При этом приблизительно половина молекулы ре концевая часть, экспонирована наружу, а концевая спрятана 481 Биомедицинская химия, 2016 том 62, вып. 5, с. 481495. Обзоры
 Скачать 1.5 Mb.
|
|
ПЕПТИДНЫЙ ФАГОВЫЙ ДИСПЛЕЙ подход, получивший название ФД in vivo [32, 49, который впоследствии был применён во многих лабораториях. Фаговые библиотеки вводили в кровяное русло лабораторных животных, несущих определённый тип привитой раковой опухоли опухоли затем извлекали и элюировали фаги, специфически связывающие раковые клетки [48, 50, 54]. Приведём лишь несколько примеров успешного получения и использования онко-специфичных пептидов. В работе Chang и соавт. был идентифицирован пептид связывающийся с клетками немелкоклеточного рака лёгких. Экспериментальный препарат, где данный пептид был использован для адресной доставки липосом, несущих доксорубицин, увеличивал эффективность хемотерапии немелкоклеточного рака лёгких и выживаемость лабораторных мышей. В работе Perea и соавт. [57] был найден циклический пептид С, связывающий клетки рака шейки матки. Препарат на основе данного пептида хорошо зарекомендовал себя в клинических испытаниях на людях (31 человек он хорошо переносился пациентами и подавлял рост опухолей. Противораковые пептидные препараты могут представлять альтернативу традиционно используемым антителами имеют ряд преимуществ за счёт своих малых размеров пептиды легче проникают в клетки и ткани, эффективно выводятся организмом и не вызывают иммунологических реакций [48]. 7.4. Пептидный фаговый дисплей в исследованиях интерактомов Пептидный фаговый дисплей успешно применяется в интегративной и сравнительно новой области биомедицины – в постгеномных исследованиях интерактомов, в частности, интерактома человека. Интерактомом в постгеномных исследованиях называется часть протеома, включающая все виды взаимодействий между белковыми компонентами в данной клетке данного организма. По предварительным оценкам, интерактом человека включает более чем 130000 бинарных белок (пептид- белковых(пептидных) взаимодействий (protein-protein interactions (PPIs)), основную часть которых ещё предстоит открыть и изучить [58]. PPIs являются особенно важными для осуществления клеточных функций и проявления дисфункций. Бинарные PPIs по своем характеру чрезвычайно разнообразны, и отличаются по показателям устойчивости (стабильные/транзиторные), по характеру силы связи (низко-/высокоаффинные), по протяжённости физически взаимодействующих пептидных участков, а также по частоте встречаемости в белках (единичные/множественные). Связывающие пептидные мотивы, как правило, имеют протяжённость менее аминокислотных остатков и локализованы в нестурктурированных участках белковых молекул. По данным биоинформатики, они обнаруживаются более чему белков человека [58]. В настоящее время в биоинформатическом ресурсе линейных эукариотических мотивов (eukaryotic linear motif (ELM)) насчитывается не менее 2400 мотивов, которые могут быть потенциальными связывающими сайтами доменов различных белков [58, 59, Именно такого типа взаимодействия возникают вовремя ключевых клеточных процессов транскрипции, трансляции, особенно на модификационных стадиях, таких как фосфорилирование, ацетилирование и метилирование. Примером наиболее часто встречающихся пептид-связывающих доменов человеческого протеома являются домены связывающие С-концевые фрагменты белков, а также домены, взаимодействующие с фосфорилированными пептидными мотивами [58, 61]. Пептидный фаговый дисплей идеально подходит для идентификации