При этом приблизительно половина молекулы ре концевая часть, экспонирована наружу, а концевая спрятана 481 Биомедицинская химия, 2016 том 62, вып. 5, с. 481495. Обзоры
 Скачать 1.5 Mb.
|
|
ВВЕДЕНИЕ В настоящее время пептидный фаговый дисплей является одним из наиболее распространенных методов поиска пептидных лигандов. Пептидные фаговые библиотеки, содержащие миллиарды различных вариантов, служат источником получения пептидов, способных специфично узнавать как различные биологические объекты (белки, вирусы, бактерии, раковые клетки, таки широкий спектр неорганических веществ (металлы и сплавы, полупроводники, токсины, пластиковые поверхности). Успех использования нитчатых бактериофагов в технологиях фагового дисплея кроется в детальной изученности фаговых генома и протеома, тонкого строения фагового капсида, а также в возможностях манипуляций с фаговым геномом без потери жизнеспособности фагов. Некоторые приложения технологий фагового дисплея в поисках пептидов, специфично узнающих различные молекулярные мишени, рассмотрены в данном обзоре. БИОЛОГИЯ НИТЧАТЫХ ФАГОВ Нитчатые или филаментные бактериофаги coli в дальнейшем изложении фаги) относятся к семейству Inoviridae, роду и включают 3 близкородственных вида f1, fd, и М13, отличающихся друг от друга несколькими аминокислотными заменами в фаговых белках Строение нитчатых фагов показано на рисунке 1. Капсиды фагов представляют собой длинные гибкие полые нанотрубки с высокоупорядоченной белковой структурой, длина капсида около 1 мкм, диаметр – 6-7 нм [4-6]. Капсид образуют 5 различных белков. Основу капсида фага дикого типа составляют копий короткого (50 аминокислотных остатков) основного белка оболочки p8, копии которого плотно примыкают друг к другу наподобие зёрен в кукурузном початке. При этом приблизительно половина молекулы ре концевая часть, экспонирована наружу, а концевая спрятана 481 Биомедицинская химия, 2016 том 62, вып. 5, с. 481-495. ОБЗОРЫ УДК 577 ©Кузьмичева, Белявская ПЕПТИДНЫЙ ФАГОВЫЙ ДИСПЛЕЙ В БИОТЕХНОЛОГИИ И БИОМЕДИЦИНЕ Г.А. Кузьмичева 1,2 *, В.А. Белявская 1 1 Государственный научный центр вирусологии и биологии Вектор, 630558 Кольцово, Новосибирская область эл. почта kouzmitcheva@yahoo.com 2 ”XBiotech USA”, Остин, Ист Риверсайд Драйв, 8201, стр. 4, 78744 Техас, США В настоящее время пептидный фаговый дисплей является одним из наиболее распространённых методов поиска пептидных лигандов. Пептидные фаговые библиотеки, содержащие миллиарды различных вариантов, служат источником получения пептидов, способных специфично узнавать как различные биологические объекты (белки, вирусы, бактерии, раковые клетки, таки широкий спектр неорганических веществ (металлы, сплавы, полупроводники, токсины, пластиковые поверхности. Успех использования нитчатых бактериофагов в технологиях фагового дисплея кроется в детальной изученности фаговых генома и протеома, тонкого строения фагового капсида, а также в возможностях манипуляций с фаговым геномом без потери жизнеспособности фагов. В настоящем обзоре рассмотрены характерные черты наиболее известных некоммерческих пептидных комбинаторных библиотек различного формата (в частности, ландшафтных библиотеки их использование в различных областях биотехнологии и биомедицины для а) идентификации диагностических пептидов против различных патогенов; б) идентификации пептидов, узнающих различные типы раковых клеток в) использования технологий фагового дисплея в исследованиях интерактомов человека ив создании новых наноматериалов заданной структуры. Ключевые слова фаговый дисплей, пептиды, бактериофаги, пептидные фаговые библиотеки, ландшафтные библиотеки 10.18097/PBMC20166205481 * - адресат для переписки Рисунок 1. Строение филаментных бактериофагов E coli (f1, fd, M13). Основное тело капсида составляет белок р (2700 копий, на одном конце капсида находятся белки р и р (5 копий каждого, на другом - белки р и р (5 копий каждого. Одноцепочечная кольцевая ДНК находится в полости капсида. Гены кодирующие белки р (g3) и р (g8) обозначены прямоугольниками. внутри полой трубки. На одном конце капсида располагаются по 5 копий белков p3 и p6, на другом по 5 копий белков p7 и p9. Геном фага представлен одноцепочечной кольцевой ДНК, располагающейся в полости капсида, и включает всего 11 генов, пять из которых кодируют белки капсида, два отвечают за репликацию фаговой ДНК, три за самосборку фаговых частиц и секрецию, и один – за связывание c одноцепочечной фаговой ДНК в процессе, предшествующем самосборке фаговых частиц. Размеры фаговой ДНК могут варьировать в значительных пределах, что позволяет