Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Руководство к практическим занятиям по микробиологии ( малый практикум) Ульяновск 2003 удк 619 616. 9

• Название: Руководство к практическим занятиям по микробиологии ( малый практикум) Ульяновск 2003 удк 619 616. 9
• Анкор: Руководство к практическим занятиям по микробиологии.doc
• Дата: 29.01.2017
• Размер: 4.08 Mb.
• Имя файла: Руководство к практическим занятиям по микробиологии.doc
• Тип: Руководство; #971
• Категория: Биология. Ветеринария. Сельское хозяйство
• страница: 6 из 7

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

Известно очень много питательных сред для культивирования микроорганизмов (более двух тысяч наименований было классифи­цировано Левином и Шёнлейном еще в 1930 г.), но число ингредиентов, являющихся их неотъемлемыми компонентами, отно­сительно невелико. Однако качественный диапазон этих сред весьма широк — от растворов неорганических солей, на которых могут расти автотрофы, до сложных питательных сред, приготавливаемых из мясных гидролизатов, обогащенных кровью или сывороткой; ими обычно пользуются для выделения патогенных микроорганиз­мов типа стрептококков, отличающихся высокой требовательностью к составу питательной среды. Различают два основных типа пита­тельных сред: так называемые синтетические среды, главные состав­ные части которых точно известны (например, глюкозо-солевая питательная среда), и эмпирически подобранные питательные среды природного происхождения, состав которых точно неизве­стен (к ним относятся пептоны, приготавливаемые из частично гидролизованного белка).

Выбор питательной среды зависит в значительной степени от цели эксперимента. Герберт настойчиво высказывался за по­всеместное использование синтетических питательных сред. Однако следует признать, что они обладают рядом практических неудобств. Микроорганизмы, выращенные на таких питательных средах, обычно фенотипически отличаются от выращенных на питательных средах естественного происхождения типа бульона (например, по составу и по скорости деления). Размножение микроорганизмов на таких средах обычно легче подавляется избыточной аэрацией или токсическими катионами; они также более чувствительны к нарушениям баланса между некоторыми составными частями питательной среды, особенно аминокислотами. Многие бактерии нуждаются в большом числе факторов роста, и для некоторых из них до сих пор не найдены искусственные среды, на которых они могли бы размножаться. Возможно, что все эти неудобства ее временем будут преодолены, но пока среды неизвестного состава ти­па бульонов, приготовленных из перевара, используются весьма ши­роко, хотя они и вносят в эксперимент неконтролируемые факторы.

В состав сред, применяемых для выращивания бакте­рий, входят необходимые для построения белков цитоплазмы органогены: азоты, углерод, водород, кислород, неорганиче­ские соединения, содержащие фосфор, калий, серу, натрий, магний, железо, микроэлементы: кобальт, йод, марганец, бор, цинк, молибден, медь и др. Все перечисленные элементы должны находиться в питательной среде в удобоусвояемом для данного микроорганизма соединении, причем требования различных микробов в этом отношении неодинаковы. Потреб­ность в кислороде и водороде бактерии удовлетворяют глав­ным образом за счет поступающей в клетку воды. По характеру усвоения азота патогенные микроорганиз­мы делятся следующим образом: одни из них извлекают азот из простых аммонийных соединений, другие нуждаются в аминокислотах, третьи расщепляют высокомолекулярные вещества — пептоны, представляющие собой продукты непол­ного ферментативного переваривания белков. Строго пара­зитические виды бактерий размножаются только в присут­ствии нативного, т. е. неизмененного, белка. Источником углерода для бактерий являются главным образом различные углеводы: сахар, многоатомные спирты, органические кислоты и их соли. Потребность бактерий в неорганических элементах удов­летворяется прибавляемыми к питательной среде солями: NaCI, KH₂P0₄, K₂HP0₄ и т. д. Микроэлементы, выполняющие роль катализаторов химических процессов, необходимы в ничтож­но малых количествах и поступают в питательную среду с пептоном, неорганическими солями и водой. Наряду с перечисленными органическими и неорганиче­скими элементами бактерии нуждаются в ростовых факторах, которые по своей роли соответствуют витаминам для живот­ных. Источником факторов роста являются прибавляемые к питательной среде продукты растительного и животного про­исхождения, содержащие в своем составе никотиновую, пантотеновую, парабензойную кислоты, витамины. Питательные вещества могут усваиваться микробами только при определенной реакции питательной среды, так как проницаемость оболочек микробных клеток изменяется в зависимости от рН среды. Потребность в питательных веществах и физических усло­виях у различных видов микробов неодинакова и этим ис­ключается возможность создания универсальной питательной среды.

