БАВ. Природные биологически активные вещества
 Скачать 1.93 Mb.
|
|
ТЕМА 16. МЕТОДЫ ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ЛРС Фармакогностический анализ - комплекс методов анализа, позволяющих определить подлинность и доброкачественность ЛРС. Он включает: 1. Макроскопический анализ. 2. Микроскопический анализ. 3. Фитохимический (качественный и количественный) анализ. 4. Товароведческий анализ. 5. Биологическую стандартизацию. Подлинностью (или идентичностью) называется соответствие исследуемого сырья наименованию, под которым оно поступило для анализа. Для установления подлинности ЛРС Государственной фармакопеей предусмотрены следующие виды анализа: 1. Макроскопический. 2. Микроскопический. 3. Качественный фитохимический. 4. Хроматографический. 5. Люминесцентный. Доброкачественность - соответствие ЛРС требованиям НД. Доброкачественность ЛРС определяется следующими видами анализа: 1. Товароведческим анализом (определение подлинности, измельченности, содержания примесей, степени зараженности амбарными вредителями). 2. Количественным фитохимическим анализом (определение числовых показателей: влаги, золы, действующих или экстрактивных веществ). 3. Биологической стандартизацией ЛРС (для сырья, содержащего сердечные гликозиды). Макроскопический анализ Целью макроскопического анализа является определение подлинности и доброкачественности цельного, реже резаного ЛРС по внешним признакам. Основная задача макроскопического анализа - найти в общей картине морфологических признаков специфические, особенные, присущие исследуемому объекту, отличающие его от других близких видов и примесей (т.е. найти диагностические признаки). Техника макроскопического анализа Техника макроскопического анализа сводится к изучению внешнего вида ЛРС, определению размеров отдельных частей, обратнояйцевидные и др. 3. Форму сложных листьев - пальчатосложные, тройчатосложные, перистосложные (парно- и непарно-перистосложные). 4. Размеры (длина, ширина пластинки листа, черешка). 5. Характеристику края листа или листочка (цельнокрайний, зубчатый, пильчатый, городчатый, выемчатый). 6. Опушение. 7. Жилкование (пальчатое, перистое, дуговое, параллельное). 8. Цвет с верхней и нижней сторон. 9. Запах. 10. Вкус (только у неядовитых видов сырья). Полученные данные сравнивают с требованиями НД на данный вид сырья в разделе "Внешние признаки" и делают заключение о подлинности и качестве сырья по внешним признакам. Общие правила проведения макроскопического анализа для установления подлинности приведены в статьях ГФ XI, вып. 1 «Травы» (с. 256), «Цветки» (с. 257), «Плоды» (с. 258), «Семена» (с.260), «Кора» (с. 261), «Корни, корневища, луковицы, клубни, клубнелуковицы» (с.263). Микроскопический анализ Цель микроскопического анализа - определение подлинности как цельного, так и измельченного ЛРС. Задача микроскопического анализа - найти характерные диагностические признаки в общей картине анатомического строения различных органов, по которым изучаемый объект можно отличить от близких видов и примесей. При анализе руководствуются НД на исследуемый вид сырья разделом "Микроскопия". Микроскопический анализ листьев Цельное, резаное и дробленое сырье. Из тонких листьев готовят препараты листа с поверхности; из толстых и кожистых листьев при необходимости готовят поперечные срезы. Для приготовления микропрепарата листа с поверхности мелкие листья используют целиком, от крупных берут отдельные участки: край листа, зубчик по краю листа, участок главной жилки, верхушка листа и основание. При рассматривании микропрепарата листа с поверхности обращают внимание на следующие основные диагностические признаки: строение эпидермиса, тип устьиц, характер трихом (волоски, железки), наличие и форму кристаллических включений, механической ткани, вместилищ, млечников, секреторных каналов и т.