При этом приблизительно половина молекулы ре концевая часть, экспонирована наружу, а концевая спрятана 481 Биомедицинская химия, 2016 том 62, вып. 5, с. 481495. Обзоры
 Скачать 1.5 Mb.
|
|
ПЕПТИДНЫЙ ФАГОВЫЙ ДИСПЛЕЙ задачей. Во-вторых, системы на нитчатых фагах являются более простыми и дешёвыми в использовании и адаптации к различным задачам, особенно для начинающих исследователей. Системы на нитчатых фагах, например, не требуют специализированных систем упаковки для получения фагового потомства, а также гомологичных или сайт-специфичных систем рекомбинации, необходимых для введения чужеродного генетического материала, характерных для систем на фаге лямбда или фаге Т [15, 16]. В нашей работе, мы остановимся на пептидном ФД на основе нитчатых фагов, рассмотрим различные варианты пептидных фаговых библиотек, приведём примеры использования пептидного ФД в современных биотехнологических и биомедицинских исследованиях. Фаговый дисплей белков и антител представляют собой огромные области исследований, и в данном обзоре не рассматриваются. АФФИННАЯ СЕЛЕКЦИЯ ПЕПТИДОВ ИЗ ФАГОВЫХ БИБЛИОТЕК (БИОПЭННИНГ) Схема поиска пептидов высокой аффинности к различным мишеням с помощью метода ФД представлена на рисунке 3. Сначала молекулярную мишень иммобилизуют на твёрдую поверхность. Мишенью могут быть индивидуальные белки, вирусные частицы, бактериальные или раковые клетки. Для иммобилизации мишеней белковой природы используют различные пластиковые поверхности (ячейки планшетов для иммуноанализа, специальные иммунологические пробирки, а также специально обработанные магнитные микрочастицы). Затем к иммобилизованной мишени добавляют фаговую библиотеку, миллиарды различных вариантов фагов, каждый из которых несет на своей поверхности свой вариант пептида. После инкубации смеси фаги с высокой аффинностью к данной мишени связываются, а остальные остаются в растворе. Затем твёрдая поверхность интенсивно промывается буферным раствором с детергентом, и основная часть фагов смывается. Оставшиеся связанные фаги элюируют растворами с низким (2,2) или высоким значениями рН (10,0), содержащими туже молекулярную мишень, что была использована для иммобилизации [7] и др. Нитчатые фаги обладают повышенной устойчивостью к таким воздействиями сохраняют свою жизнеспособность [6]. Элюаты, содержащие селектированные фаги, используют для заражения штаммов Е. сои амплификации. Затем такая обогащенная библиотека используется в следующем раунде селекции. После 4-5 раундов библиотеку рассевают, получают индивидуальные фаговые клоны и анализируют на связывание с молекулярной мишенью. ДНК позитивных вариантов секвенируют и определяют аминокислотные последовательность связывающих Кузьмичева, Белявская 485 Рисунок 3. Схема метода аффинной селекции (биопэнинга) фагов, специфично связывающих молекулярные мишени. К иммобилизованной мишени добавляют фаговую библиотеку. После отмывания на поверхности остаются фаги, специфично связывающие мишень, которые затем элюируют, размножают и используют в последующих раундах селекции. Индивидуальные клоны анализируют на связывание, ДНК секвенируют и определяют аминокислотные последовательности специфичных пептидов. Подробности в тексте. пептидов. Обычно это целое семейство пептидов сходного строения, а общие аминокислоты в таком семействе пептидные мотивы) являются определяющими в аффинном связывании. 