Микробиология. практикум микробиология ворд. Практикум министерство науки и высшего образования российской федерации

• Название: Практикум министерство науки и высшего образования российской федерации
• Анкор: Микробиология
• Дата: 03.02.2022
• Размер: 3.98 Mb.
• Имя файла: практикум микробиология ворд.docx
• Тип: Практикум; #350290
• страница: 8 из 23

Лабораторная работа № 4

Количественный учет микроорганизмов

Основные теоретические положения

Во многих сферах микробиологии количественный учет мик- роорганизмов не менее важен, чем качественный. Это касается как почвенной или водной микробиологии, так и медицинской. Во всех случаях необходимо оценить бактериальную нагрузку чего- либо микроорганизмами: в первом случае для того, чтобы сделать экологическое описание той или иной среды, а во втором – чтобы оценить степень заражения и назначить адекватную терапию.

Оценивать количество микроорганизмов можно различными способами:

• 
  прямым подсчетом различными методами (в камере Горяе- ва, методом Виноградского – Брида, на мембранных фильтрах, ка- пиллярным методом);
  
• 
  косвенными методами, основанными на разведении сус- пензии клеток и высевом их на питательные среды (методом Коха)
  

и на расчете различных показателей, изменяющихся в зависимос- ти от количества микроорганизмов (оптическая плотность в нефе- лометрическом методе).

В данной работе необходимо будет проанализировать суспен- зию клеток дрожжей и сравнить четыре метода подсчета микро- организмов – два прямых метода (в камере Горяева и методом Ви- ноградского – Брида) и два косвенных – метод Коха и нефеломет- рический метод.

Обычно в исследуемой среде клеток слишком много и для пря- мых, и для косвенных методов подсчета микроорганизмов, поэтому ее разводят в несколько раз и работу ведут с серией разведений.

Прямые методы

КамераГоряева– особое предметное стекло с нанесенной на него микроскопической стекой (рис. 8). Подсчет клеток в каме- ре Горяева осуществляется в больших или малых квадратах сетки в зависимости от размеров микроорганизмов (рис. 9). Сетка нане- сена на поверхность стекла, расположенного строго на 0,1 мм ниже, чем соседние площадки. Они используются для притирания спе- циального толстого покровного стекла к камере. Образование ра- дужных колец (колец Ньютона) в месте площадок говорит о том, что притирание прошло успешно и объем камеры соответствует заявленному.

1

Рис. 8. Камера Горяева:

1– покровное стекло; 2 – микроскопическая сетка;

3– площадки для притирания стекла



Рис. 9. Сетка камеры Горяева:

1– большой квадрат сетки; 2– малый квадрат сетки
МетодВиноградского–Бридазаключается в подсчете микро- организмов на фиксированных окрашенных мазках в полях зрения. Для этого на предметном стекле с помощью миллиметровой бумаги вычерчивают прямоугольник с определенной площадью и готовят фиксированный окрашенный мазок суспензии клеток известного объема по площади этого прямоугольника. Подсчет производят в полях зрения, предварительно высчитав их площадь (обычно с помощью объект-микрометра).

Два этих метода являются прямыми методами подсчета. На каж- дое разведение необходимо подсчитать не менее 600 клеток.

Метод подсчета клеток намембранныхфильтрахиспользует- ся для количественного учета микроорганизмов с низкими плотнос- тями клеток. Определенный объем пробы исследуемого субстрата отделяют через фильтры с определенным размеров пор, а затем окрашивают и подсчитывают клетки с помощью микроскопа с оку- лярной сеткой.

