колоний и клеток бактерий (табл. 3). В большинстве случаев этого будет недостаточно для определе- ния бактерии до вида или даже до рода, что связано со сложностя- ми в систематике бактерий.

Существует два возможных подхода к систематике бактерий: исторически первый – фенотипическая систематика Д. Берджи, а также филогенетическая систематика. В 1923 г. вышло первое издание «Определителя бактерий Берджи», с тех пор он модифи- цировался и переиздавался множество раз. В основе данной клас- сификации лежат морфологические, физиологические и биохими- ческие особенности бактерий и архей. В фенотипической система- тике Берджи среди всех прокариот выделяются четыре категории на основе строения их клеточной стенки – имеющие клеточную стенку грамположительные эубактерии, имеющие клеточную стен- ку грамотрицательные эубактерии, эубактерии, не имеющие кле- точной стенки и архебактерии. Дальнейшее дробление этих кате- горий происходит не на основе родственных связей бактерий, а ис- ключительно на их общих фенотипических свойствах. На втором

уровне систематики бактерий Берджи выделяют 35 групп на осно- ве отношения к кислороду, формы клеток, их подвижности и спо- собности образовывать особые структуры (чехлы, эндоспоры, пло- довые тела и т. д.).

Для более точного определения (до рода или вида) необходимо в первую очередь провести множество биохимических тестов – на способность бактерии утилизировать различные углеводы, бел- ки, липиды; на наличие или отсутствие некоторых ферментов; на условия культивирования и т. д. Например, для дифференциации медленнорастущих бактерий рода Mycobacterium до вида необхо- димо проверить наличие пяти ферментов, рост при 25 и 45 °С, спо- собности к гидролизу твина, восстановлению нитратов, накопле- нию никотиновой кислоты, фотохромогенность, скотохромогенность, устойчивость к действию восьми различных веществ. Таким обра- зом, видно, что использование подобной системы для идентифи- кации бактерий громоздко и требует множества времени, сил и ре- сурсов. Тем не менее, до изобретения и массового использования секвенирования это был единственный достоверный способ иден- тификации бактерий.

Второй вариант систематики бактерий и архей – филогенети- ческая систематика, основанная на изучении эволюционных взаи- моотношений различных таксономических групп организмов меж- ду собой. Иными словами, цель филогенетики – выяснить филоге- нетические связи, то есть то, как давно данные виды (или другие таксоны) разошлись на эволюционном древе. Появлению подобной системы предшествовало множество накопленных в молекулярной биологии знаний (строение ДНК, центральная догма молекулярной биологии) и в эволюции (синтетическая теория эволюции, моле- кулярные часы), а также новые технические возможности (выделе- ние ДНК, ПЦР, секвенирование по Сэнгеру). Для идентификации микроорганизма в филогенетической систематике требуется вы- делить ДНК, секвенировать ген 16S-рРНК и расположить получен- ную последовательность на эволюционном дереве, сравнив с уже известными геномами из баз данных.

Данная лабораторная работа рассчитана на два занятия. По ее итогам бригадой сдается отчет: описываются приготовление пита- тельных сред, постановка накопительной культуры, ее свойства, выделение чистой культуры, ее характеристика и идентификация бактерий.

Цель работы: описать полученную чистую культуру различ- ными способами и определить до физиологической группы/рода/ вида ее принадлежность.

Оборудование и реактивы

1. 
   Микроскоп, иммерсионное масло.
   
2. 
   Предметные стекла, штатив к ним.
   
3. 
   Спиртовки и зажигалки.
   
4. 
   Микробиологические петли.
   
5. 
   Фильтровальная бумага и вата.
   
6. 
   Выделенная чистая культура бактерий.
   
7. 
   Реактивы для окраски по Граму: свежий генциановый фиоле- товый, свежий реактив Люголя, водный раствор фуксина или саф- ранина, 95 % спирт.
   
8. 
   Реактивы для окраски по Цилю – Нельсону: феноловый фук- син Циля, метиленовый синий, 5–10 % раствор H₂SO₄.
   
9. 
   Реактивы для окраски эндоспор по Пешкову: метиленовый синий.
   
10. 
    Красители: водный раствор сафранина, метиленовый синий, тушь.
    