получать рекомбинантные фаги, несущие чужеродные гены. При увеличении длины ДНК увеличивается и количество копий белка р, и, соответственно, длина фаговой частицы. Жизненный цикл нитчатых фагов показан на рисунке 2. Нитчатые фаги не относятся ник литическим, ник лизогенным фагам [7, В процессе своего размножения они не убивают хозяйскую клетку E. coli, а их ДНК не встраивается в бактериальный геном. Нитчатые фаги способны инфицировать только те штаммы E. coli, которые несут коньюгативные пили и, соответственно, коньюгативные F-плазмиды. При инфицировании бактериальной клетки фаговая частица специфично связывается с кончиком пили через белок р3, пиля втягивается, и фаговая частица проникает в периплазматическое пространство клетки через временно образованную пору. В результате комплексного взаимодействия с мембранными белками клетки (TolQ, TolR, TolA) в периплазме фаговый капсид распадается ив цитоплазму попадает только кольцевая одноцепочечная ДНК. В клетке на её основе образуется двухцепочечная репликативная форма (РФ, которая используется для получения дочерних одноцепочечных фаговых ДНК и для наработки мРНК с последующим синтезом фаговых белков. Самосборка и секреция фаговых частиц клеткой является сложным скоординированным процессом, многие детали которого до сих пор остаются неясными. В процессе самосборки и секреции участвуют 5 белков капсида (р7, р, p8, p3 и p6), 3 белка, отвечающие за самосборку (p1, p4, p11), комплекс одноцепочечной фаговой ДНК с димерами белка p5, ATP и по крайней мере один бактериальный белок – тиоредоксин. Все 5 капсидных белков фага синтезируются в виде предшественников, несущих лидерные последовательности, позволяющие им секретироваться в периплазматическое пространство, где происходит отщепление лидерных последовательностей и встраивание процессированных капсидных белков во внутреннюю мембрану бактериальной клетки. Процесс самосборки происходит на мембране где белки p4, р, р и тиоредоксин образуют временную пору. Если условно обозначить один конец фаговой частицы, где располагаются белки p3 и головой, а противоположный конец образованный белками р и р хвостом фага, то при инфицировании фаг взаимодействует с клеткой “головой” вперед, а секретируется хвостом вперед. Процесс самосборки и секреции происходит одновременно и включает 3 стадии инициацию, элонгацию и терминацию. Вовремя инициации одноцепочечная ДНК фага с расположенными на ней димерами белка p5 подходит к поре открытым участком, называемым сигналом упаковки ПЕПТИДНЫЙ ФАГОВЫЙ ДИСПЛЕЙ 482 Рисунок 2. Жизненный цикл филаментных фагов. Фаг специфически связывается с кончиком пили мужского штамама E coli и проникает в периплазматическое пространство клетки. В цитоплазме одцепочечная ДНК фага (ОЦ) превращается в репликативную форму (РФ. После наработки в клетке фаговых белков и ОЦ ДНК происходит упаковка и секреция фаговых частиц из клетки. Подробности в тексте Кузьмичева, Белявская 483 (packaging signal). Белки р и р вместе с несколькими белками р, располагающимися на внутренней мембране клетки, взаимодействуют с сигналом упаковки и образуют хвост фага, который перемещается впору и продвигается в сторону поверхности бактериальной клетки, в то время как процесс самосборки продолжается. Димерные комплексы белка р замещаются в процессе элонгации белками р, которые образуют высокоупорядоченную структуру вокруг фаговой ДНК, при этом фаговая частица продолжает продвигаться через пору на поверхность бактериальной клетки. На последнем этапе – терминации, присоединением белков р и р6 формируется голова фага, и полностью сформировавшаяся фаговая частица покидает клетку, не нарушая целостности её мембраны. В результате клетка превращается в фабрику по производству фаговых частиц, при этом скорость её деления замедляется приблизительно вдвое. Детальное описание строения нитчатых бактериофагов, процессов инфицирования, размножения и секреции можно найти в работах [5, 8] а также в книге с соавт. [7]. Специфическое строение фаговых частиц, механизмы их секреции бактериальной клеткой и возможности существенного манипулирования фаговым геномом без потери жизнеспособности обусловили использование нитчатых фагов в технологии, называемой фаговым дисплеем (phage display). Развитию пептидного фагового дисплея на нитчатых фагах и его широкому использованию в различных областях биотехнологии и биомедицины значительно способствовало то, что его основатель, создав различные библиотеки, стал распространять большую часть из них, с соответствующими протоколами, бесплатно, и без каких-либо ограничений для академических исследований [6]. Позже их заменили коммерческие пептидные фаговые библиотеки компании England Biolabs”. 