Микробиология. практикум микробиология ворд. Практикум министерство науки и высшего образования российской федерации

• Название: Практикум министерство науки и высшего образования российской федерации
• Анкор: Микробиология
• Дата: 03.02.2022
• Размер: 3.98 Mb.
• Имя файла: практикум микробиология ворд.docx
• Тип: Практикум; #350290
• страница: 7 из 23

Лабораторная работа № 3

Сложные и дифференцированные методы окраски фиксированных препаратов микроорганизмов

Основные теоретические положения

Сложные методы окраски предполагают использование как минимум двух красителей со стадией отмывки между ними. Обес- цвечивание может проводиться как водой, так и другими жидкос- тями – спиртами или кислотами. Классическим примером такой окраски является окраска по Граму. Все бактерии условно делят на грамположительные и грамотрицательные в зависимости от строе- ния их клеточных стенок. В данном случае прослеживается связь между строением клеточной стенки и ее способностью удерживать в себе краситель.

Грамположительныебактерииимеют многослойную клеточ- ную стенку, состоящую из пептидогликана (до 90 % сухой массы)

с «вкраплениями» тейхоевых кислот. Данная клеточная стенка одно- образна и не имеет еще одной внешней мембраны (рис. 5). При об- работке анилиновым красителем вместе с йодом клеточная стенка прокрашивается, а при последующей отмывке спиртом не теряет своей окраски.

1
2
Рис. 5. Строение клеточной стенки грамположительных бактерий:

1– слои пептидогликана (муреина) – полимера N-ацетилглюкозамина

и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных аминокислотными мостиками;

2– цитоплазматическая мембрана; 3– липотейхоевые кислоты;

4– тейхоевые кислоты
Грамотрицательные бактерии имеют сложно устроенную, но более тонкую клеточную стенку. В ней выделяют внешнюю мембрану, периплазматическое пространство, слой пептидоглика- нов и другие компоненты (липополисахариды, белки, фосфолипи- ды), в зависимости от вида бактерии (рис. 6). При окраске анили- новыми красителями с йодом клеточная стенка также прокрашива- ется, но теряет свою окраску при обработке спиртом.

Особняком стоят кислотоустойчивые бактерии, которые, по Гра- му, не окрашиваются либо окрашиваются слабо. Эти бактерии обла- дают наиболее сложно устроенной клеточной стенкой (рис. 7). В ее составе – до 40 % воска и другие липиды. Для того чтобы окрасить эти бактерии, применяют специальный метод окраски по Цилю –

1
2
3
2
4
Рис. 6. Строение клеточной стенки грамотрицательных бактерий:

1– внешняя мембрана; 2 – периплазматическое пространство;

3– тонкий слой пептидогликана; 4– цитоплазматическая мембрана;

5– порины; 6– липополисахариды
Нильсену с применением фенолового фуксина Циля. Суть этого ме- тода состоит в существенном повышении температуры в процес- се приготовления препарата. При такой температуре липиды в кле- точной стенке кислотоустойчивых бактерий растворяются, и клет- ка окрашивается. В дальнейшем при остывании препарата липиды восстанавливают свою структуру, и при отмывке концентрирован- ной серной кислотой или солянокислым спиртом бактерия окраску не теряет. На последнем этапе препарат дополнительно красится метиленовым синим для окраски сторонней микрофлоры или кле- ток и тканей макроорганизма (в клинической практике).

При дифференцированной окраске микроорганизмов окраши- вается не вся клетка в целом, а отдельные ее части – капсула, кле- точная стенка, нуклеоид, включения с различным содержимым.

Некоторые из бактерий способны образовывать покоящиеся формы – споры. Спорообразующие бактерии довольно распростра- нены в природе, что неудивительно – способность переживать вы- сокие температуры и обезвоживание является их преимуществом.

1


2

3

4
Рис. 7. Строение клеточной стенки кислотоустойчивых бактерий:

1– миколовые кислоты; 2– арабиногалактан; 3– пептидогликан;

4– цитоплазматическая мембрана; 5– гликолипиды; 6– липоарабидоманнан;

7– порин
Различают эндо- и экзоспоры в зависимости от способа их образо- вания. Эндоспоры образуются внутри клетки, а экзоспоры – кнару- жи, отпочковываясь от клетки. Окрашивать эндоспоры возможно несколькими методами, например, они слабо окрашиваются мети- леновым синим и фуксином Циля. Для более четкого прокрашива- ния применяют методы с нагреванием (вплоть до кипения) краси- теля (окраска спор и цитоплазмы по Пешкову или Шеферу – Фулто- ну). В таком случае хорошо прокрашиваются и клетка, и спора, но при последующей отмывке краситель вымывается из клетки, оста- ваясь в споре. Основывается этот метод на тех же принципах, что и окраска по Цилю – Нельсону.

В данной работе опасность представляют феноловый фуксин Циля, серная кислота и использование спиртовки для нагревания препаратов. Во избежание несчастных случаев все правила техни- ки безопасности и протоколы проведения окрасок должны соблю-

даться неукоснительно. Из двух предложенных окрасок эндоспор нужно выбрать и сделать одну.

Цель работы: сформировать у студента представления о слож- ных методах окраски бактерий и практические навыки работы в этой области.

Оборудование и реактивы

1. 
   Микроскоп, иммерсионное масло.
   
2. 
   Предметные стекла, штатив к ним.
   
3. 
   Спиртовки и зажигалки.
   
4. 
   Микробиологические петли.
   
5. 
   Фильтровальная бумага, вата, хозяйственное мыло.
   
6. 
   Источник микроорганизмов – культуры грамположительных (Clostridium, Bacillus, Staphylococcus), грамотрицательных (Escherichia, Pseudomonas, Acetobacter), кислотоустойчивых (Mycobacteriumb5) и спорообразующих бактерий (Clostridium, Bacillus).
   