5. ФАГОВЫЕ ПЕПТИДНЫЕ БИБЛИОТЕКИ Рассмотрим более подробно типы комбинаторных пептидных фаговых библиотек. Известно, что любой из пяти фаговых поверхностных белков может быть использован для экспонирования пептидов [7, однако преимущественное распространие получили библиотеки на основе белков р и р [6, 8, На рисунке 4 представлены основные типы пептидных библиотек. Они различаются по двум основным параметрам 1) количеством копий рекомбинантного белка с экспонированным чужеродным белком по отношению к белку дикого типа на одну фаговую частицу 2) количеством векторных систем, обеспечивающих такое экспонирование. В вариантах 3 и 8 используется только один вектор – геном фага, при этом каждая копия белка р или р является рекомбинантной и несёт чужеродный пептид. Для белка р это 5 копий, а для белка р – до 4000 копий на одну фаговую частицу [6]. В вариантах 33 и 88 геном фага несёт две копии генов белков р или р при этом одна копия дикого типа, другая – рекомбинантная, кодирующая чужеродный пептид. В результате получаются фаги мозаичного типа. В вариантах 3+3 и 8+8 [21, 22] также образуются фаги мозаичного типа, но достигается это совместными действиями двух векторов фагмиды и фага-помощника. При этом рекомбинантный ген с чужеродным фрагментом располагается на фагмиде – плазмиде, которая несет фрагмент фагового генома, отвечающий за упаковку фагмидной ДНК в фаговую частицу. Белок дикого типа р или р обеспечивается присутствием фага-помощника (M13KO7 или, который имеет дефект в системе репликации собственной ДНК [7]. В результате совместных действий двух векторов в бактериальной клетке образуются фаговые частицы мозаичного типа, ДНК которых преимущественно представлена фагмидной ДНК с чужеродным генома количество ДНК фага-помощника снижено на два порядка. В таблице 1 представлены некоторые варианты различных фаговых пептидных библиотек, созданных в разных лабораториях. ПЕПТИДНЫЙ ФАГОВЫЙ ДИСПЛЕЙ 486 Рисунок 4. Типы фаговых пептидных комбинаторных (рандомизованных) библиотек варианты 3, 33, 3+3, 8, 88 и Рекомбинантные гены и соответственно рекомбинантные поверхностные белки (р и р) выделены чёрным цветом. Подробности в тексте Для успешного поиска пептидов с высокой аффинностью к молекулярным мишеням нужны представительные библиотеки, включающие миллиарды всевозможных пептидов. Их получают клонированием олигонуклеотидов структуры (NNK)n в состав гена поверхностного белка, где n – количество триплетов, N – смесь нуклеотидов A, G, C, T в равных долях, а К – смесь нуклеотидов G и Т в равных долях. Такие структуры позволяют кодировать всевозможные сочетания 20 аминокислот в пептидах с помощью триплетов, избегать двух стоп-кодонов ТАА и оставляя только один стоп-кодон А [7, Такие пептидные библиотеки получили название комбинаторных или рандомизованных (от английского random – случайный. Для того чтобы каждый теоретически возможный вариант был представлен в мерной пептидной библиотеке, требуется библиотека имеющая не менее 20 6 =6,4 ´10 7 клонов, для мерной библиотеки потребуется уже 9 =5,12 ´10 клонов. При современных техниках клонирования создать представительную библиотеку в 10 8 -10 независимых клонов достаточно легко, а вот уже в 10 10 -10 клонов – сложно, поэтому пептидные библиотеки, как правило, состоят из 10 8 -10 независимых клонов, а в смеси, используемой для аффинной селекции пептидов, представлены около 100 копиями каждого варианта. В х годах прошлого века в лаборатории Smith на основе фагового вектора fd-tet были созданы рандомизованных пептидных библиотек (табл. библиотеки 1-12). Фаг fd-tet имел мутацию, приводящую к его медленному воспроизводству в бактериальной клетке, что уменьшало селективное давление на клетку и сохраняло разнообразие фаговых вариантов. В двух библиотеках чужеродный пептид был представлен 5 копиями в составе минорного белка р (вариант 3), одна библиотека была ландшафтного типа, где все 4000 копий мажорного белка р несли на конце мерный пептид (вариант 8) [6], и 9 библиотек было мозаичного типа (вариант 88): 150 копий пептида (линейного или циклического) были экспонированы на фаговой поверхности в составе рекомбинантного белка р8, тогда как остальные копии р были дикого типа. На наш взгляд, библиотеки формата 88 являлись наиболее универсальными и удачными, они стали источником множества биоспецифичных пептидов, полученных разными исследователями, в том числе и нами при картировании группоспецифического гемаглютинирующего домена гликопротеина Е-2 альфавирусов [23, 24]. За счёт большого количества копий (150 на вирион) достигалось более сильное (авидное) связывание с мишенью, что облегчало их отбор в раундах аффинной селекции по сравнению с вариантами на основе белка р. За счёт мозаичности строения капсида пептиды не являлись жёстко ориентированными в структуре капсида. Пептиды, отобранные из библиотек формата 88, успешно связывали молекулярную мишень, находясь как на поверхности фаговой частицы, таки в виде свободных пептидов. Коммерческие аналоги библиотек варианта 88 находятся в стадии разработки. Две коммерческие рандомизованные пептидные библиотеки (табл. 1, библиотеки 15 и 16) были созданы фирмой “New England Biolabs”. Библиотеки независимых клонов каждая) созданы на основе Кузьмичева, Белявская 487 Таблица 1. Типы комбинаторных пептидных фаговых библиотек Примечание: * - http://www.biosci.missouri.edu/smithGp/ ** - Название библиотеки Структура пептида Тип библиотеки Создана/Литературный источник f3-6 ADGAX6 3 J.K. Scott, G.P. Smith [10] 2 f3-15 ADGAX15 3 G.P. Smith с соавт.* 3 f88-15 X15 88 G.P. Smith с соавт. * 4 f88-Cys0 AX5CCX5 88 G.P. Smith с соавт. * 5 f88-Cys1 AX5CXCX5 88 G.P. Smith с соавт. * 6 f88-Cys2 AX5CX2CX5 88 G.P. Smith с соавт. * 7 f88-Cys3 AX5CX3CX4 88 G.P. Smith с соавт. * 8 f88-Cys4 AX4CX4CX5 88 G.P. Smith с соавт. * 9 f88-Cys5 AX4CX5CX4 88 G.P. Smith с соавт. * 10 f88-Cys6 AX4CX6CX4 88 G.P. Smith с соавт. * 11 f88-LX6 XCX6CX 88 G.P. Smith с соавт. * 12 f8-8 AX 8 8 V. Petrenko с соавт. [19] 13 PGGX 5 GGPG PGGX 5 GGPG 3+3 D.J. Matthews с соавт. [15] 14 f8-9 AX 9 8 G. Kuzmicheva с соавт. [20] 15 Ph.D.™-12 X 12 3 New England Biolabs ** 16 Ph.D. ™ -C7C CX 7 C 3 New England Biolabs ** 17 pVIII-9aa, X 9 8+8 F. Felici с соавт. [16] 18 pVIII-12aa X 12 8+8 F. Felici с соавт. [16] бактериофага M13 и минорного белка р. Библиотека представлена мерным линейным пептидом. В библиотеке Ph.D.™-C7C мерный рандомизованный пептид является циклическим. Из этих двух библиотек получено огромное количество пептидных лигандов иммунодоминантные эпитопы различных белков [25, 26]; пептиды, обладающие антимикробной активностью [27] пептиды специфично связывающие материалы неорганической природы [28], пептиды узнающие клетки различных тканей и злокачественных опухолей [29, 30] и т.д. 6. ЛАНДШАФТНЫЕ ПЕПТИДНЫЕ ФАГОВЫЕ БИБЛИОТЕКИ И ОБЛАСТИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ На основе вектора fd-tet Петренко и соавт. скоструировали мерную пептидную библиотеку уникальных клонов, получившую название ландшафтной [31]. В ландшафтных фагах практически вся фаговая поверхность работает как связывающий ландшафт, при этом сила связывания с мишенью существенно возрастает за счёт авидности. В мерной ландшафтной библиотеке (рис. 4) каждый клон несет свой 8-мерный пептид в составе химерного белка р8, в количестве 4000 копий на вирион. За счёт вставки чужеродного фрагмента длина каждой молекулы р8 в мерной билиотеке увеличена с 50 аминокислотных остатков до 55 (в ней три аминокислоты EGE вначале белка р заменены мерной рандомизованной последовательностью. В рамках программы создания и использования ландшафтных библиотек с более длинными пептидами Петренко с соавт. сконструировали новый вектор f8-6 [32]. В этом векторе нуклеотидный фрагмент, кодирующий