линейных пептидных мотивов, участвующих во взаимодействии белковых молекул. При этом в стратегии поиска таких пептидных мотивов возможно применение как комбинаторных библиотек (с последующим поиском идентифицированных пептидных лигандов в белковых базах данных, таки узконаправленных библиотек перекрывающихся пептидов, созданных на основе конкретных белков. Приведём только один пример такого рода исследований. В работе Ivarsson и соавт. [61] предлагается подход, который объединяет биоинфоматику, использование коммерческих наборов перекрывающих геном олигонуклеотидов и пептидный фаговый дисплей. На первом этапе была создана библиотека Кузьмичева, Белявская 491 Таблица 2. Пептидные лиганды, связывающие раковые клетки и онкогенные белки Типы раковых клеток онкогенных белков Связывающий пептид Литературный источник Клетки рака молочной железы, MARAKE, MSRTMS, Клетки рака простаты GPAHCKRTISQCQTNE, IAGLATPGWSHWLAL, IPLVVPLGGSCK Клетки рака головного мозга, [34] Клетки рака поджелудочной железы Клетки рака пищевода, Клетки рака яичников, Клетки рака щитовидной железы EDYELMDLLAYL [31] Клетки немелкоклеточного рака лёгких EHMALTYPFRPP, TDSILRSYDWTY [39] олигонуклеотидов, кодирующих всевозможные короткие мотивы данного протеома. Затем с использованием этих олигонуклеотидов и коммерческих наборов (в частности “244k microarray chips” (“Agilent”)) авторы проводили ПЦР, получали двунитевые фрагменты, которые клонировали в один из генов поверхностного белка фага для последующей презентации пептидных мотивов [61]. Селекция фагов из полученных библиотек проводилась на целевых белках, получаемых разными методами. Успешность предлагаемого подхода авторы продемонстрировали на примере создания двух фаговых библиотек, включающих С-концевые короткие мотивы протеомов человека и вируса, с последующей селекцией фагов на полноразмерном сигнальном белке Scribble (beta-PIX, plakofillin-4, guanylate cyclase soluble subunit Так, в частности было подтверждено взаимодействие PDZ-доменов белка Scribble с С-концевым фрагментом белка Tax-1 Т-лимфотропного вируса человека, а также открыты новые вирусные лиганды, взаимодействующие с доменами данного белка. Такой подход является весьма перспективным для исследования различных интерактомов, и в частности – интерактома человека. Особую важность в изучении интерактома представляет решение проблемы минимального узнавания в системе лиганд-белок. В случае когда в качестве лиганда выступает пептид, “единица узнавания представлена мотивом из трёх аминокислотных остатков [58]. Для ДНК-пептидного интерактома нам удалось показать, что с помощью пептидного ФД возможно дискриминировать однонуклеотидные различия, но только в случае их “неспаренности”, причём независимо от контекста мутации в ДНК. Такие однонуклеотидные “mismatch- неспаренности” были смоделированы in с помощью гомо- и гетеро дуплексов с несколькими ошибочно спаренными основаниями Образование in vivo таких ошибочно-спаренных оснований предшествует процессам репарации, исправляющим генные ошибки. При неэффективной репарации происходит накопление таких мутаций в геноме, что может приводить к канцерогенезу. Для ранней диагностики и терапии онкозаболеваний трудно переоценить важность разработки методов, позволяющих идентифицировать подобного рода мутации неизвестной локализации в геноме. Применение ФД даст новый импульс для углубления исследований в этом направлении, так как позволит дискриминировать любую неизвестную мутацию путём образования искусственно создаваемого из