Ход работы

1. 
   Проверить частоту выделенной культуры. В стерильных ус- ловиях пересеять полученную чистую культуру с чашки Петри на скошенный агар. Для этого нужно прокалить и остудить петлю и, работая рядом с пламенем спиртовки, приоткрыть чашку Петри, отобрать бактерии с изолированной колонии, закрыть чашку Петри. Открыть пробирку, обжечь горлышко, опустить петлю на дно пробирки и, поднимаясь вверх, распределить бактерии по поверх-
   

ности скошенного агара (рис. 12).

Обжечь горлышко пробирки, закрыть ватной пробкой, прока- лить петлю. Подписать пробирку (день и пара практики, номер бри- гады, дата), поставить в термостат (30 °С).



Рис. 12. Техника посева на скошенный агар

2. 
   Охарактеризовать колонию – указать ее размер, форму са- мой колонии, ее края и профиля, текстуру, пигментацию и т. д. За- полнить соответствующие графы табл. 3. Справочный материал указан в рис. 13–15.
   

Т а б л и ц а 3

Описание полученной культуры





Описаниеколонии




Морфологияклеток

О к о н ч а н и е т а б л. 3

Признак	Описание
Окраска по Цилю – Нильсену Эндоспоры Капсулы

Биохимические свойства
1 2 3




4 5 6

Рис. 13. Форма колоний:

1– точечная; 2– круглая; 3– нитчатая; 4– нерегулярная;

5– ризоидная; 6– веретеновидная



1 2 3



4 5 6

Рис. 14. Форма профиля колонии:

1– плоская; 2– приподнятая; 3– выпуклая; 4– подушкообразная;

5– с выпуклостью; 6– блюдцевидная



1 2 3

4 5

Рис. 15. Форма края колонии:

1– целый; 2– волнистый; 3– лопастной; 4– выемчатый; 5– нитчатый

3. 
   Закончить заполнение табл. 3. Для этого приготовить в соот- ветствии с уже известными протоколами следующие препараты:
   

• 
  Препарат бактерий, окрашенных по Граму. Отметить как не- посредственно окраску по Граму, так и размер, форму и сочетание клеток.
  
• 
  Препарат бактерий, окрашенных по Цилю – Нильсену. Отме- тить кислотоустойчивость/некислотоустойчивость исследуемых клеток.
  
• 
  Препарат бактерий, окрашенный на эндоспоры. Отметить наличие или отсутствие эндоспор.
  
• 
  Препарат бактерий, окрашенный на капсулы. Отметить нали- чие или отсутствие капсул.
  
• 
  Живой препарат бактерий. Отметить подвижность/неподвиж- ность клеток.
  

4. 
   Изучить биохимическую активность исследуемых бактерий на примере тестов на наличие каталазы и оксидазы.
   

Наличие каталазы определяется внесением суспензии иссле- дуемой культуры микробиологической петлей в асептических ус- ловиях в каплю 3 % перекиси водорода на предметном стекле. Если через 1–5 мин в капле начинают образовываться пузырьки газа, то бактерии являются каталаза-положительными.

Наличие оксидазы определяется внесением суспензии исследуе- мой культуры бактерий на фильтровальную бумагу, смоченную раствором свежеприготовленного 1 % раствора солянокислого тет- раметил-n-фенилендиамина. Если в течение минуты после внесе- ния бактерий развивается фиолетовая окраска, то бактерии явля- ются оксидаза-положительными.

5. 
   Воспользовавшись определителем бактерий Берджи и по- лученными данными, попробовать определить группу бактерий, род или даже вид (в редких случаях). В некоторых случаях возможно определить только физиологическую (экологическую) группу бак- терий. Внести в табл. 3 результат идентификации бактерий с дока- зательствами. Указать также физиологическую группу бактерий, выделенную на этапе накопительной культуры, и те тесты, кото- рые необходимо было бы провести, чтобы более точно опреде- лить бактерии. Сделать и записать вывод о проделанной работе.
   

Вопросы для самоподготовки

1. 
   На каких принципах базируется фенотипическая систематика?
   
2. 
   В чем особенности филогенетической систематики?
   
3. 
   Какая систематика в настоящее время активнее используется в на- учном мире и почему?