аминокислотный тример EGE заменён на структуру, включающую аминокислоту E, за которой следуют два стоп-кодона. В несупрессорном штамме вектор f8-6 мог существовать только в виде фагмиды, но не давал фагового потомства. Kuzmicheva и соавт. на основе вектора f8-6 путём замещения короткого ДНК-фрагмента, несущего два стоп-кодона на фрагмент, кодирующий рандомизованный пептид, создали представительную мерную ландшафтную библиотеку [32] с разнообразием в 3 ´10 клонов. Общая длина рекомбинантного белка р также составляла 55 аминокислотных остатков (4 аминокислоты EGED вначале белка р8 были заменены рандомизованной мерной последовательностью. В отличие от мерной библиотеки, в новой мерной библиотеке не было даже минимальных количеств фагового варианта без встройки, который, не имея дополнительной нагрузки в виде чужеродного пептида, мог бы иметь селективные преимущества при амплификации библиотек между раундами аффинной селекции Обе ландшафтные библиотеки были успешно использованы в разнообразных проектах по поиску специфичных лигандов, связывающих бактериальные клетки, споры, раковые клетки и различные белки [31-38]. Ландшафтные библиотеки являются специализированными, они имеют свои области применения и ограничения. Путём секвенирования большого числа клонов было установлено, что распределение каждой из 20 аминокислот по длине пептида не является полностью случайными равномерным [32]. В данных библиотеках отсутствовали цистеиновые остатки, снижено количество аминокислотных остатков гидрофобных аминокислот триптофана и фенилаланина, наблюдалось преимущественное расположение в определённых участках остатков негативно заряженных аминокислот аспарагиновой и глютаминовой). Все это свидетельствует о том, что ландшафтные библиотеки не являются полностью рандомизированными и что структура экспонируемых пептидов влияет на жизнеспособность и скорость разомножения ландшафтных фагов. Полученные из ландшафтных библиотек пептиды лучше всего работают в составе фаговой частицы. Поскольку белки р упакованы очень плотно в составе капсида и тесно примыкают друг к другу, в ландшафтных фагах экспонированные пептиды имеют значительную конформационную жёсткость. Это означает, что во многих случаях, связываясь в составе фаговой частицы, они перестают связываться со своей мишенью в виде свободного пептида или в составе не-фагового белка-носителя. Например, из мерной ландшафтной библиотеки был получен фаг 1G40, несущий пептид DTFAKSMQ [33]. Фаг связывал бета-галактозидазу с константой диссоциации н. Та же аминокислотная последовательность в виде свободного пептида не связывала бета-галактозидазу. В работе Kuzmicheva et al. было показано, что одни мутации в середине основного белка оболочки р (районе ой аминокислот) усиливают связывание фага, несущего пептид с бета-галактозидазой, а другие мутации – полностью подавляют такое связывание. Кроме того попытки этих авторов клонировать пептид для получения ландшафтного фага окончились неудачей, такие фаги просто не выживали (Кузьмичева и др, неопубликованные данные). Пептид LTVSPWY, связывающий онкомаркер был отобран из библиотеки на основе белка р Наилучшее применение, на наш взгляд, ландшафтные библиотеки и ландшафтные фаги имеют там, где мишень представляет собой протяжённую и упорядоченную структуру с повторяющимися элементами. Это может быть поверхность спор, бактериальных и эукариотических клеток, полимерные материалы, а также поверхности материалов неорганической природы (металлов, их оскидов, сплавов и т.