фрагментированной геномной ДНК пула гомо- и гетеродуплексов (с мутациями, с последующим обогащением последних с помощью фагов, ранее отселектированных на модельных гетеродуплексах. Следует отметить, что достаточно большое количество связей в интерактоме (по разным данным от 30 до 40%) являются транзиторными и низкоаффинными. Возможно именно из-за транзиторности такие связи являются наиболее значимыми для многих клеточных функций Технологии фагового дисплея позволяют идентифицировать не только высокоаффинные, но и низкоаффинные лиганды путём изменения условий аффинной селекции на более щадящие на ранних этапах селекции, а потом сегрегации популяций полученных пептидов по их аффинности. В этом отношении ФД обладает существенными преимуществами перед методами получения и анализа пептид-белковых комплексов с помощью аффинной очистки и сопряжённой масс-спектрометрии, где слабые комплексы не регистрируются и поэтому просто выпадают из анализа [58, 61]. 7.5. Пептидные лиганды для построения новых наноматериалов Поскольку в основе технологий пептидного ФД лежит поиск пептидных лигандов по принципу их аффинности, можно априори предположить, что в представительной пептидной библиотеке присутствуют варианты, связывающие не только биоорганические мишени, но и самые разнообразные вещества неорганической природы, включая различные твёрдые поверхности. Потребность в подобных пептидных лигандах возросла многократно с развитием нанотехнологий и синтезом новейших наноматериалов упорядоченной структуры. Подробный перечень достижений в этой области можно найти в обзоре Seker и Demir [62]. Отметим несколько наиболее интересных примеров из этого направления. В таблице 3 представлены некоторые пептиды, связывающие различные металлы, сплавы и оксиды металлов, парамагнитные материалы, CoPt) [62-64], полупроводниковые материалы, ZnS, CdS) [65, 66], полистирол [67]. Для поиска пептидов, связывающих металлы, их окислы или сплавы, пептидные библиотеки либо наносили на соответствующие поверхности, либо инкубировали с мелкодисперсными порошками. Полученные фаги затем использовали в качестве центров кристаллизации при получении наночастиц и монокристаллов того же вещества [62]. В случае экспонирования пептидов на фаговой поверхности в составе белка р, получали нановолокна определённого размера с наночастицами, расположенными вдоль длинной оси фага. При дальнейшей высокотемпературной (обработке, органическая часть выгорала. В результате были получены полностью неорганические нановолокна определённой структуры. Так, используя фаги, несущие два функциональных пептида на поверхности р, были получены гибридные нановолокна, состоящие из кобальта и золота Аналогичная техника была успешно использована для получения полупроводниковых монокристаллов, 66]. Первоначально из библиотек формата р3 авторы идентифицировали 2 пептида, связывающие (CNNPMHQNC и VISNHAESSRRL). Путём клонирования получали варианты фагов, несущие множественные копии данных пептидов в составе белка р. Фаги помещали вводный раствор добавляли водный раствор Na 2 S. После “созревания” смеси были получены нановолокна, в которых расположение монокристаллов ZnS соответствовало расположению копий белка р в фаге. ПЕПТИДНЫЙ ФАГОВЫЙ ДИСПЛЕЙ Следует отметить, что большинство исследований по поиску пептидов, связывающих вещества неорганической природы, было выполнено с использованием коммерческих библиотек фирмы England Biolabs” – Ph.D-12 ив которых пептиды экспонированы в составе минорного белка р3 в количестве только 5 копий