д. Эпидермис листьев характеризуется определенной формой клеток - изодиаметрической или удлиненной с прямыми или извилистыми боковыми стенками, с тонкими или утолщенными оболочками, с четковидными утолщениями боковых (антиклинальных) стенок. Характерен тип устьиц, определяемый числом и расположением околоустьичных клеток эпидермиса. У двудольных различают четыре основных типа устьичного комплекса: аномоцитный (или ранункулоидный) - устьица окружены неопределенным числом клеток, не отличающихся по форме и размерам от остальных клеток эпидермиса; анизоцитный (или круцифероидный) - устьица окружены тремя околоустьичными клетками, из которых одна значительно меньше двух других; парацитный (или рубиацеоидный) - с каждой стороны устьица, вдоль его продольной оси расположены по одной или более околоустьичных клеток; диацитный (или кариофиллоидный) - устьица окружены двумя околоустьичными клетками, смежные стенки которых перпендикулярны устьичной щели. Эпидермальные клетки, окружающие волосок, нередко образуют розетку, что является важным диагностическим признаком. Важное диагностическое значение имеют трихомы. Наиболее распространенным типом трихом являются волоски. Они подразделяются на одно- и многоклеточные, простые и головчатые (железистые). Простые волоски могут быть однорядными, двурядными, многорядными, пучковыми, неразветвленными и разветвленными (звездчатые, ветвистые, Т-образные), с тонкими или толстыми стенками. Их поверхность гладкая, бородавчатая, или продольно складчатая, что зависит от особенностей кутикулы, покрывающей волосок. Еще более разнообразны головчатые волоски, которые различаются как строением ножки (одно-, двух- или многоклеточной), так и формой и строением головки (шаровидной, овальной или иной формы, одно-, двух- или многоклеточной, с содержимым или без него). Другой тип эпидермальных образований (трихом) - железки. Они свойственны многим растениям и целым семействам, характеризуются определенной формой и строением. Как правило, в железках локализуется эфирное масло, но встречаются и другие включения (алкалоиды у белены и дурмана) или железки лишены содержимого. В диагностике листьев имеют значение различные вместилища с эфирным маслом, слизью, смолами и другими гидрофобными веществами: схизогенные, лизигенные или схизо-лизигенные вместилища, расположенные в мезофилле листа; млечники, секреторные каналы, обычно сопровождающие проводящие пучки, жилки. Кристаллы оксалата кальция могут быть разнообразной формы и размеров: одиночные кристаллы призматической формы; в виде мелких иголочек, собранных пучками (рафиды); сростки кристаллов (друзы, сферокристаллы); скопления кристаллов (кристаллический песок). Клетки с кристаллами могут располагаться среди клеток мезофилла или образовывать кристаллоносную обкладку вокруг проводящих пучков (сенна) или групп волокон. Изучив микроскопические диагностические признаки, их сравнивают с требованиями НД на данный вид сырья в разделе "Микроскопия" и делают заключение о подлинности ЛРС. Техника микроскопического (включая люминесцентную микроскопию) исследования ЛРС подробно изложена в общих статьях ГФ XI, перечисленных выше. Качественный химический анализ Для установления подлинности ЛРС используют простейшие качественные реакции и хроматографию, которые изложены в НД на исследуемый вид сырья, в разделе "Качественные реакции". По технике выполнения их можно разделить на несколько групп. 1. Качественные реакции на основную группу действующих веществ: на антраценпроизводные: на внутреннюю поверхность коры крушины наносят каплю щелочи, наблюдают красное окрашивание; на дубильные вещества: на внутреннюю поверхность коры дуба наносят каплю железоаммониевых квасцов, наблюдают черно-синее окрашивание; на флавоноиды: например, из цветков бессмертника готовят извлечение 50% спиртом, с которым проводят цианидиновую пробу (металлический Mg + концентрированная HCl), наблюдают красное окрашивание. 