д.), то есть там, где фактически связываются две поверхности. Опыт работы с ландшафтными библиотеками привёл нас к концепции создания и параллельного использования в селекции разделенных (SPLIT) рандомизованных ландшафтных библиотек [33, Каждая такая библиотека будет отличаться от других определенным набором мутаций в области аминокислот белка p8, что в свою очередь ведёт к изменению в составе и распределении рандомизованных пептидов, расположенных в концевой части молекулы p8. Более того, может ПЕПТИДНЫЙ ФАГОВЫЙ ДИСПЛЕЙ Кузьмичева, Белявская 489 быть создана принципиально новая библиотека, несущая сразу два рандомизованных участка: один – в самом начале гена белка р, как в мерной и мерной библиотеках, а второй – в области 12-19-ой аминокислот белка p8. Сочетание двух рандомизированных последовательностей в составе белка p8, таким образом, приведет к значительному увеличению функционального разнообразия библиотек ландшафтных фагов. Исходный вектор f8-6 имеет аминокислотную последовательность в области ой аминокислот белка р. Как первый шаг в создании новых библиотек нами были сконструированы векторы, кодирующие следующие аминокислотные последовательности в этой области, DELTVAAN, EDLSAMAG, QELSIQAE, EELESIAN, EELTLEAH. Векторы были опробованы в клонировании нуклеотидных фрагментов, кодирующих определенные пептиды с известной связывающей активностью [36]. 7. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПЕПТИДНОГО ФАГОВОГО ДИСПЛЕЯ В БИОТЕХНОЛОГИИ И БИОМЕДИЦИНСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ В данном коротком обзоре мы не в состоянии описать все разнообразие использования ФД в биотехнологии и биомедицинских исследованиях. Остановимся лишь на некоторых направлениях, которые, на наш взгляд, являются наиболее значимыми и интересными 1) идентификация мимотопов и иммунодоминантных эпитопов белков для иммунодиагностики и создания субьединичных вакцин, 2) получение пептидов, узнающих бактериальные и вирусные патогены; 3) идентификация пептидов, специфично узнающих клетки раковых опухолей 4) идентификация пептид-связывающих мотивов в интерактомных исследованиях 5) идентификация пептидов, узнающих различные вещества неорганической природы (токсины, взрывчатые вещества, металлы, полупроводниковые материалы, пластиковые поверхности и т.д.). Выбор стратегии поиска специфических пептидов и, соответственно, пептидных библиотек каких источника, в большой степени обусловливается их дальнейшим применением. Пептиды могут быть использованы в различных форматах в виде свободных пептидов природного строения химически модифицированных пептидов, несущих различные функциональные группы радиоактивно меченые изотопы, флюорофорные группы в виде фаговых частиц с экспонированными на поверхности пептидами (то есть в том формате в котором они были исходно получены или измененном формате, нона основе нитчатых бактериофагов и их белков ив составе химерных белков не-фаговой природы. Идентификация мимотопов и иммунодоминантных эпитопов белков для иммунодиагностики и создания субъединичных вакцин С помощью пептидного фагового дисплея были идентифицированы иммунодоминантные эпитопы различных белков патогенных микроорганизмов, а также найдено большое количество мимотопов, пептидов структурно имитирующих иммунодоминантные эпитопы белков ноне имеющие сходства в аминокислотных последовательностях В работе Kuzmicheva et al. [40], выполненной в лаборатории Smith, авторы идентифицировали диагностические пептиды, которые могут быть в дальнейшем использованы для иммунодиагностики боррелиоза, заболевания вызываемого патогенной бактерией Borrelia burgdorferi, передаваемой человеку при укусе заражёнными клещами. Болезнь коварна тем, что не всегда легко диагностируется и, если не было проведено своевременной терапии антибиотиками, переходит в хроническую форму, вызывая сердечную недостаточность, артриты, хронические дерматиты, часто