Косвенные методы

Нефелометрический метод. Те же самые разведения, которые использовались при прямых методах подсчета, будут использованы для измерения оптической плотности с помощью фотоэлектроколо- риметра (ФЭК) и составления калибровочной кривой. Построение

графика по соотнесению данных прямого подсчета микроорганиз- мов с данными ФЭК позволяет получить формулу для перевода этих данных в количество микроорганизмов. В дальнейшем подоб- ная формула позволяет существенно экономить время и исследовать культуры клеток только на ФЭК, минуя прямые методы подсчета. МетодКохаоснован на посеве определенного объема трех конечных разведений на три чашки Петри с питательной средой. В конечных разведениях клеток должно быть не очень много, чтобы каждая из них образовывала изолированную колонию, но и не очень мало (если колоний на чашке Петри будет меньше десяти, то этот результат нельзя использовать для подсчета). Каж- дая изолированная колония – потомство одной клетки, что позво- ляет соотнести количество выросших колоний с количеством кле- ток. Для равномерного распределения клеток обычно используют

шпатель Дригальского.

Цель работы: освоить различные методы количественной оценки микроорганизмов и возможности их сопоставления.

Оборудование и реактивы

1. 
   Суспензия культуры дрожжей.
   
2. 
   Пробирки для разведения культуры со стерильной водопро- водной водой.
   
3. 
   Чашки Петри со средой Сабуро для выращивания дрожжей.
   
4. 
   Стерильные шпатели Дригальского, 3 шт. на группу.
   
5. 
   Камеры Горяева.
   
6. 
   Миллиметровая бумага, предметные стекла.
   
7. 
   Спиртовки и зажигалки.
   
8. 
   Микроскопы.
   
9. 
   Объект-микрометр.
   
10. 
    ФЭК, кюветы к нему, стерильная чистая среда для контроля.
    
11. 
    Фильтровальная бумага, вата, хозяйственное мыло.
    
12. 
    Самплеры и стерильные наконечники к ним.
    

Задания 1 и 2 данной работы выполняются единожды на всю группу и в ламинарном боксе.

З а д а н и е 1

Приготовление серии разведений исходной суспензии (табл. 1)

Приготовить 7 пробирок с 5 мл стерильной воды в каждой. Подписать пробирки (1–7).

В пробирку № 1 внести 5 мл исходной суспензии, перемешать самплером и сменитьнаконечник.

В пробирку № 2 внести 5 мл из пробирки № 1, перемешать самплером и сменитьнаконечник.

Каждый раз с помощью нового наконечника проделывать ту же процедуру с оставшимися пробирками.

Важно! Нельзя погружать кончик наконечника слишком сильно в раствор, откуда производится забор материала.
Т а б л и ц а 1

Серия разведений культуры

Saccharomycescerevisiae

Номер пробирки	1	2	3	4	5	6	7
Разведение (раз)	2	4	8	16	32	64	128

З а д а н и е 2

Посев на чашки Петри для подсчета методом Коха

В асептических условиях пипеткой внести 50 мкл суспензии из пробирки № 7 на чашку Петри, распределить по ней этот объем с помощью стерильного шпателя Дригальского. Подписать чашку Петри: видовое название, разведение, дата, группа.

Повторить процедуру с пробирками № 5 и 6. Сразу их подписать. Поставить чашки Петри в термостат на 37 °С.

Подсчитать количество выросших колоний на следующем занятии и вычислить количество клеток в исходной суспензии по формуле:

а10ⁿ

М ,

V

где M– число клеток в 1 мл суспензии; a– среднее число колоний, выросших после посева из данного разведения; V – объем суспен- зии, взятой для посева; 10ⁿ– коэффициент разведения.

Внести данные в табл. 2.

Т а б л и ц а 2

Среднее количество клеток в исходной суспензии

№ пробирки	Разведение	Среднее количество клеток в исходной суспензии, высчитанное
		Камера Горяева	Метод Виноград- ского – Брида	Нефело- метрический метод	Метод Коха
–	Исходное
1	2
2	4
3	8
4	16
5	32
6	64
7	128

З а д а н и е 3

Подсчет клеток в камере Горяева

Притереть покровное стекло к предметному до появления радужных колец на местах притирки. Появление колец Ньютона означает, что объем камеры в таком положении точно равен за- явленному.

Внести каплю суспензии под покровное стекло капилляром или самплером.