По консистенции различают плотные и жидкие пи­тательные среды. Плотные питательные среды готовят из; жидких питательных сред посредством прибавления к ним клеевых веществ агара или желатина. Агар-агар (по-малайски желе) - про­дукт растительного происхождения, добываемый из морских водорослей. В воде агар-агар растворяется при температуре 80 - 86° С, застудневает при 36 - 40° С. Применение агаровых сред благодаря их способности сохранять плотность при тем­пературе 37°С дало возможность выращивать патогенных микробов при оптимальной для большинства из них темпера­туре на плотных средах. Желатин—вещество белковой при­роды животного происхождения. В теплой воде при темпера­туре 32—34°С он набухает и растворяется, а при более низ­кой температуре превращается в студень. Однако при рН ниже 6,3 и выше 7,0 плотность желатина уменьшается, и он плохо застывает.

Требования, предъявляемые к питатель­ным средам. Питательные среды должны:1. Содержать необходимые для питания микроба питательные вещества. 2. Иметь реакцию рН, оптимальную для выращиваемого вида микроба. 3. Иметь достаточную влажность, так как микробы пита­ются по законам диффузии и осмоса. 4. Обладать изотоничностью. 5. Быть стерильными, обеспечивая тем самым возмож­ность выращивания чистых культур микробов.

Питательные среды подразделяются на среды общего назначения и специальные. К первой группе отно­сятся мясопептонные: агар, бульон, питательный желатин. Среды общего назначения используют для выращивания мно­гих патогенных микробов и применяют в качестве основы для приготовления специальных сред, добавляя к ним кровь, сахар, молоко, сыворотку и другие ингредиенты, необходи­мые для размножения того или иного вида микроба. К специальным питательным средам относятся электив­ные (избирательные) и дифференциально-днагностическне.

Элективные (избирательные) среды. Принцип создания элективных питательных сред основан на удовлетворении ос­новных биохимических и энергетических потребностей того вида микроба, для культивирования которого они предназназначены. Определенный состав и концентрация питательных микроэлементов, ростовых факторов при строго значении рН обеспечивают оптимальные условия для выращивания одного или нескольких видов микроорганизмов. При посеве на них материала, содержащего смесь раз­личных микроорганизмов, раньше всего будет проявлять­ся рост того вида, для которого данная среда будет электив­ной. Дифференциально-диагностические среды. Дифференциально-диагностические питательные среды ис­пользуют для определения видовой принадлежности иссле­дуемого микроба, основываясь на особенностях его обмена веществ. По своему назначению дифференциально-диагности­ческие питательные среды подразделяются следующим об­разом: 1. Среды для выявления протеолитической и гемолитической способности микробов, содержащие в своем составе бел­ковые вещества: кровь, молоко, желатин и т. п. 2. Среды с индифферентными химическими веществами, которые служат источником питания для одних видов микро­бов и не усваиваются другими видами. 3. Среды с углеводами и многоатомными спиртами для обнаружения соответствующих ферментов. 4. Среды для определения редуцирующей способности микробов. В состав дифференциально-диагностических сред, пред­назначенных для выявления сахаролитических и окислитель­но-восстановительных ферментов, вводят индикаторы: ней­тральную красную, метиленовый синий, лакмусовую настой­ку, кислый фуксин, бромтимоловый синий, водный голубой краситель и розоловую кислоту. Изменяя свою окраску при различных значениях рН, индикатор указывает на нали­чие или отсутствие расщепления, окисления или восстанов­ления введенного в среду ингредиента. Однако индикатор не является обязательной составной частью сред, предназначен­ных для выявления ферментов. Так, наличие желатиназы и других протеолитических ферментов в культуре определяют по разжижению желатина, свернутого яичного или сыворо­точного белка.