сопровождаясь синдромом хронической усталости и приводящую в тяжёлых случаях к инвалидности. Для поиска пептидов для иммунодиагностики боррелиоза были использованы 12 различных пептидных рендомизованных библиотек на основе фагового вектора fd-tet (табл. 1). Для получения максимального разнообразия клонов каждая библиотека была использована отдельно. В качестве молекулярных мишеней были использованы смеси антител, полученных из сывороток человеческой крови трёх групп первую группу представляли положительные антитела из сывороток больных с доказанным диагнозом заболевания, вторую – антитела из сывороток здоровых людей и третью – антитела из сывороток крови больных ревматоидными псориатическим артритом. Третья группа содержала антитела, которые часто давали иммуно-перекрестные реакции с первой группой. Для получения диагностических пептидов использовали следующую тактику. Сначала из библиотек убирали все варианты, которые связывались с пластиковыми поверхностями, затем – с антителами второй и третьей группа потом на таких истощённых библиотеках проводили селекцию пептидов, связывающих позитивные антитела, специфичные для больных боррелиозом. В результате были идентифицированы специфичных пептидов из различных библиотек, из них 4 пептида (YPKESPPRLNAPWYQ, PKSSCTQNPILCAILS, QKDFACKHCKLPSP ив иммуноферментном анализе распознавали все 10 сывороток больных с различными формами боррелиоза, использованных в данной работе, и не давали иммуноперекрестных реакций, как в тесте с сыворотками здоровых людей, так и с сыворотками больных различными формами артрита, имеющими неинфекционную этиологию. Идентифицированные пептиды обладали способностью к специфическому узнаванию как в составе фаговых частиц, таки в виде химически синтезированных пептидов (Кузьмичева и др, неопубликованные данные. Все пептиды являлись мимотопами, то есть имитировали иммунодоминантные эпитопы бактериальных белков B. burgdorferi, ноне имели сходства в аминокислотных последовательностях. Аналогичная схема была использована Manhani и соавт. [41] для получения мимотопов при разработке специфичного и чувствительного иммунологического теста, позволяющего определять на основе анализа крови активный цистицеркоз головного мозга, вызванного личинками свиного цепня. В работе и соавт. [42] была найдена серия пептидов с общим мотивом K(L/P/V)GDP(R/K)/L, которые узнавали антитела, циркулирующие в крови животных больных псевдобешенством. Как известно, экономический ущерб от этого заболевания огромен, особенно в развивающихся странах. В исследованиях Тумановой и соавт. [42, 43] были найдены пептиды-имитаторы эпитопа белка вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), узнаваемого нейтрализующими антителами. Некоторыми исследователями было показано, что фаги, несущие мимотопы, в дальнейшем, при иммунизации лабораторных животных, индуцировали антитела, связывающие белки самого патогена [44]. 7.2. Получение диагностических и терапевтических пептидов, узнающих бактериальные и вирусные патогены Во многих работах в качестве мишеней были использованы бактериальные клетки, споры или вирусные частицы. Из библиотек формата 8 и были найдены фаги с высоким потенциалом их дальнейшего использования в качестве узнающих элементов в биосенсорах. Преимуществом использования в биосенсорах фагов по сравнению со специфическими антителами является во-первых, повышенная устойчивость фагов к воздействию высоких температур, низких и высоких pH, солей, 34, 35], во-вторых, плотность узнающих элементов на единицу полезной площади в фагах существенно увеличена – дона одну фаговую частицу длиной один микрон. Таки соавт. [45], используя две комбинаторные библиотеки формата 8+8, получили