2. Микрохимические реакции проводят обычно одновременно с микроскопическим анализом, наблюдая результаты под микроскопом. Например, реакция на слизь с раствором метиленового синего. Срез помещают в раствор метиленового синего на несколько минут, затем переносят в глицерин - слизь окрашивается в голубой цвет. 3. Гистохимические реакции - это такие реакции, с помощью которых можно определить локализацию отдельных соединений в ЛРС. Например, реакция на дубильные вещества с раствором бихромата калия. Кусочки материала помещают в 5 - 10% раствор бихромата калия в воде на несколько дней, затем готовят срезы. В клетках, содержащих дубильные вещества, выпадает серо- и красновато-коричневый зернистый осадок. Реакция на алкалоиды - с раствором пикриновой кислоты образуются кристаллические желтые осадки. 4. Хроматографический анализ. При качественном анализе используют бумажную или тонкослойную хроматографию; по направлению - одномерную, двумерную, восходящую и нисходящую. Из ЛРС получают спиртовое извлечение, которое затем подвергают хроматографическому разделению. На хроматограммах вещества проявляются в видимом и УФ-свете до и после проявления специальными реактивами. Идентификацию проводят по характерной флуоресценции или окраске пятен, значению Rf и путем сравнения со стандартными образцами. Например, в ФС на цветки боярышника: спиртовое извлечение наносят на стартовую линию пластинки "Silufol", рядом наносят стандартный образец гиперозида. Пластинку с нанесенными пробами помещают в камеру с системой растворителей ХЛОРОФОРМ - МЕТАНОЛ (8:2) и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт растворителей дойдет до конца пластинки,ее вынимают из камеры, высушивают и просматривают в УФ-свете. На уровне пятна гиперозида появляется пятно темно-коричневого цвета. Затем пластинку обрабатывают 5% спиртовым раствором AlCl3 и нагревают ее в сушильном шкафу при температуре 100 - 105°С. При этом пятно приобретает ярко-желтую окраску в видимом и яркую желто-зеленую флюоресценцию в УФ-свете (гиперозид). Rf их совпадают. 5. Люминесцентный анализ. При исследовании ЛР и ЛРС большие возможности открывает люминесцентный анализ, т.к. многие вещества, вырабатываемые растительным организмом, обладают люминесценцией. Для получения излучения, возбуждающего люминесценцию, пользуются главным образом газоразрядными лампами - ртутными, водородными, криптоновыми, ксеноновыми. Наилучшим источником излучения считается такой, у которого наибольшее количество энергии приходится на долю излучения, необходимого для возбуждения люминесценции. Источники излучения обычно употребляются совместно со светофильтрами, которые из общего излучения выделяют нужный спектральный участок; остальная часть спектра отрезается светофильтрами, как мешающая. Большинство методов, использующих люминесцентные свойства объекта, объединяют под общим названием «макролюминесцентный анализ», исходя из того, что наблюдать люминесценцию можно невооруженным глазом. К макролюминесцентному анализу следует отнести обнаружение зон или пятен на хроматограммах по их свечению в УФ-свете. При . рассматривании ЛРС в УФ-свете можно наблюдать характерную люминесценцию в зависимости от его химического состава Люминесцентная микроскопия дает возможность одновременного изучения анатомической структуры объекта и характера его люминесценции, сохраняя основное достоинство люминесцентного анализа - высокую чувствительность и специфичность. Метод люминесцентной микроскопии применяется для определения подлинности ЛРС.Ценным преимуществом люминесцентной микроскопии является возможность его применения для изучения сухого растительного материала, из которого готовят толстые срезы или препараты порошка. Люминесцентная микроскопия листьев.