Сухие питательные среды. Приготовление питательных сред — один из наиболее ответственных участков работы бактериологической лаборатории. В связи с этим биопромышленность выпускает стандартные, консервированные, сухие питательные среды, различного назначения, для культивирования микроорганизмов. Го­товят среды по прописи, указанной на этикетке. Постоянство состава, стан­дартность среды, простота и удобство в работе, легкость транспортировки и хранения являются большим преимуще­ством сухих питательных сред. После установления соответствую­щего рН среду кипятят, фильтруют, осветляют, разливают во флаконы, пробирки и стерилизуют. Следует учитывать, что после стерилизации среда становится более кислой.

Стерилизация питательных сред. Стерилизацию питательных сред осуществляют различными способами в зависимо­сти от тех ингредиентов, которые входят в их состав. 1. Синтетические среды и все агаровые среды, не содер­жащие в своем составе нативного белка и углеводов, стери­лизуют 15—20 мин в автоклаве при температуре 115—120°С. 2. Среды с углеводами и молоком (в состав которого вхо­дит лактоза), питательный желатин стерилизуют текучим паром при температуре 100°С дробно или в автоклаве при 112° С. 3. Среды, в состав которых входят белковые вещества (сыворотка крови, асцитическая жидкость), обеспложивают­ся тиндализацией или фильтрованием. 4. Для стерилизации питательных сред, содержащих в своем составе нативные белки, пользуются фильтрацией че­рез мембранные фильтры Зейтца. Подготовленные питательные среды про­веряют на стерильность. Для этого их ставят в термостат при температуре 37° С. Среды, простерилизованные в автоклаве, выдерживают в термостате 1 сут, простерилизованные теку­чим паром -3 сут.

ЗАНЯТИЕ 6. Методы и техника культивирования микроорганизмов на питательных средах. Методы выделения чистых культур микроорганизмов. Изучение культуральных свойств микроорганизмов.

Цель занятия. Изучить способы посевов и пересевов микроорганизмов на питательные среды. Изучить методы выделения чистых культур микроорганизмов. Ознакомиться с формами колоний. Произвести посев культур микробов на МПБ и МПА (в пробирки), а также посев смеси микробных культур (для выделения чистых) методом рассева на чашки Петри с МПА.

Оборудование и материалы. Штативы, пробирки со средами, микробиологические петли, шпатели, пипетки, чашки Петри с МПА. Культуры микроорганизмов.

ТЕХНИКА ПОСЕВА МИКРООРГАНИЗМОВ

Бактериологический метод—выделение чистых культур микробов и их последующая идентификация — имеет боль­шое значение в диагностике инфекционных заболеваний, при изуче­нии санитарно-гигиенического состояния объектов внешней среды (вода, воздух, почва, продукты питания). Однако первым этапом этой методики является посев или пересев бактериальной культуры на различные типы питательной среды. Материалом для посева могут быть пересеваемые культу­ры бактерий, различные выделения животных и человека, ткани трупа, вода, почва, продукты питания. Жидкий материал для посева берут петлей или пипеткой. При взятии петлей жидкость должна образовать в кольце петли тонкую прозрачную пленку - “зеркало”. Пипетками пользуются в том случае, когда материал засевают в боль­шом или точно отмеряемом объеме. Способ взятия плотного материала определяется его кон­систенцией. При посевах чаще всего пользуются бактериаль­ной петлей. Все манипуляции, связанные с посевом и выделением микробных культур, производят над пламенем горелки. Бактериальную петлю прокаливают над пламенем непосредст­венно перед взятием материала, затем петлю остужают. Для этого при пересеве микробной культуры с пробирки горячую петлю погружают в конденсационную жидкость, а при пере­севе с чашек Петри прикасаются к поверхности питательной среды, свободной от микробного роста. Достаточно остужен­ная петля не вызывает шипения конденсационной жидко­сти и не растапливает агар при соприкосновении со средой. После окончания посева петлю прожигают повторно для уничтожения находящейся на ней микроб­ной культуры или инфицированного микроорганизмами ма­териала. Пипетки и шпатели, используемые для посевов и опускают в дезинфицирующий раствор. После посева на чашках Петри со стороны дна, на про­бирках в верхней трети надписывают название засеянного материала, ставят номер анализа и дату посева.

