Микробиология. практикум микробиология ворд. Практикум министерство науки и высшего образования российской федерации
 Скачать 3.98 Mb.
|
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВВ этот блок входит последовательность лабораторных работ по выделению и описанию чистой культуры бактерий, посвященных выполнению следующих задач: приготовление питательных сред и оборудования, постановка накопительной культуры, выделение чистой культуры, идентификация бактерий. Студенты должны рас- пределиться по бригадам, в которых они будут работать практичес- ки до конца семестра. При выполнении лабораторной работы № 5 каждая бригада выбирает номер группы микроорганизмов, с кото- рой будет работать. Конечной целью является идентификация этой группы на основании всех полученных данных. Также в этот же блок заданий были включены работы по санитарной микробиоло- гии и определению чувствительности бактерий к антибиотикам*. Лабораторная работа № 5Приготовление питательных сред и оборудования, их стерилизацияОсновные теоретические положенияВыращивание микроорганизмов – основа всей микробиологии, поэтому правильный подбор и подготовка среды – крайне важный навык. Существует несколько классификаций сред. По консистенции:  Жидкие среды готовятся добавлением в воду (дистиллиро- ванную или водопроводную) различных органических и неоргани- ческих веществ. Исторически такой тип сред был первым способом * При подготовке заданий этого раздела были использованы методические разработки, представленные в «Практикуме по микробиологии», см.: Нетрусов А. И.Практикум по микробиологии : учеб. пособие для вузов. М. : Академия, 2005. 608 с. выращивания микроорганизмов. До сих пор жидкие среды исполь- зуются во многих аспектах микробиологии. Полужидкие среды получают путем добавления в жидкую среду 0,5 % агара. Твердые питательные среды. Первым их начал применять в широкой практике Р. Кох. Твердые питательные среды получают путем добавления загустителей (уплотнителей) к жидким средам. В качестве загустителей служат агар-агар, желатин и силикагели. Агар– сложный полисахарид, состоящий из смеси агарозы и агаро- пектина и получаемый из бурых и красных водорослей. Вследствие некоторых своих особенностей он занял лидирующее положение среди остальных загустителей. К числу таких преимуществ можно отнести относительно высокую температуру плавления (95–100 °С), неспособность большинства микроорганизмов использовать его в ка- честве питательного субстрата и относительную дешевизну. Агар добавляют в концентрации от 1,5 до 3 %. Желатин – продукт не- полного гидролиза белка коллагена, выделяемого из кожи, костей и хрящей животных. Также используется в качестве загустителя, но гораздо реже по причинам низкой температуры плавления (25–30 °С) и большого количества микроорганизмов, обладающих протеолитической активностью и, соответственно, разлагающих желатин. Силикагель– неорганическое вещество, представляю- щее собой высушенные перенасыщенные растворы кремниевых кислот. Так как органических веществ этот загуститель не содер- жит, его используют преимущественно для выращивания хемолито- автотрофов. Сыпучиепитательныесредыиспользуются в микробиологи- ческой промышленности для хранения культур микроорганизмов. Чаще всего в качестве сыпучих сред выступают отруби или квар- цевый песок, пропитанные раствором питательной среды. По природе компонентов: Натуральныепитательные средысостоят исключитель- но из продуктов естественного происхождения – крови, молока, овощных, дрожжевых или мясных отваров. Натуральные среды отличаются широким спектром веществ в своем составе, универ- сальностью, но у них есть существенные недостатки – невозмож- но точно установить их качественный или количественный состав. Таким образом, нельзя их использовать для изучения метаболиз- ма микроорганизмов. Полусинтетическиепитательныесредыполучают добавле- нием различных синтетических компонентов к вышеперечислен- ным натуральным средам. Синтетические питательные среды состоят исключитель- но из точных навесок заранее известных и чистых органических и/или неорганических веществ. Состав подобных сред всегда точ- но известен, их возможно использовать для изучения метаболизма. Кроме этого, некоторые микроорганизмы растут преимуществен- но именно на синтетических средах. По назначению: Универсальные питательные среды используются для вы- ращивания широкого спектра микроорганизмов. Если сам микро- организм не требователен к составу питательных сред, то он ста- бильно будет расти