на фаговую частицу. Для того, чтобы получить нановолокна авторам приходилось переклонировать соответствующие фрагменты в векторные системы 8+8. Очевидно, что библиотеки ландшафтного формата 8 имели бы ряд преимуществ в таких исследованиях, поскольку количество пептидов на одну фаговую частицу в них первоначально составляет 4000 на вирион. К сожалению, ландшафтные библиотеки пока остаются недоступными для широкого применения, но есть надежды на появление их коммерческих вариантов в ближайшем будущем. При работе с библиотеками практически любого типа входе аффинной селекции зачастую идентифицируются фаги, специфично связывающие пластиковые поверхности поверхности микропробирок, чашек Петри или иммунологических планшетов. Многие из таких пептидов имеют общий аминокислотный мотив RPTR. Пептид специфично связывающийся с полистиреновыми поверхностями культуральных сосудов для клеточных культур, был слит с интегрин-связывающим пептидом GRGDS [68]. Таким гибридным пептидом обрабатывали поверхности культуральных сосудов, что приводило к увеличению адгезивности клеточных культур и увеличению скорости их размножения. Многие инертные материалы можно обрабатывать с помощью бифункциональных фагов или бифункциональных пептидов и иммобилизовать таким образом на их поверхности необходимые функциональные группы и реагенты [62]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Использование пептидного фагового дисплея, как комбинаторного метода, привело к открытию огромного множества биоспецифичных лигандов пептидной природы, успешно использующихся в самых различных областях современной биотехнологии, нанотехнологии и биомедицины. Для дальнейшего успешного применения ФД несомненно требуется создание коммерческих библиотек самого различного формата. При использовании схем аффинной селекции существенную пользу приносит первоначальная негативная селекция. При этом из библиотек убирается наибольшее количество неспецифических вариантов, например, пептидов, связывающих общие полисахаридные компоненты бактериальных клеток, клеточные мембраны эукариотических клеток, пластиковые поверхности, а также белки, используемые в качестве блокирующих агентов. Полезным для успешной идентификации разнообразных лигандов является параллельное использование сразу нескольких библиотек, получение коллекций мутантов и дополнительные раунды селекции для идентификации пептидов с более высокой аффинностью. Всё это позволит находить самые разнообразные биоспецифичные пептидные лиганды, клиническое использование которых в будущем будет только возрастать. Авторы выражают благодарность профессору. Smith (University of Columbia, Missouri, и профессору В.А. Петренко (Auburn University, Auburn, Alabama, USA) за возможность работать в их лабораториях и поддержку. ЛИТЕРАТУРА. Hofschneider P.H., Preuss A. (1963) J. Mol. Biol., 7, 450-451. 2. Hoffmann-Berling H., Duerwald H., Beulke I. (1963) Z. Naturforsch. B., 18, 893-898. 3. Loeb T. (1960) Science, 131, 932-933. 4. Straus S.K., Scott W.R., Symmons M.F., Marvin D.A. (2008) Eur. Biophys. J., 37, 521-527. 5. Marvin D.A., Symmons M.F., Straus S.K. (2014) Prog. Biophys. Mol. Biol., 114, 80-122. 