Техника посевов на плотные и жидкие питательные среды: 1. При посеве в жидкую питательную среду петлю с находя­щимся на ней материалом погружают в среду. Если матери­ал вязкий и с петли не снимается, его



Рис.11. Схема пересева микробов из пробирки в пробирку.

растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой. Жидкий материал, набираемый в пастеровскую или градуированную пипетку, вливают в питательную среду. 2. При посеве на скошенный мясопептонный агар про­бирку берут в левую руку между 1 и II пальцами, чтобы ос­нование пробирки находилось на поверхности кисти руки и посев осуществлялся под контролем глаза. Пробку из про­бирки вынимают правой рукой V и IV пальцами, не прика­саясь к той части пробки, которая входит внутрь пробирки. Остальные 3 пальца правой руки остаются свободными для взятия бактериальной петли, посредством которой произво­дится посев. Петлю держат, как писчее перо. После вынима­ния пробки пробирку с питательной средой держат в наклон­ном положении во избежание попадания в нее посторонних микроорганизмов из воздуха. Петлю с находящимся на ней пересеваемым материалом вводят в пробирку до дна, опускают плашмя на поверхность питательной среды и скользящими движениями наносят штрих снизу вверх, от одной стенки пробирки к другой (рис.).

3. При посеве на поверхность плотной питательной среды в чашки Петри чашку держат в левой руке. Дно ее с одной стороны придерживают 1 и II пальцами, а с другой —IV и V пальцами. Крышку, приоткрытую настолько, чтобы в об­разовавшуюся щель свободно проходили петля или шпатель, фиксируют 1 и III или 1 и II пальцами (рис.). Небольшое количество исследуемого материала втирают бактериальной петлей в поверхность питательной среды у края чашки. За­тем петлю прожигают, чтобы уничтожить избыток находяще­гося на ней материала. Линию посева начинают с того ме­ста, в котором находится материал. Бактериальную петлю кладут плашмя на питательную среду, чтобы не поцарапать ее поверхности, и проводят штрихи по всей среде или по сек­торам, разграфив предварительно дно чашки (при условии, что среда прозрачна) на несколько равных частей. Нужно стараться, чтобы штрихи, наносимые петлей, располагались как можно ближе друг к другу, так как это удлиняет общую линию посева и дает возможность Для равномерного распределения засеваемого материала по поверхности плотной питательной среды можно пользо­ваться вместо петли тампоном или шпателем.


Рис. 12. Посев на плотную питательную среду в чашки Петри.

При обилии в засеваемом материале микробов они растут в виде пленки, покрывающей всю поверхность питательной среды. Такой характер микробного роста получил название сплошного, или газонного. Посев газоном производят, когда нужно получить большие количества микробной культуры одного вида. 4. Из материала, подлежащего посеву в толщу плотной питательной среды, готовят взвесь в стерильной водопровод­ной воде или в изотоническом растворе. Набирают 0,1—1 мл взвеси в пипетку (в зависимости от степени предполагаемого микробного загрязнения) и выливают в пустую стерильную чашку Петри. Вслед за этим чашку заливают 15 - 20 мл мясопептонного агара, расплавленного и остуженного до тем­пературы 40 - 45 °С (при такой температуре пробирка со сре­дой, приложенная к щеке, не должна вызывать ощущения ожога). Для равномерного распределения исследуемого ма­териала в питательной среде закрытую чашку с содержимым слегка вращают по поверхности стола. 5. Посев уколом в столбик питательной среды производят в пробирку со средой, застывшей в виде столбика. Пробир­ку берут в левую руку, как обычно, и в центре столбика до дна пробирки вкалывают петлю с находящимся на ней мате­риалом.

ПОЛУЧЕНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР. Чистой культурой микробов называют популяцию микроорганизмов одного вида, полученную из изолированной микробной колонии. Под микробной колонией подразумевает­ся потомство бактерий, возникающее в результате размно­жения одной микробной клетки. Выделение чистой культуры микробов является обяза­тельным этапом всякого бактериологического исследования. Чистая культура необходима для изучения морфологических, культур культуральных, биохимических и антигенных свойств, по со­вокупности которых определяется видовая принадлежность исследуемого микроорганизма.

Для выделения чистых культур микробов из материалов, содержащих обильную смешанную микрофлору, предложено много различных методов. Наибольшее распространение по­лучил метод механического разъединения микроорганизмов, находящихся в исследуемом материале, с целью получения изолированных колоний на поверхности или в глубине пита­тельной среды. Очень широко применяются элективные питательные сре­ды, стимулирующие развитие тех микроорганизмов, чистую культуру которых предполагается выделить. Некоторые виды микробов обладают высокой чувствитель­ностью к воздействию определенных факторов внешней сре­ды. Индивидуальная устойчивость микробов к тому или ино­му фактору была использована для разработки методов вы­деления чистых культур путем умерщвления сопутствующей микрофлоры. Этим способом производится выделение споровых форм микробов, устойчивых к действию высокой температуры, микобактерий туберкулеза, безразличных к действию концентрированных растворов минеральных кислот, в отли­чие от остальных микробов, содержащихся в мокроте. При выделении чистой культуры патогенных микробов из патологического материала, загрязненного посторонней мик­рофлорой, прибегают иногда к заражению лабораторных жи­вотных, восприимчивых к тому виду микроба, который пред­полагается выделить из исследуемого материала. Биологи­ческий метод выделения чистой культуры применяется при исследовании мокроты на содержание в ней пневмококков, микобактерий туберкулеза. Для выделения бактерий в виде чистых культур из­вестно сравнительно мало методов. Чаще всего это де­лают путем изолирования отдельных клеток на твердой питательной среде, используя метод посева штрихом.

Из чистой культуры обычно вырастают одинаковые колонии и при микроскопировании выявляются похожие клетки, в частности по размеру и окраске по Граму. Однако возможны исключения, например, колонии, вы­растающие из чистой культуры, могут быть гладкие (S) и шероховатые (R). Кроме того, в чистых культурах различных микроорганизмов могут появиться кокковидные клетки, цисты и споры. Наконец, некоторые микро­организмы проявляют грамвариабельность. Посев штрихом. Существует много методов посева штрихом в чашки с твердыми средами (“штрихованные чашки”), но лишь некоторые из них почти всегда дает хорошо изоли­рованные колонии даже при отсутствии навыков у экс­периментатора. Кроме того, можно наливать разведен­ные растворы смешанной культуры на поверхность твер­дых сред в чашках. При работе с анаэробами “штрихованные чашки” или чашки с внесенной в них жидкой культурой в атмосфере воздуха инкубируют затем в анаэростате. Для анаэробов необходимы свежеприготовленные среды, и посев штрихом следует проводить в течение первых 4 ч после их автоклавирования, чтобы избежать накоп­ления растворенного кислорода.












Рис.13. Удобный метод по­сева штрихом в чашки для получения отдельных коло­ний. А. Для маркировки на обратной стороне чашки Петри карандашом наносят букву Т, разделяющую дно на 3 сектора. Б. Петлей с культурой зигзагом наносят штрихи на поверхности ага­ра в секторе 1, как показано на рисунке. Для этого крыш­ку чашки сначала приподни­мают, а после нанесения штриха сразу закрывают. Петлю стерилизуют в пламе­ни и дают ей остыть (15 с). В. Проводят петлей по по­верхности среды в секторе 1, как показано на рисунке, и затем немедленно наносят ею зигзагом штрихи на по­верхности среды в секторе 2. Прогревают петлю в пла­мени и дают ей остыть. Г. Проводят петлей по поверх­ности среды в секторе 2, как показано, и затем наносят ею зигзагом штрихи на по­верхности среды в секторе 3. Д. Инкубируют опрокинутые вверх дном чашки, как по­казано на рисунке, для того чтобы конденсирующаяся во­да с крышки не попала на поверхность агара. В секто­ре 1 вырастает большое чис­ло колоний, тогда как в сек­торах 2 и 3 появляются от­дельные хорошо изолирован­ные колонии.

