Микробиология. практикум микробиология ворд. Практикум министерство науки и высшего образования российской федерации

• Название: Практикум министерство науки и высшего образования российской федерации
• Анкор: Микробиология
• Дата: 03.02.2022
• Размер: 3.98 Mb.
• Имя файла: практикум микробиология ворд.docx
• Тип: Практикум; #350290
• страница: 14 из 23

Лабораторная работа № 10

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам

Основные теоретические положения

История антибиотиков началась в XX в. Первыми обнаружил антибактериальные свойства экстрактов плесневых грибов италья- нец Винченцо Тиберио, но его открытие не приняли во внимание. Первооткрывателем первого антибиотика пенициллина считается Александр Флеминг. Свое открытие он сделал фактически случай- но в 1928 г., но не смог выделить достаточно чистый пенициллин. Только в 1940–1941 гг. Эрнсту Чейзу и Говарду Флори удалось вы- делить чистый пенициллин в достаточном количестве и успешно пролечить пациента. После этого производство пенициллина было поставлено на поток, а ученые по всему миру стали искать веще- ства, обладающие подобными свойствами. В 1945 г. Флемингу, Чейзу и Флори была присуждена Нобелевская премия в области физиологии и медицины за открытие пенициллина и его целеб- ного воздействия при различных инфекционных болезнях.

Массовое применение пенициллина во Вторую мировую войну и позже спасло миллионы жизней. Но вскоре обнаружилось, что

бактерии способны приобретать устойчивость к антибиотикам. Осо- бенности генетической системы бактерий, способность к гори- зонтальному переносу генов и неконтролируемый прием антибио- тиков людьми привели к быстрому распространению устойчивых к антибиотикам возбудителей различных заболеваний. И до сих пор продолжается «гонка вооружений» между учеными, ищущими новые антибиотики и модифицирующими старые, и бактериями, успешно к этим антибиотикам приспосабливающимися. Именно поэтому вопрос о методах определения чувствительности бактерий к антибиотикам очень актуален.

Обычно данные методы используются для достижения двух целей:

• 
  Определение чувствительности клинических изолятов для на- значения адекватной антибиотикотерапии.
  
• 
  Определение чувствительности музейных штаммов и клини- ческих изолятов для тестирования перспективных противомикроб- ных препаратов.
  

Антибиотиками в классическом смысле называют вещества природного происхождения, способные в малых концентрациях подавлять рост микроорганизмов или вызывать их гибель. Также существуют синтетические антибактериальные средства, отличаю- щиеся от антибиотиков происхождением. Как видно из определе- ния, антибиотики могут обладать бактериостатическим (подав- лять рост микроорганизмов) и бактерицидным (вызывать гибель микроорганизмов) действием.

Антибиотики классифицируют по механизму действия следую- щим образом:

• 
  Подавляющие синтез клеточных стенок бактерий – бета-лак- тамы (пенициллины, цефалоспорины), гликопептиды (ванкомицин).
  
• 
  Нарушающие функции цитоплазматической мембраны – по- лимиксины.
  
• 
  Нарушающие синтез белка – аминогликозиды, тетрацикли- ны, макролиды, фениколы.
  
• 
  Подавляющие синтез нуклеиновых кислот – фторхинолоны, сульфаламиды.
  

Основной целью определения чувствительности является вы- явление минимальной ингибирующей (подавляющей) концентра- ции антибиотика – МИК (МПК). Методы определения чувстви- тельности к антибиотикам подразделяют на несколько групп:

1. 
   Диффузные, основанные на миграции антибактериально- го препарата, обычно с твердотелой фазы на питательные среды с бактериями.
   

• 
  
  Метод дисков. На твердую среду в чашке Петри вносят оп- ределенный объем бактериальной культуры (обычно соответ- ствующий 0,5 стандарту мутности по МакФарланду, что равно 1–2  10⁸ КОЕ/мл). Затем помещают на поверхность этой среды диски с известными концентрациями раствора антибиотика. Далее происходит диффузия антибиотика в агар. Если бактерия чув- ствительна к такой концентрации данного антибиотика, то ее рост останавливается, то есть вокруг диска образуется зона подавления роста микроорганизмов (рис.16). Чем она больше, тем большей эф- фективностью обладает антибиотик. Отсутствие зоны подавления роста говорит о полной резистентности данного штамма микро- организма к конкретной концентрации исследуемого антибиотика.
  

Рис. 16. Диско-диффузионный метод определения чувствительности к антибиотику:

1и 3– зоны подавления роста микроорганизма;

2– отсутствие зоны подавления роста
E-тесты основаны на том же принципе, что и метод дисков, разница лишь в том, что на один отрезок бумаги нанесены антибио- тики с возрастающей концентрацией. Рост бактерий вокруг зоны

с низкой концентрацией антибиотика ничем не ограничен, но по мере приближения к высоким концентрациям из-за диффузии антибио- тика в агар зона роста эллипсоидно уменьшается (рис. 17). В месте окончания зоны роста, то есть ее пересечения с полоской E-теста, находится минимальная ингибирующая концентрация данного ан- тибиотика к данному изоляту бактерий.