Микроскопировать с объективом 40 или 20. Подсчитывать

все клетки микроорганизмов, находящиеся внутри большого квад- рата, а также на пограничных линиях, если они большей частью на- ходятся в данном квадрате. Клетки, большая часть которых нахо- дится в другом квадрате, не подсчитываются. Если клетки пересека- ются пограничной линией пополам, то их считают только на двух смежных сторонах квадратов, например, на левой и нижней.

Подсчитать необходимо не менее 600 клеток для каждого раз- ведения. Для этого придется посмотреть и приготовить не один препарат. Всю информацию заносить в тетрадь.

После подсчета около 600 клеток необходимо подсчитать сред- нее количество клеток в большом квадрате сетки и подставить результат в формулу подсчета общего количества клеток в 1 мл суспензии по формуле:

_М 1000  а_{ n,} h S

где M – число клеток в 1 мл суспензии; a – среднее число клеток в большом квадрате сетки; n – коэффициент разведения суспен- зии; h– глубина камеры; S– площадь квадрата сетки.

Глубина камеры и площадь квадрата сетки (или объем камеры) указаны на самой камере. Не забыть также внести эти данные в тетрадь.

З а д а н и е 4

Подсчет клеток методом Виноградского – Брида

Чистое обезжиренное предметное стекло помещается на фильт- ровальную бумагу, на которой уже был размечен прямоугольник площадью 4 см².

На стекло вносится 10 мкл суспензии культуры и тщательно рас- пределяется по площади прямоугольника.

После высыхания препарата его фиксируют, окрашивают 30 сек. метиленовым синим, промывают, причем не проточной водой, а по- гружением в сосуды с водой, и вновь подсушивают.

Препарат микроскопируют на объективе 20 или 40, подсчи- тывая число клеток в поле зрения. Для достоверности результатов подсчет должен вестись не менее чем в 50 полях зрения.

Для подсчета площади поля зрения используется объект-мик- рометр. С его помощью высчитывают диаметр и по формуле пло- щади круга узнают площадь поля зрения.

После окончания подсчетов необходимо вычислить количество микроорганизмов в исследуемом растворе по формуле:

М ^{а S} n, s V

где M – число клеток в 1 мл суспензии; a – среднее количество клеток в поле зрения; S– площадь мазка (мм²); s– площадь поля зрения (мм²); V– объем нанесенной на стекло суспензии (мл); n– коэффициент разведения исходной суспензии.

З а д а н и е 5

Подсчет микроорганизмов нефелометрическим методом Параметры использования ФЭК: h= 540 нм, кювета с длиной оптического пути 0,5 см, в качестве контроля использовать сте-

рильную среду.

Промерить на ФЭК оптическую плотность суспензий из про- бирок с серией разведений. Наливать суспензии до риски, не каса- ясь граней кюветы. Промывать дистиллятом перед каждым но- вым замером.

Занести данные в тетрадь.

З а д а н и е 6

Построение калибровочной кривой

От каждой группы требуется таблица формата Excel. На пер- вом листе должны быть собраны первичные данные: фамилия, ис- пользуемый метод подсчета, данные.

На втором листе – среднее число клеток в большом квадрате сетки или в поле зрения по каждому разведению.

На третьем листе должна быть приведена таблица (см. табл. 2). В ней необходимо указать среднее количество клеток в исходной суспензии, высчитанное Excelпо указанным формулам для каж-


35
дого разведения, и среднее количество клеток в исходной суспен- зии по каждому методу.

Предварительно необходимо построить график зависимости оптической плотности суспензии дрожжей от их количества, на ко- тором должны присутствовать линия тренда и формула этой зави- симости.

В этом же файле написать вывод о проделанной работе, про- вести сравнительный анализ методов количественного учета мик- роорганизмов.

Вопросы для самоподготовки

1. 
   В чем заключается цель количественного учета в микробиологии?
   
2. 
   В чем разница между прямыми и косвенными методами учета?
   
3. 
   Опишите практическое значение калибровочной кривой.