пептиды, узнающие мембранные белки Pseudomonas aeruginosa – бактерии, вызывающей многие инфекции человека, включая прогрессирующие хронические респираторные инфекции у больных муковисцидозом. Авторы использовали фаг, несущий множественные копии пептида QRKLAAKLT, в качестве узнающего элемента в кварцевых биосенсорах. В работах и соавт. [31-38], включающих и наши собственные исследования, проведённые на мерной и мерной ландшафтных фаговых библиотеках, были найдены фаги, специфично узнающие бактерии Salmonella typhimurium (DRPSPNTV, VPQQDKAQ, VTPPQSSS, VNYDDMTST), споры cereus (EKHPELRG, EKLPLSQT, ASPNLHRE) бактерий вызывающих пищевые отравления (Кузьмичева и др, неопубликованные данные), а также споры Bacillus anthracis (EPRLSPHS, ASRPMPVS, AGTNGQSQ DPDTQGRM, DPNARSDL, DTSTEARA) – бактерий, вызывающих сибирскую язву. Идентифицированные ландшафтные фаги несли копий специфического пептида на одну фаговую частицу в составе поверхностного белка р, в этом случае фаговая частица целиком становилась связывающей единицей. В дальнейшем ландшафтные фаги были успешно использованы как узнающие элементы в биосенсорах для определения патогенных бактерий (S. typhimurium, пептид VTPPTQHQ) и спор. anthracis, пептид EPRLSPHS) [34, Во многих случаях найденные с помощью фагового дисплея пептиды, специфично связывающие поверхность бактериальных клеток, обладали антибактериальной активностью. Часть из них обладала катионными свойствами за счёт большого количества положительно заряженных аминокислотных остатков. Таки соавт. обнаружили катионный пептид обладающий антибактериальными свойствами: он связывался с отрицательно заряженными мембранами бактериальных клеток, что приводило к образованию пори лизису бактериальных клеток. В работе Rao c соавт. [46] был идентифицирован другой катионный пептид – который обладал существенной антибактериальной активностью в отношении грамотрицательных бактерий, он снижал количество бактерий E. ив плазме крови на 5 порядков. В тоже время он не показывал гемолитических свойств и не обладал цитотоксичностью в отношении эукариотических клеток. Пептид KQRTSIRATEGCLPS, найденный в работе Bishop-Hurley и соавт. [47], показывал высокоспецифичную бактерицидную активность на панели клинических изолятов H. influenza. В тоже время он не действовал наряд грамположительных. faecalis, S. aureus) и грамотрицательных бактерий. aeruginosa, S. enterica). 7.3. Идентификация диагностических и терапевтических пептидов, узнающих клетки раковых опухолей Подробное изложение успехов применения пептидного ФД в этой области, а также проблем и способов их решения, можно найти в обзоре [48]. За всё время существования метода ФД (почти 30 лет) были найдены пептиды, узнающие раковые клетки опухолей молочной железы, простаты, яичников, головного мозга, рака легких, пищевода, желудка, печени, поджелудочной железы, тонкого и толстого кишечника, шейки матки и др. Некоторые из них приведены в таблице Полученные пептиды использованы в двухосновных направлениях 1) развитии новых контрастных агентов для локализации опухолей in vivo и их мониторинга при различных видах терапии, 2) специфические пептиды были использованы для адресной доставки противораковых средств для уменьшения токсичности последних в отношении здоровых тканей и органов. Для дальнейшего применения данных пептидов важно учитывать возможность сохранения их связывающих свойств вне фаговой частицы, то есть в виде свободных пептидов, либо в составе других белков-носителей, липосом, радиоактивных или контрастирующих агентов. В качестве мишеней используют очищенные белки-онкогены, культуры раковых клеток или биопсийные препараты опухолей (ФД in situ) [48]. Pascualini и соавт. разработали |