Микробиология. практикум микробиология ворд. Практикум министерство науки и высшего образования российской федерации

• Название: Практикум министерство науки и высшего образования российской федерации
• Анкор: Микробиология
• Дата: 03.02.2022
• Размер: 3.98 Mb.
• Имя файла: практикум микробиология ворд.docx
• Тип: Практикум; #350290
• страница: 6 из 23

Лабораторная работа № 2

Окрашенные и фиксированные препараты микроорганизмов

Основные теоретические положения

Большинство клеток микроорганизмов в естественных усло- виях не окрашены и поэтому плохо видны в световой микроскоп, с трудом поддаются изучению. В связи с этим Р. Кох первым стал пробовать окрашивать микроорганизмы для их изучения. В настоя- щее время можно выделить следующие виды окраски:

• 
  Окраска прижизненная (витальная). Для нее используют только витальные красители, не вызывающие гибель клеток. Та- ковыми являются, например, водные растворы в концентрации 0,2–0,001 % метиленового синего, конго красного.
  
• 
  Окраскафиксированныхпрепаратов. В отличие от «живых» препаратов, фиксированные нет смысла изучать без окраски. Фик- сация включает в себя и «убийство» клеток, поэтому возможности для применения различных окрасок не ограничены. Приготовле- ние фиксированного препарата проходит в несколько стадий: при- готовление мазка, высушивание мазка, фиксация мазка в пламени горелки либо в специальных фиксирующих жидкостях, окраска.
  

Фиксация препаратов имеет несколько целей: во-первых, как уже говорилось выше, это «убийство» микроорганизмов, во-вторых, обеспечение лучшего прилипания клеток к стеклу, а в-третьих, уве- личение восприимчивости клеток к окраске за счет (опять же) их

«убийства», так как мертвые клетки окрашиваются лучше живых. Также для рассмотрения фиксированных препаратов можно ис- пользовать иммерсию и иммерсионный объектив.

Кроме этого, окраску подразделяют на следующие виды:

• 
  Простая, проходящая в одну стадию с использованием одно- го красителя; в качестве красителей обычно используют метиле- новый синий, водный раствор фуксина, водный раствор сафранина.
  
• 
  Сложная, когда окраска производится минимум двумя кра- сителями с этапом отмывки между ними. Классический пример сложной окраски – окраска по Граму (с использованием трех краси-
  

телей), другой пример, использующийся в медицинской практике, – окраска по Цилю – Нельсону.

• 
  Дифференцированная, при которой прокрашиваются опре- деленные части микроорганизмов – капсула, нуклеоид, включения, жгутики и т. д.
  

В рамках данной лабораторной работы необходимо ознако- миться с методом окраски живых препаратов дрожжей раствором Люголя для выявления включений, окраской методом негативного контрастирования живых препаратов клеток, содержащих капсулу, а также со способом приготовления фиксированного окрашенного препарата.

Включения– довольно обширное понятие, под которым объеди- няются все везикулы, существующие в бактериальных клетках. Они могут содержать в себе питательные вещества – полисахари- ды, полифосфаты, липиды, серу. Помимо запасающей функции, включения могут регулировать осмотическое давление клетки. Кро- ме того, везикулы могут содержать фотосинтетические пигменты зеленых бактерий (хлоросомы) и цианобактерий (фикобилисомы). Некоторые водные микроорганизмы имеют газовые вакуоли. Окра- шиваются включения опять-таки в зависимости от их содержи- мого – это раствор Люголя для полисахаридов, судан III либо су- дан черный для липидных гранул, метиленовый синий для поли- фосфатов (волютин).

Капсулы– структура, вырабатываемая бактериями на поверх-

ности клеток. Она служит еще одним защитным слоем как от фи- зических, так и от иммунологических воздействий. По природе своей гидрофильна, состоит из большого количества воды, связан- ной с полисахаридами и полипептидами. Капсула вследствие сво- их свойств практически не окрашивается. Окраску капсул можно провести методами негативного окрашивания с помощью туши – методами окраски мазка по Хиссу, Бурри – Гинсу или Дюгиду. Также существуют методы окраски по Романовскому – Гимзе и Михину с использованием красящих веществ.

Цель работы: изучить методы окраски микроорганизмов и спо- собы приготовления фиксированного окрашенного препарата.

Оборудование и реактивы

1. 
   Микроскоп, иммерсионное масло.
   
2. 
   Предметные стекла, штатив к ним.
   
3. 
   Спиртовки и зажигалки.
   
4. 
   Микробиологические петли.
   
5. 
   Фильтровальная бумага, вата, хозяйственное мыло.
   
6. 
   Чистые культуры микроорганизмов, в том числе образующих капсулу.
   
7. 
   Суспензия пекарских дрожжей.
   
8. 
   Красители: водный раствор сафранина, метиленовый синий, тушь, раствор Люголя.
   

З а д а н и е 1 Окраска включений

В асептических условиях внести на покровное стекло каплю культуры дрожжей.

Внести в суспензию клеток каплю раствора Люголя. Накрыть препарат покровным стеклом и микроскопировать.

Покровным стеклом нужно накрывать аккуратно, не допуская по- явления воздушных пузырей.

Отметить окрашивание гликогеновых включений дрожжей, внести в рабочую тетрадь процесс приготовления препарата и по- лучившийся результат.

З а д а н и е 2 Окраска капсул

Нанести на предметное стекло каплю туши; промыть и про- жечь петлю.

В асептических условиях внести в тушь каплю исследуемых микроорганизмов, имеющих капсулы. Распределить полученную смесь по стеклу петлей.

Накрыть покровным стеклом.

На темном фоне должны быть видны клетки, окруженные не- прокрашенной капсулой.

Внести в рабочую тетрадь процесс приготовления препарата и получившийся результат.

З а д а н и е 3

Фиксированный окрашенный препарат

Обезжирить чистое предметное стекло мылом.

В асептических условиях нанести на него каплю воды, в кото- рую петлей (также в асептических условиях) внести культуру бак- терий (аналогично препарату «раздавленная капля»).

Этой же петлей распределить полученную суспензию макси- мально тонким слоем по поверхности стекла.

Высушить мазок, желательно при комнатной температуре. Если все было сделано правильно на этапе приготовления мазка (то есть было нанесено небольшое количество воды и распределено тон- ким слоем), то высушивание происходит быстро.

Зафиксировать мазок. Взять предметное стекло двумя пальца- ми и, держа предметное стекло мазком вверх, провести его через верхнюю часть пламени спиртовки (наиболее горячую) три раза.

Важно! Проводить предметное стекло через пламя необходи- мо и не слишком быстро (в этом случае не произойдет фикса- ция), и не слишком медленно (в этом случае велик шанс дефор- мировать клетки).

Поместить препарат в штатив для окрашивания и нанести на него краситель. Выдержать 1 мин. (время может варьироваться в зависимости от красителя).

По истечению времени промывать препарат водой до тех пор, пока стекающая вода не обесцветится.

Микроскопировать с объективом 100  с использованием им-

мерсионного масла. Отметить морфологию исследуемых клеток, сравнить окрашенный фиксированный и препарат с прижизненной окраской (рис. 4).

Внести в рабочую тетрадь процесс приготовления фиксиро- ванного окрашенного препарата. Подобная методика является ба- зовой для приготовления наиболее распространенных сложных окрасок.

Рис. 4. Приготовление фиксированного окрашенного препарата

Вопросы для самоподготовки

1. 
   Какие процессы входят в понятие фиксации препарата?
   
2. 
   Какие преимущества и недостатки есть у фиксированных препаратов?
   
3. 
   Назовите основные функции капсул у бактерий.