Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Руководство к практическим занятиям по микробиологии ( малый практикум) Ульяновск 2003 удк 619 616. 9
 Скачать 4.08 Mb.
|
ЗАНЯТИЕ 2. Бактериологические краски. Простой метод окрашивания.Цель занятия. Овладеть методикой приготовления мазка-препарата для микроскопии из микробной взвеси. Ознакомиться с методами приготовления красящих растворов. Отработать методику простого метода окраски приготовленных препаратов. Материалы и оборудование. Набор красок, спирт ректификат 96,6%, дистиллированная вода, фильтровальная бумага, предметные стекла, бактериологические петли, пинцеты, пробирки с микробными взвесями, микроскопы. МИКРОСКОПИЯ БАКТЕРИЙ В ОКРАШЕННОМ ВИДЕ На предметном стекле делают мазок, высушивают, фиксируют его и после этого окрашивают. Приготовление мазков. Исследуемый материал распределяют тонким слоем по поверхности предметного хорошо обезжиренного стекла. Мазки готовят из культур микробов, патологического материала (мокрота, гной, моча, кровь и др.) и из органов трупов. Приготовление препарата для микроскопии складывается из следующих этапов: 1.Приготовление мазка на обезжиренном предметном стекле. 2.Высушивание препарата. 3.Фиксация мазка. 4. Окраска мазка. В правильно приготовленном препарате микробные клетки должны быть расположены в один слой. Техника приготовления мазков определяется характером исследуемого материала. 1. Приготовление мазков из микробных культур с жидкой питательной среды и из жидкого патологического материала (моча и др.). Маленькую каплю исследуемой жидкости наносят бактериальной петлей на предметное стекло и круговыми движениями петли распределяют равномерным слоем в виде кружка диаметром в копеечную монету. 2. Приготовление мазков из крови. На предметное стекло, ближе к одному из его концов, наносят каплю крови. Второе - шлифованное - стекло, которое должно быть уже предметного, ставят на первое под углом 45° и подводят к капле крови до соприкосновения с ней. После того как кровь растечется по шлифованному краю, стеклом делают скользящее движение справа налево, равномерно распределяя кровь тонким слоем по всей поверхности стекла. Толщина мазка зависит от величины угла между стеклами: чем острее угол, тем тоньше мазок. Правильно приготовленный мазок имеет светло-розовую окраску и одинаковую толщину на всем протяжении. 3. Приготовление толстой капли. На середину предметного стекла пастеровской пипеткой наносят каплю крови или прикладывают стекло непосредственно к капле крови, выступающей из пальца. Нанесенную на стекло кровь размазывают бактериальной петлей так, чтобы диаметр образующегося мазка соответствовал величине копеечной монеты. Стекло оставляют в горизонтальном положении до подсыхания крови. Кровь в “толстой капле” распределяется не равномерно, образуя неровный край. 4. Приготовление мазка из вязкого материала (мокрота, гной). Мокроту или гной, нанесенные на предметное стекло ближе к узкому краю, накрывают другим предметным стеклом. Стекла слегка придавливают друг другу. После этого свободные концы стекол захватывают 1 и 2 пальцами обеих рук и разводят в противоположные стороны так, чтобы при движении оба стекла плотно прилегали друг к другу. Получаются мазки с равномерно распределённым материалом, занимающим большую часть. 5. Приготовление мазка из культур с плотных питательных сред. На середину чистого, хорошо обезжиренного стекла наносят каплю водопроводной воды, в нее вносят бактериальную петлю с небольшим количеством исследуемой микробной культуры так, чтобы капля жидкости стала слегка мутноватой. После этого излишек микробного материала на петле сжигают в пламени горелки и приступают к приготовлению мазка по описанному выше способу. 6. Приготовление мазков из органов и тканей. Поверхность органа с целью обеззараживания прижигают накаленными браншами пинцета, делают по этому месту надрез и из глубины остроконечными ножницами вырезают небольшой кусочек ткани, который помещают между двумя предметными стеклами. Далее поступают так же, как при приготовлении мазка из гноя и мокроты. Если ткань органа плотная, то из глубины разреза делают скальпелем соскоб. Полученный при соскабливании материал распределяют тонким слоем по поверхности стекла скальпелем пли бактериальной петлей. Для изучения взаимного расположения элементов ткани и находящихся в ней микроорганизмов делают мазки-отпечатки. Для этого вырезанный из середины органа небольшой кусочек ткани захватывают пинцетом и прикладывают поверхностью среза к предметному стеклу несколько раз последовательно, получая, таким образом, ряд мазков-отпечатков.  Рис. 4 Схема приготовления препарата-мазка Высушивание и фиксирование мазков. Приготовленный на предметном стекле мазок высушивают и после высыхания фиксируют. При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые. Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение средств, вызывающих коагуляцию белков Физический способ фиксации. Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или 1 и II пальцами правой руки за ребра мазком кверху и плавным движением проводят 2—3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с. Надежность фиксации проверяют следующим простым приемом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога. Химический способ фиксации. Для фиксации мазков применяют химические вещества такие как: Безводный метиловый спирт. Этиловый (винный) спирт 96%. Жидкость Никифорова (смесь спирта и наркозного эфира в соотношении 1:1). Жидкость Карнуа (спирта 96% 60 мл, хлороформа 30 мл, уксусной кислоты ледяной 10 мл) Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом и затем высушивают на воздухе. Техника окраски мазков. Для окраски мазков пользуются растворами красок или красящей бумагой, что предложено А. И. Синевым. Простота приготовления, удобство применения, а также возможность хранения красящих бумаг в течение долгого времени явились основанием для широкого их использования при различных способах окраски. Окраска мазков красящей бумагой. На высушенный и фиксированный препарат наносят несколько капель воды, кладут окрашенные бумажки величиной 2х2 см. В течение всего времени прокрашивания бумага должна оставаться влажной и плотно прилегать к поверхности стекла. При подсыхании бумагу дополнительно смачивают водой. Продолжительность окрашивания мазка определяется методом окраски. По окончании окраски бумагу осторожно снимают пинцетом, а мазок промывают водопроводной водой и подсушивают на воздухе или фильтровальной бумагой. Окраска мазков растворами красителей. На высушенный и фиксированный препарат пипеткой наносят краситель в таком количестве, чтобы он покрывал весь мазок. При окраске мазков концентрированными растворами красителей (карболовый фуксин Циля, карболовый генциановый или кристаллический фиолетовый) окрашивание производят через фильтровальную бумагу, задерживающую частицы красителя: на фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги и на нее наливают раствор красителя. ПРОСТЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ МАЗКОВКраски, применяемые в микробиологической практике. Для окрашивания микробов используют анилиновые красители (основные, кислые и нейтральные). Микроорганизмы лучше окрашиваются основными красками. Для окраски препаратов готовят спиртовые, водно-спиртовые и водные растворы. В некоторых случаях добавляют в качестве протравы карболовую кислоту, щелочь и др. Наиболее часто употребляемыми красителями являются следующие: Синие - метиловый синий, водный синий, опаловый синий; красные - фуксин основной, конго красный, сафранин, нейтральный красный, фуксин кислый; фиолетовые - метиловый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, генцианвиолет; зеленые - малахитовый зеленый, бриллиантовый зеленый, светло-зеленый; желто-коричневые - хризоилин, везувин. При простом методе окраски на фиксированный мазок наливают несколько капель какого-либо спиртоводного или водного раствора красок на 1—2 минуты; чаще всего для этой цели применяется фуксин 1: 10 или леффлеровская метиленовая синька. Затем краску смывают дистиллированной водой и мазок обсушивают между двумя полосками фильтровальной бумаги. Обычно Фуксином I: 10 красят 10—30 секунд, а метиленовой синькой – 2-10 мин. Фуксин окрашивает мазки более интенсивно. А при окраске метиленовой синькой получаются нежные, более изящные препараты. Мазок после обсушивания фильтровальной бумагой должен быть совершенно сухим, в противном случае при соприкосновении оставшейся влаги с кедровым маслом образуется эмульсия и при микроскопии получится неясное изображение. Вообще же продолжительность окраски зависит от вида и качества красящего раствора, степени восприимчивости микроба к окраске и толщины мазка. При простой окраске микробные тела воспринимают цвет применяемой краски так же интенсивно, как и ядра клеток; в то же время цитоплазма и весь фон мазка (если это не мазок из чистой культуры) окрашиваются в тот же цвет, но несколько бледнее. Фуксин и генцианвиолет относятся к более интенсивно окрашивающим краскам; метиленовая синька окрашивает значительно бледнее. Восприятие окраски зависит не только от свойств красок, но и от свойств подвергаемых окраске микробов. Большинство микробов легко и быстро окрашивается водными или спиртоводными растворами красок. Для повышения красящей способности воздействуют на краску высокой температурой (нагреванием) до появления паров (вплоть до кипения). Варьируя степень нагревания, можно получать различные степени силы окраски. Удлинение срока воздействия красящего раствора на объект также может в известной мере усилить степень окраски. Мытье предметных и покровных стекол. Предметные и покровные стекла должны иметь абсолютно чистую поверхность и быть хорошо обезжиренными. Капля воды, нанесенная на обезжиренное стекло, растекается равномерно, а на плохо обезжиренном стекле распадается на мелкие капельки. Предметные и покровные стекла рекомендуется мыть и ополаскивать в резиновых перчатках, чтобы не загрязнять их жиром, находящимся на поверхности кожи. Стекла предметные и покровные, не бывшие в употреблении, моют в теплой мыльной воде и после споласкивания заливают смесью Никифорова. Если стекла, вынутые через 2—3 дня из смеси Никифорова, сохраняют следы жира, их складывают в фарфоровую чашечку, заливают 2—5 % раствором гидрокарбоната натрия или едкого натра, ставят на слабый огонь и кипятят, считая от момента закипания воды, в течение 20—30 мин. После кипячения в щелочном растворе стекла ополаскивают проточной водопроводной водой, опускают на 10—15 мин в 5—10% раствор хлористо-водородной кислоты и затем промывают проточной водой. Предметные и покровные стекла, бывшие в употреблении, загрязненные краской и иммерсионным маслом, обрабатывают следующим способом: -опускают на 2 ч в концентрированную серную кислоту или хромовую смесь, затем тщательно промывают проточной водопроводной водой; -заливают 5% раствором гидрокарбоната натрия или щелочи (едкое кали или едкий натр), ставят на слабый огонь и кипятит в течение 30—40 мин. |