на универсальных питательных средах. Подоб- ные питательные среды чаще всего являются также натуральными по своему составу. Элективные питательные среды используются для выделе- ния культур микроорганизмов из естественных ниш. Своим соста- вом они благоприятствуют одним микроорганизмам и препятству- ют росту других. Таковой средой является среда Эшби, используе- мая для выращивания азотфиксирующих бактерий. Так как сама среда не содержит в себе источника азота, то только бактерии, спо- собные фиксировать его из атмосферы, способны расти на ней. Дифференциально-диагностическиепитательныесредыиспользуют в медицинской и санитарной микробиологии для ви- дового/родового определения микроорганизмов среди узкого спект- ра патогенных, условно-патогенных и санитарно-показательных микроорганизмов. Дифференциация происходит на основе их мета- болизма. Среда подбирается таким образом, чтобы при росте опре- деленного микроорганизма изменялась pH и, соответственно, ме- нялся цвет индикатора, добавленного в среду. Такой средой является, например, агар Клиглера, который способен дифференцировать пять видов различных микроорганизмов по их способности фер- ментировать глюкозу и лактозу, выделять газ и сероводород. Питательная среда должна содержать в себе источник энер-гии, источник углерода, источник азота, а также для некоторых бактерий факторы роста. Те бактерии, которые могут самостоя- тельно синтезировать все необходимое для собственного роста, на- зывают прототрофами. Бактерии, требующие для своего суще- ствования определенных факторов роста, называют ауксотрофами. В качестве факторов роста могут выступать отдельные амино- кислоты, витамины, пурины, пиримидины и др. Как уже описывалось ранее, в основе всей микробиологичес- кой практики находится стерильность условий работы. Создание асептических условий – необходимое требование для правильной работы в микробиологических лабораториях. Существует множе- ство способов обеспечить подобные условия. Термическая стерилизация (методы, основанные на высоких температурах): Фламбирование – обработка рабочего инструмента в пламе- ни. Подобным образом обрабатываются микробиологические пет- ли, иглы, шпатели, горлышки посуды непосредственно перед рабо- той. Фламбирование происходит в верхней, самой горячей части пламени. Обработка сухим жаром (180 °С, 2 ч) в сухожаровых шка- фах. Применяется для пустой стеклянной и фарфоровой посуды, термоустойчивых порошков. Автоклавирование– обработка насыщенным паром под дав- лением. Осуществляется в специальных приборах – автоклавах, в которых создается дополнительное давление, позволяющее про- водить обработку паром температурой выше 100 °С. Чаще всего для стерилизации в микробиологической практике используют тем- пературы от 112 до 135 °С. Для этого в автоклавах создается допол- нительное давление в 0,5–1,5 ати (атмосферы избытка). Автоклави- рованием стерилизуют в первую очередь микробиологические сре- ды. Прежде чем стерилизовать колбы со средами, необходимо их правильно упаковать – подобрать пробку, закрепить ее, подписать колбу. Количество среды в колбе не должно превышать треть ее объема. Таким образом, 100 мл среды следует стерилизовать в кол- бе объемом 250 мл. Тиндализация– особый способ температурной стерилизации сред и различных веществ, которые нельзя стерилизовать при тем- пературах выше 100 °С. Тиндализацию осуществляют текучим па- ром в кипятильниках Коха или в незакрытых автоклавах. Обра- ботку проводят в течение 10–15 мин., после чего среды на сутки ставят в благоприятные условия – в термостат при 30 °С. В это время споры, которые выжили при обработке текучим паром, про- растают, становясь вегетативными клетками. Спустя сутки проце- дуру повторяют. Проделав весь цикл несколько раз, можно добиться полного исчезновения спор. Пастеризация– однократное нагревание объекта стерилиза- ции до 60–70 °С в течение 10–15 мин. Подобный метод не позволя- ет избавиться от спор микроорганизмов и стерильности не обеспе- чивает. Пастеризацию используют в тех случаях, когда объект не вы- держивает нагревания выше 70–80 °С. Чаще всего пастеризацию используют для вина, пива, молока и т. д. Кипячение используется редко для стерилизации металли- ческого и стеклянного инструмента в течение 30–40 мин. Холодная стерилизация (без повышения температуры): Стерилизациихимическими веществамичаще всего подвер- гаются поверхности, и реже – инструмент. В качестве дезинфици- рующих средств может выступать множество соединений – хлор- содержащие, спирты, ПАВ, третичные амины, соединения серебра, перекисные соединения и многое другое. Для каждого дезинфици- рующего средства есть свои режимы обработки и другие особенности. Стерилизациигазообразнымивеществамиподвергается лабораторная посуда, не выдерживающая высоких температур – вся посуда из термолабильного пластика, например. Стерилизация осуществляется в специальных приборах, посуду также необходи- мо корректно упаковать. В качестве стерилизующих газов исполь- зуют оксид этилена, формальдегид, озон. Стерилизации облучением подвергаются в первую очередь помещения, рабочее место (в ламинарном боксе) и поверхности. Стерилизацию проводят с помощью ультрафиолетового излуче- ния, и реже – некоторых других его видов. Стерилизация фильтрованием применяется для тех соеди- нений, которые не выдерживают даже небольшого нагревания. В качестве бактериальных фильтров используют соединения с раз- мерами пор не более 0,7 мкм. Особенное распространение получи- ли мембранные фильтры на основе нитроцеллюлозы. Цель работы: изучить с теоретической и практической точек зрения подготовительный этап микробиологической работы – приготовление и стерилизацию питательных сред и оборудования, а также особенности культивирования микроорганизмов. Оборудование и реактивыЧашки Петри, пробирки, штативы к ним, шпатели. Газеты/бумага для упаковки, ватные пробки. Реактивы: Nutrient Broth (мясопептонный бульон), мочеви- на, сахароза, K2HPO4, MgSO4, NaCl, K2SO4, CaCO3, глюкоза, агар, сусло. Весы, кисточки, шпатели. Автоклав, сухожаровой шкаф. Ход работыНа каждую бригаду упаковать четыре чашки Петри, шпате- ли для стерилизации. На бригаду приготовить среды в зависимости от выбранно- го номера. В рабочую тетрадь оформить отчет с краткой теорией, номе- ром бригады, составом и количеством собранной среды (как в г/л, так и пересчитанной). Показать отчет преподавателю. Состав среды указан в граммах на литр, также указано, сколь- ко пробирок/колб и какого объема необходимо приготовить. В пер- вую очередь необходимо произвести расчет того, сколько, чего и в какой посуде необходимо приготовить. Нужно обратить вни- мание на то, что в большинстве случаев требуются как жидкие, так и твердые питательные среды. Указывается состав жидкой сре- ды, для получения твердой среды необходимо добавить 2 % агара. NutrientBroth– готовая коммерческая среда, представляю- щая собой высушенный мясопептонный бульон. Б р и г а д а 1 Среда (г/л): NutrientBroth– 13, мочевина – 100 (отсутствие в со- ставе агара говорит о том, что среда эта жидкая!). Приготовить две пробирки по 5 мл жидкой среды в каждой. Среда (г/л): NutrientBroth– 13, мочевина – 20, агар – 20. Приготовить колбу на 250 мл со 100 мл агаризованной среды. Приготовить две пробирки с 5 мл агаризованной среды в каждой. Колбы закрыть ватными пробками и упаковать в газету, про- бирки также закрыть ватными пробками, поставить в штатив. Б р и г а д а 2 Среда (г/л): сахароза – 20, K2HPO4 – 0,2, MgSO4 – 0,2, NaCl – 0,2, K2SO4 – 0,1, CaCO3 – 5,0, агар – 20,0. Приготовить две колбы на 250 мл со 100 мл и две пробирки с 5 мл среды. Упаковать две дополнительные чашки Петри. Колбы закрыть ватными пробками и упаковать в газету, про- бирки поставить в штатив и также упаковать в газету. Б р и г а д ы 3 и 4 Среда: Nutrient Broth – 6,5 г в 500 мл воды смешать с 500 мл сусла, агар – 20 г. Приготовить колбу на 250 мл со 100 мл среды и две пробирки с 5 мл среды в каждой. Колбы закрыть ватными пробками и упаковать в газету, про- бирки также закрыть ватными пробками и поставить в штатив. Б р и г а д а 5 Среда (г/л): NutrientBroth– 13 Приготовить две колбы на 100 мл с 30 мл среды в каждой. Отсутствие в составе агара говорит о том, что среда эта жидкая! Среда (г/л): NutrientBroth– 13, агар – 20. Приготовить две пробирки с 5 мл агаризованной среды. Колбы закрыть ватными пробками и упаковать в газету, про- бирки также закрыть ватными пробками и поставить в штатив. Б р и г а д а 6 Среда 5 (г/л): NutrientBroth– 13, агара – 20, глюкозы – 20. Приготовить колбу на 250 мл со 100 мл агаризованной среды. Приготовить две пробирки с 5 мл агаризованной среды. При- готовить чистую колбу на 100 мл. Приготовить для стерилизации три колбы на 50 мл. Закрыть их ватными пробками и упаковать в газету, пробирки поставить в штатив и также упаковать в газету. Вопросы для самоподготовкиЧто входит в понятие «холодные методы стерилизации»? В чем разница между прототрофами и ауксотрофами? Какие загустители сред используются в микробиологии? |