2. ФАГОВЫЙ ДИСПЛЕЙ Фаговый дисплей (ФД) это технология, в основе которой лежит экспонирование чужеродных пептидов или белков на поверхности фаговых частиц в составе одного из химерных белков оболочки. При этом чужеродный фрагмент сохраняет свою исходную способность связываться со своей молекулой-мишенью, а несущий белок продолжает выполнять свои физиологические функции в составе фаговой частицы. Достигается такое экспонирование направленным встраиванием нуклеотидной последовательности, кодирующей чужеродный пептид/белок, в состав соответствующего фагового гена [6-8]. Поскольку чужеродный белок и кодирующая его последовательность находятся в составе одной фаговой частицы, таким образом обеспечивается физическая связь белка и кодирующей его ДНК, что позволяет легко определять структуру данного белка посредством секвенирования соответствующего гена. Фаговые пептидные или белковые библиотеки, представляют собой смесь фагов (10 8 -10 различных вариантов при этом каждая фаговая частица несёт свой вариант чужеродного пептида/белка и, соответственно, кодирующий его ген. По своей функциональной принадлежности в фаговом дисплее различают четыре больших направления первое – пептидный фаговый дисплей, когда на поверхности фагов экспонированы короткие молекулы, длиной 5-20 аминокислотных остатков; второе – фаговый дисплей антител и их вариабельных фрагментов третье – фаговый дисплей белков, куда можно отнести все остальные белки, не относящиеся к антителам, а также их функциональные фрагменты; четвертое – протеомный фаговый дисплей, в котором упор делается на изучении протеомов (в частности, протеома человека) с помощью создания библиотек функциональных доменов белков и поиска бинарных белок (пептид)-белковых комплексов. Основы фагового дисплея были заложены работой Smith, опубликованной в 1985 году Он продемонстрировал, что фрагмент рестриктазы EcoRI может быть слит с концевой частью минорного белка оболочки р, ив составе такого химерного белка экспонирован на поверхности фаговой частицы. При этом фрагмент рестриктазы сохранял способность специфически связываться с узнающими его антителами. Поскольку белок р3 играет ключевую роль в инфицировании бактериальной клетки, инфекционность полученых рекомбинантных фаговых частиц была снижена, но фаги оставались вполне жизнеспособными; аминокислотная последовательность слитого белка была подтверждена секвенированием соответствующей части фагового генома. В той же работе была разработана стратегия, названная аффинной селекцией или биопэнингом (с помощью которой специфичные фаги, присутствующие в мизерных количествах в смеси различных фагов, могут быть отобраны за счёт аффинного связывания с иммобилизованной молекулярной мишенью. В 1990 году была опубликована работа Smith с соавт. [10], в которой разработана идеология использования рандомизованных пептидных фаговых библиотек в фаговом дисплее. Первая пептидная фаговая библиотека состояла из 10 различных вариантов. В том же 1990 году в работе McCafferty с соавт. была продемонстрирована возможность экспонирования вариабельных фрагментов антител на поверхности фагов и затем созданы первые библиотеки вариабельных фрагментов антител [12, 13]. Вначале х годов прошлого века также была разработана технология фагового дисплея библиотек генных фрагментов для исследования функций белков какого-либо конкретного патогена. Позднее на основе нитчатых фагов были созданы библиотеки генных фрагментов tuberculosis возбудителя туберкулёза), Plasmodium falciparum возбудителя малярии typhimurium возбудителя cальмонеллеза), Streptococcus pneumonia возбудителя пневмонии), а также цитомегаловируса человека, вируса иммунодефицита человека [14] . В х годах прошлого века были разработаны системы фагового дисплея на литических бактериофагах, имеющие как ряд преимуществ по сравнению с дисплеем на нитчатых фагах, так и свои специализированные области применения. Краткое описание этих систем будет представлено ниже в отдельной главе данного обзора. Пептидые рандомизованные библиотеки могут рассматриваться как универсальные и применяться для поиска связывающих пептидных лигандов на любые бактерии, вирусы, раковые клетки, молекулы-мишени органической и неорганической природы. Библиотеки генных фрагментов и кДНКовые библиотеки патогенных микроорганизмов являются более узконаправленными. Однако, любой отобранный из такой библиотеки белок или пептид является частью протеома данного патогена и может быть привязан к определенному гену и его функции. С помощью ген-фрагментных библиотек были определены аминокислотные последовательности иммунодоминантных эпитопов многих белков, тогда как большинство пептидов, отобранных с помощью рандомизованных пептидных библиотек, являются мимотопами, то есть белковыми фрагментами иммитирующими действие иммунодоминантных эпитопов, ноне имеющих сними сходства в аминокислотных последовательностях [8, 14]. 