6. Smith G.P., Petrenko V.A. (1997) Chem. Rev., 97, 391-410. Кузьмичева, Белявская 493 Таблица 3. Пептидные лиганды, связывающие различные неорганические вещества Материал Связывающий пептид Литературный источник Серебро (Ag) AYSSGAPPMPPF, IRPAIHIIPISH, WSWRSPTPHVVVT [45] Золото (Au) VSGSSPDS, LKAHLPPSRLPS, TGTSVLIATPYV [45] Оксид железа Платина (Pt) CPTSTGQAC, Кобальт (Co) HSVRWLLPGAHP, Сплав железа и платины, SVSVGMKPSPRP, VISNHRESSRPL [45-47] Палладий (Pd) QQSWPIS, NFMSLPRLGHMH, SVTQNKY, SPHPGPY, HAPTPML [45-47] Нержавеющая сталь (Fe) MTWDPSLASPRS, ATIHDAFYSAPE, Полупроводниковые материалы, CdS, PbS CNNPMHQNC, VISNHAESSRRL, SLTPLTTSHLRS, QNPIHTH, CTYSRLHLC [48], [49] Полистирол RPTR [50] 7. Barbas C.F. III, Barton D.R., Silverman G.J. (eds.) (2001) Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 736 p. 8. Rakonjac J., Bennett N.J., Spagnuolo J., Gagic D., Russel M. (2011) Curr. Issues Mol. Biol., 13, 51-76. 9. Smith G.P. (1985) Science., 228, 1315-1317. 10. Scott J.K., Smith G.P. (1990) Science, 249, 386-390. 11. McCafferty J., Griffiths A.D., Winter G., Chiswell D.J. (1990) Nature, 348, 552-554. 12. Barbas C.F. 3rd, Kang A.S., Lerner R.A., Benkovic S.J. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 7978-7982. 13. Kang A.S., Jones T.M., Burton D.R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88,11120-11123. 14. Kügler J., Zantow J., Meyer T., Hust M. (2013) Viruses., 5, 2531-2545. 15. Bratkovic T. (2010) Cell Mol. Life Sci., 67(5), 749-767. 16. Gamkrelidze M., Dabrowska K. (2014) Arch. Microbiol., 196, 473-479. 17. Qin L., Fokine A., O'Donnell E., Rao V.B., Rossmann M.G. (2010) J. Mol. Biol., 395, 728-741. 18. Shivachandra S.B., Li Q., Peachman K.K., Matyas G.R., Leppla S.H., Alving C.R., Rao M.R.B. (2007) Vaccine, 25, 1225-1235. 19. Beghetto E., Gargano N. (2011) Molecules, 16, 3089-3105. 20. Guglietta S., Beghetto E., Spadoni A., Buffolano W., Del Porto P., Gargano N. (2007) Microbes Infect., 9(2), 127-133. 21. Matthews D.J., Wells J.A. (1993) Science, 260, 1113-1117. 22. Felici F., Luzzago A., Folgori A., Cortese R. (1993) Gene., 128, 21-27. 23. Кузьмичева ГА, Кувшинов В.Н., Разумов И.А., Иванисенко В.А., Ерошкин А.М., Мишин В.П., Орешкова С.Ф., Локтев В.Б., Ильичев А.А., Сандахчиев Л.С. (1997) Докл. акад. наук, 352, 113-116. 24. Кузьмичева ГА, Кувшинов В.Н., Разумов И.А., Иванисенко В.А., Ерошкин А.М., Мишин В.П., Ушакова Т.А., Локтев В.Б., Ильичев А.А. (1997) Мол. генетика микробиол. вирусол., 4, 25-29. 25. Rowley M.J., Scealy M., Whisstock J.C., Jois J.A., Wijeyewickrema L.C., Mackay I.R. (2000) J. Immunol., 164, 3413-3419. 26. Dieltjens T., Willems B., Coppens S., Van Nieuwenhove L., Humbert M., Dietrich U., Heyndrickx L., Vanham G., Janssens W.J. (2010) Virol. Methods, 169, 95-102. 27. Tanaka T., Kokuryu Y., Matsunaga T. (2008) Appl. Environ. Microbiol., 74, 7600-7606. 28. Whaley S.R., English D.S., Hu E.L., Barbara P.F., Belcher A.M. (2000)Nature, 405, 665-668. 29. Chamarthy S.P., Jia L., Kovacs J.R., Anderson K.R., Shen H., Firestine S.M., Meng W.S. (2004) Mol. Immunol., 41, 741-749. 30. Kelly K.A., Bardeesy N., Anbazhagan R., Gurumurthy S., Berger J., Alencar H., Depinho R.A., Mahmood U., Weissleder R. (2008 ) PLoS Med., 5(4):e85. 31. Petrenko V.A., Smith G.P., Gong X., Quinn T. (1996) Protein Eng., 9, 797-801. 32. Kuzmicheva G.A., Jayanna P.K., Sorokulova I.B., Petrenko V.A. (2009) Protein Eng. Des. Sel., 22, 9-18. 33. Kuzmicheva G.A., Jayanna P.K., Eroshkin A.M., Grishina M.A., Pereyaslavskaya E.S., Potemkin V.A., Petrenko V.A. (2009) Protein Eng. Des. Sel., 22, 631-639. 34. Huang S., Yang H., Lakshmanan R.S., Johnson M.L., Wan J., Chen I.H., Wikle H.C. 3rd, Petrenko V.A., Barbaree J.M., Chin B.A. (2009) Biosens. Bioelectron., 24, 1730-1736. 35. Olsen E.V., Sorokulova I.B., Petrenko V.A., Chen I.H., Barbaree J.M., Vodyanoy V.J. (2006) Biosens. Bioelectron., |