7. 
   Реактивы для окраски по Граму: свежий генциановый фиоле- товый, свежий реактив Люголя для окраски по Граму, водный раст- вор фуксина или сафранина, 95% спирт.
   
8. 
   Реактивы для окраски по Цилю – Нильсену: феноловый фук- син Циля, метиленовый синий, 5–10 % раствор H₂SO₄.
   
9. 
   Реактивы для окраски эндоспор по Пешкову: метиленовый си- ний, 0,5 % раствор сафранина.
   
10. 
    Реактивы для окраски эндоспор по Шеферу – Фултону: 0,5 % водный раствор малахитового зеленого, 0,5 % раствор сафранина.
    

З а д а н и е 1 Окраска по Граму

На предметное стекло нанести культуры грамположительных организмов (Clostridium, Bacillus, Staphylococcus) с одной стороны и грамотрицательных (Escherichia, Pseudomonas, Acetobacter) – с другой. Приготовить фиксированный окрашенный препарат (см. лабораторную работу № 2).

Поместить предметное стекло в штатив для окрашивания. На- крыть мазок фильтровальной бумагой и нанести генциановый фио- летовый на 1 мин.

Убрать бумагу и слить остатки красителя, не промывая водой. Нанести на препарат раствор Люголя на 1,5–2 мин. до потем-

нения мазка.

Слить раствор Люголя, аккуратно промыть препарат водой. На 15–20 сек. поместить предметное стекло мазком в раствор

95 % спирта, вынимая его каждые 5 сек.

Аккуратно промыть препарат от спирта водой.

Не высушивая препарат, нанести на мазок водный раствор фуксина (сафранина) на 45 сек.

Смыть краситель и аккуратно промыть препарат водой.

Высушить препарат и микроскопировать его с иммерсионным объективом.

На препарате отметить грамположительные (сине-фиолетовые) и грамотрицательные (красно-розовые) клетки бактерий. В рабо- чую тетрадь внести описание процесса окраски по Граму, его тео- ретические основы и получившиеся результаты.

З а д а н и е 2

Окраска по Цилю – Нильсену

На предметное стекло внести культуры кислотоустойчивых организмов (Mycobacteriumb5) с одной стороны и некислотоустой- чивых (любые другие) – с другой. Приготовить фиксированный окрашенный препарат (см. лабораторную работу № 2).

Поместить предметное стекло в штатив для окрашивания. На- крыть образец фильтровальной бумагой, залить карболовым фук- сином Циля.

Взять препарат пинцетом. РАВНОМЕРНО разогревать всю по- верхность предметного стекла над пламенем спиртовки до появле- ния паров (пары наблюдать со стороны!), затем остудить и доба- вить красителя, если необходимо. Повторить трижды.

Убрать фильтровальную бумагу. Аккуратно поместить препарат в раствор серной кислоты на 1 мин., после этого промыть водой.

Не высушивая препарат, нанести на него метиленовый синий на 1 мин., после чего промыть водой.

Высушить препарат и микроскопировать его с иммерсионной системой.

Кислотоустойчивые бактерии окрасятся в насыщенно-красный цвет, а некислотоустойчивые – в синий. В рабочую тетрадь внести описание процесса окраски по Цилю – Нельсону, его теоретичес- кие основы и получившиеся результаты.

З а д а н и е 3

Окраска эндоспор по Пешкову

Приготовить фиксированный окрашенный препарат спорообра- зующих бактерий (Clostridium, Bacillus).

Накрыть мазок фильтровальной бумагой, залить раствором ме- тиленового синего по Леффлеру. С помощью пинцета взять препа- рат и, РАВНОМЕРНО нагревая все стекло с помощью спиртовки, довести краситель до кипения. Окрашивать 10 сек. с момента заки- пания красителя.

Аккуратно положить препарат на штатив и охладить.

Тщательно, но аккуратно отмыть его водой до обесцвечивания стекающей воды.

Окрасить препарат сафранином в течение 30 сек. Слить второй краситель и вновь промыть водой.

Высушить и микроскопировать препарат с иммерсионной системой.

Споры прокрасились при температурной обработке и не обес- цветились при отмывке водой, соответственно, они должны быть синего цвета, клетки – красного. В рабочую тетрадь внести описание процесса окраски эндоспор по Пешкову, его теоретические основы и получившиеся результаты.

З а д а н и е 4

Окраска эндоспор по Шеферу – Фултону

Приготовить фиксированный окрашенный препарат спорооб- разующих бактерий (Clostridium, Bacillus).

Накрыть мазок фильтровальной бумагой, залить раствором ма- лахитового зеленого. Взять препарат пинцетом и, равномерно нагре- вая все стекло с помощью спиртовки, добиться появления паров.

Аккуратно положить препарат на штатив и охладить.

Тщательно, но аккуратно отмыть его водой до обесцвечивания стекающей воды.

Окрасить препарат сафранином в течение 30 сек. Слить второй краситель и вновь промыть водой.

Высушить и микроскопировать препарат с иммерсионной системой.

Споры прокрасились при температурной обработке и не обес- цветились при отмывке водой, соответственно, они должны быть зеленого цвета, клетки – красного. В рабочую тетрадь внести опи- сание процесса окраски эндоспор по Шеферу – Фултону, его теоре- тические основы и получившиеся результаты.

Вопросы для самоподготовки

1. 
   На чем основывается метод окраски бактерий по Граму?
   
2. 
   За счет чего кислотоустойчивые клетки получили такое название?
   
3. 
   Какова функция эндоспор у бактерий? Какие еще покоящиеся фор- мы бактерий существуют?