3. ФАГОВЫЙ ДИСПЛЕЙ НА ЛИТИЧЕСКИХ ФАГАХ ЛЯМБДА, Т И Т7 Фаговый дисплей пептидов и белков на основе нитчатых фагов имеет свои ограничения. Некоторые пептиды и цитоплазматические белки в силу определенного строения не могут пройти через системы секреции бактериальной клетки и, следственно, не могут быть экспонированы на поверхности нитчатых фагов. В этом случае системы фагового дисплея, разработанные на основе литических фагов, имеют явные преимущества, так как фаговое потомство формируется в цитоплазме бактериальной клетки и освобождается путём её лизиса. Наибольшее распространение получили системы дисплея натр х литических фагах: лямбда, Т и Т. Все литические фаги существенно больше по размерами имеют более сложное строение по сравнению с нитчатыми фагами. Вирионы литических фагов состоят из головного отдела, часто в форме икосаэдра, и хвоста с прикреплёнными хвостовыми пластинками. Перспективными для дисплея чужеродных пептидов и белков являются как белки головного отдела, так и белки хвостового отдела, несущественные для самосборки и жизнеспособности фага Для дисплея на фагах Т были разработаны системы на основе двух белков Hoc (highly antigenic outer capsid protein) c молекулярной массой 40 кДа, 160 копий на вирион, и Soc (small outer capsid с молекулярной массой 9 кДа, 960 копий на вирион [16]. Для дисплея использовали как концевой, таки концевой фрагменты обоих белков возможно экспонирование двух различных чужеродных белков на Hoc и Soc одновременно. Особенно перспективным оказалось экспонирование на поверхности Т различных антигенов. Например, препараты фагов Т4 с экспонированными на их поверхности антигенами бактерий рода Neisseria, а также защитного антигена anthracis при введении в кровяное русло мышей без добавления адъювантов вызывали сильный гуморальный ответ Для дисплея на литических фагах Т7 использовали белок головного отдела фага представленный 415-450 копиями на один вирион. Для экспонирования чужеродного белка используется С-концевой фрагмент белка gp10. Компанией, Merck Biosciences” разработаны векторы и пептидные библиотеки (длиной до 50 аминокислотных остатков) высокой копийности (415 копий на вирион), а также векторы, позволяющие экспонировать более крупные белки длиной около 1200 аминокислотных остатков с копийностью 5-15 копий и 1 копия на вирион [15]. На основе фага Т были созданы и успешно использованы в поиске белковых лигандов кДНК-овые библиотеки Arabidopsis thaliana и falciparum [14]. Для дисплея на литических фагах лямбда использовали белок головного отдела gpD c молекулярной массой 11,4 кДа, 405-420 копий на вирион, и белок из хвостового отдела gpV, c молекулярной массой 28,0 кДа, 192 копии на вирион [19]. Встройка чужеродных фрагментов может осуществляться как в N-концевые, так и концевые участки соответствующих генов. При этом, если дисплей коротких пептидов осуществлялся простым клонированием в соответствующий ген, то дисплей больших белковых фрагментов на белках gpD и gpV требовал специальных векторных систем, обеспечивающих создание мозаичных вариантов фагов, несущих на своей поверхности как копии рекомбинантных белков с чужеродными фрагментами, таки копии белков дикого типа. Дисплей на литическом фаге лямбда был успешно использован рядом исследователей для поиска антигенов различных патогенных микроорганизмов. Так были созданы библиотеки кДНК-овых фрагментов Toxoplasma gondii, Streptococcus pneumoniae, цитомегаловируса, вируса гепатита С. Библиотеки использовали в аффинной селекции с антителами из сывороток крови соответствующих больных и идентифицировали панели важнейших антигенов, вызывающих сильный гуморальный ответ [19, 20]. Однако, несмотря на некоторые преимущества ФД на основе литических фагов, по сравнению с нитчатыми, эта методология не нашла столь широкого применения, как ФД на нитчатых фагах. Возможно, это произошло в силу ряда причин. Во-первых, с самого начала у исследователей не было свободного доступа к векторами библиотекам на основе литических фагов, как это было с библиотеками на нитчатых фагах Создание же представительных фаговых библиотеки их характеризация до сих пор является трудоёмкой |