Готовят препараты из порошка листьев, которые рассматривают без включающей жидкости. Наиболее яркая люминесценция характерна для одревесневших элементов - сосудов жилки, механических волокон, а также для кутикулы и кутинизированных оболочек различных эпидермальных образований (волосков, железок и др.). В эпидермальных клетках часто содержатся флавоноиды, обуславливающие коричневую, желтую или зеленовато-желтую люминесценцию. Клетки мезофила содержат различные включения - желтые, голубые, коричневые, зеленовато-желтые - в зависимости от химического состава. Хлорофилл в высушенном растительном материале не люминесцирует. Кристаллы оксалата кальция также не обладают люминесценцией. Люминесцентная микроскопия трав, цветков, плодов, семян, кор, корней, коревищ, луковиц, клубней, клубнелуковиц изложена в ГФ XI, вып. 1, с. 283 - 285. Контроль качества ЛРС правила приёмки ЛРС и МЕТОДЫ ОТБОРА ПРОБ Приемку ЛРС и отбор проб проводят согласно НД. ЛРС принимают партиями. ПАРТИЕЙ ЛРС («АНГРО») считают любое количество цельного, обмолоченного, измельченного, прессованного ЛРС, однородного по способу подготовки и показателям качества, одного наименования и оформленного одним документом, удостоверяющим его качество. Документ, удостоверяющий качество партии, должен содержать следующие данные: номер и дату выдачи документа; наименование и адрес отправителя; наименование сырья; номер партии, массу партии; год и месяц сбора или заготовки; район заготовки (для сырья дикорастущих растений); результаты испытаний качества сырья; наименование НД на сырье; подпись лица ответственного за качество сырья, с указанием фамилии и должности. Партия ЛРС состоит из единиц продукции. Транспортная упаковка ЛРС (единицы продукции) – упаковка, представляющая собой один из видов транспортной тары, указанной в частных фармакопейных статьях. Это могут быть кипы, мешки, ящики и другие упаковки. Каждую единицу продукции подвергают внешнему осмотру для установления соответствия упаковки и маркировки требованиям НД. Обращают внимание на правильность упаковки, состояние тары (отсутствие подтеков и др. повреждений, отрицательно влияющих на качество и сохранность сырья). Для проверки соответствия качества сырья требованиям НД отбирают выборку из неповрежденных единиц продукции, взятых из разных мест партии в количестве, указанном в табл. 21. Выборка — совокупность единиц продукции (транспортных упаковок или упаковок («ангро»), отобранных для проведения анализа из партии ЛРС или серии фасованной продукции. Таблица 21 Объём выборки ЛРС «АНГРО»
Примечание. Неполные 10 единиц продукции приравнивают к 10 единицам. (Например, при наличии в партии 52 единиц продукции объем выборки составляет 6 единиц). Проверку качества сырья в поврежденных единицах продукции производят отдельно от неповрежденных, вскрывая каждую единицу продукции. Попавшие в выборку единицы продукции вскрывают и путем внешнего осмотра определяют: однородность сырья по способу подготовки (цельное, измельченное, прессованное и т.д.), по цвету, запаху, засоренности; наличие плесени, гнили, устойчивого постороннего запаха, не исчезающего при проветривании; засоренности ядовитыми растениями и посторонними примесями (камни, стекло, помет грызунов и птиц и т.д.); наличие амбарных вредителей (определяют невооруженным глазом и с помощью лупы (5-10X)). В случае установления при внешнем осмотре: неоднородности сырья, наличия плесени и гнили, засоренности посторонними растениями в количествах, явно превышающих допустимые примеси и т.д. вся партия должна быть рассортирована, после чего вторично предъявлена к сдаче. При обнаружении в сырье: затхлого, устойчивого постороннего запаха, не исчезающего при проветривании, ядовитых растений, посторонних примесей (помет грызунов и птиц, стекло и др.), зараженности амбарными вредителями II и III степеней партия сырья не подлежит приемке. ОТБОР ПРОБ ЛРС «АНГРО» (ПАРТИЯ) Из каждой единицы продукции, отобранной для вскрытия, берут, избегая измельчения, 3 точечные пробы: сверху, снизу и из середины (схема 10) |