Е-тесты используются только для выяснения чувствительнос- ти неизвестных изолятов к известным антибиотикам. В отличие от диско-диффузионного метода, их можно купить только в готовом виде с уже нанесенным антибиотиком.





Рис. 17. Метод Е-тестов

2. 
   Методы разведения, основанные на последовательном раз- ведении раствора исследуемого вещества и исследовании его дей- ствия на жидкие или твердые культуры микроорганизмов. В слу- чае с жидкими культурами готовят серию разведений антибиотика в питательной среде, после чего в эту питательную среду вносят сус- пензию культуры клеток (обычно соответствующую стандарту мут- ности 0,5 МакФарланда). Среды инкубируют сутки при 37 °С и смот- рят на их помутнение. При его наличии делают вывод, что данная концентрация антибиотика неэффективна против данного штам- ма микроорганизма. Первая же незамутненная пробирка указыва- ет на минимальную ингибирующую концентрацию антибиотика.
   

Цель работы: освоить различные методы выявления чувстви- тельности к антибиотикам.

Оборудование и реактивы

1. 
   Стерильные растворы антибиотиков.
   
2. 
   Чашки Петри с питательной средой.
   
3. 
   Пробирки с жидкой стерильной питательной средой.
   
4. 
   Стерильные бумажные диски.
   
5. 
   Культуры грамположительных и грамотрицательных бактерий.
   

Ход работы

1. 
   Приготовление стандарта мутности 0,5 по МакФарланду. Приготовить 0,5 мл BaCl₂ в концентрации 0,048 моль/л (1,175 %
   

раствор BaCl₂· 2H₂O).

Перемешивая, медленно добавить 99,5 мл раствора 0,18 моль/л (1 %) H₂SO₄ до получения однородного раствора.

Проверить правильность приготовления раствора на спектро- фотометре: кювета 1 см, длина волны 625 нм. В таких условиях поглощение должно составлять 0,08–0,1.

Разлить полученный раствор по 5 мл в пробирки с плотно за- крывающимися крышками во избежание испарения. Пробирки должны быть такого же диаметра, как и те, в которых будет нахо- диться суспензия исследуемой культуры.

2. 
   Установление чувствительности диско-диффузионным методом.
   

В асептических условиях равномерно рассеять суспензию ис- следуемой культуры по поверхности чашек Петри. Следует исполь- зовать инокулюм, соответствующий по оптической плотности 0,5 по стандарту МакФарланда. В контрольной чашке Петри без добав- ления антибиотиков через сутки должен вырасти «газон» – культу- ра должна покрыть всю поверхность питательной среды.

Стерильным пинцетом поместить диски с различными кон- центрациями антибиотиков на поверхность чашек Петри. Диски не должны располагаться ближе 20 мм от края чашки. Их следует аккуратно прижать пинцетом к поверхности агара и не перемещать после нанесения.

Перевернуть чашки Петри и инкубировать их в термостате при 35 °С сутки.

На следующий день просмотреть чашки Петри на наличие зон отсутствия роста бактерий вокруг дисков, сравнить с контрольны- ми образцами. Измерить диаметр этих зон, занести данные рабо- чую тетрадь.

Построить график зависимости диаметра зоны отсутствия рос- та бактерий от концентрации антибиотика, рассчитать МИК. Внес- ти данные в табл. 5.

Т а б л и ц а 5

МИК определенных антибиотиков для бактерий

Бактерия	Антибиотик	МИК (метод дисков)	МИК (метод разведений)
E.coli	Ампициллин Рифампицин Бензилпенициллин
Bacillusspp.	Ампициллин Рифампицин Бензилпенициллин

2. Установление чувствительности методами разведения. Приготовить серию разведений рабочего раствора антибиоти-

ка в питательной среде. Для этого самплером добавить 0,5 мл ис- ходного раствора антибиотика к 0,5 мл жидкой питательной среды, тщательно перемешать, поменять наконечник и повторить проце- дуру со следующей пробиркой. Из последней пробирки 0,5 мл сле- дует удалить.

Приготовить суспензию культуры клеток, эквивалентную 0,5 по стандарту мутности МакФарланда.

В асептических условиях инокулировать каждую пробирку с пи- тательной средой и антибиотиком 0,5 мл изготовленной суспензии.


69
Инкубировать пробирки в термостате при 37 °С 18–24 ч. По- ставить отрицательный контроль для каждого антибиотика и хра- нить его в холодильнике при +4 °С.

Каждую пробирку визуально на свету сравнить с контрольной, хранившейся в холодильнике. Отметить МИК данного антибиоти- ка по отношению к данному штамму бактерии по отсутствию види- мого помутнения среды, внести данные в таблицу (табл. 5).

По результатам работы написать отчет.

Вопросы для самоподготовки

1. 
   В чем причины появления бактерий, устойчивых к антибиотикам?
   
2. 
   Какими действиями по отношению к бактериям обладают анти- биотики?
   
3. 
   Что такое Е-тест?