Получение чистой культуры методом рассева в глубине среды (по Коху). Три пробирки, содержащие по 15 мл мясопептонного агара, ставят в водяную баню для расплавления агара. Расплавленную среду остужают до температуры 43— 45°С. В пробирку вносят одну бактериальную петлю иссле­дуемого материала. Для лучшего перемешивания материала со средой засеянную пробирку вращают несколько раз, зажав между ладонями. После этого прокаленной и остуженной петлей содержимое 1-й пробирки переносят во 2-ю и таким же образом из 2-й в 3-ю. Приготовленные разведения мик­робов выливают из пробирок в стерильные чашки Петри, обозначенные номерами, соответствующими номерам про­бирок. После застудневания среды с исследуемым материалом чашки помещают в термостат. Количество колоний в чашках с питательной средой уменьшается по мере разведения мате­риала.

Выделение чистой культуры по способу Дригальского. Расплавленную питательную среду разливают в три чашки Петри. Застывшую среду обязательно подсушивают, так как влажная поверхность ее способствует образованию сливаю­щегося роста. В первую чашку вносят одну каплю исследуе­мого материала и стерильным шпателем втирают его в по­верхность питательной среды. Далее, не прожигая шпателя и не набирая нового материала, шпатель переносят во вто­рую и третью чашки, втирая в поверхность питательных сред оставшийся на нем материал. Метод рассева по поверхности, предложенный Дригальским, является наиболее употребительным для получения чи­стой культуры микробов. Вместо шпателя можно пользовать­ся петлей. Материал на питательной среде распределяют па­раллельными штрихами по всей чашке в одном направлении. Затем, повернув чашку на 180°, проводят штрихи в направле­нии, перпендикулярном первым штрихам. При таком способе посева материал, находящийся на петле, расходуется посте­пенно, и по линиям сетки, нанесенным в конце посева, вы­растают изолированные колонии микробов.

ИЗУЧЕНИЕ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ СВОЙСТВ МИКРООРГАНИЗМОВ

Культуральные признаки микробов определяются харак­тером роста их на питательных средах. Будучи постоянными, для каждого вида микроба, они являются важным диагно­стическим признаком.

Рост микробов на плотной питательной среде. Для изуче­ния свойств колоний микробы культивируют на плотных пи­тательных средах в чашках Петри. При посеве материала стараются получить изолированный рост колоний. Чашки с посевом просматривают сначала невооруженным глазом или через лупу, затем помещают их на столик микроскопа вверх дном и просматривают колонии в проходящем свете с объ­ективом малого увеличения и с суженной диафрагмой. Колонии характеризуют по величине, форме, контуру края, рельефу, поверхности, цвету, структуре и консистенции. Величина колонии определяется ее диаметром. В за­висимости от диаметра различают колонии точечные (диа­метр меньше 1 мм), мелкие (диаметр 1—2 мм), средние (диаметр 2—4 мм) и крупные (диаметр 4—6 мм и более). Форма колонии бывает правильная — круглая, непра­вильная — амебовидная, ризоидная — корневидная, напоминающая переплетающиеся корни деревьев. Характер контура края определяют при рассмотрении колонии под лупой или микроскопом с малым увеличением. Различают ровные края в виде четко выраженной ли­нии и неровные. Последние делят на:

1. 
   фестончатый край, состоящий из крупных, слегка округ­лых или уплощенных зубцов правильной формы;
   
2. 
   волнистый край, который несколько отличается от фе­стончатого тем, что крупные зубцы его выражены нечетко;
   
3. 
   эрозированный, или зазубренный, край, состоящий из острых зубцов различной величины и формы;
   
4. 
   бахромчатый край, имеющий нежные ворсинки.
   

В некоторых случаях четко выраженная линия, отграни­чивающая колонию от поверхности среды, отсутствует. Такой край колонии называется расплывчатым. Рельеф колонии характеризуется приподнятостью ее над поверхностью питательной среды и контуром формы в вертикальном разрезе. Определяется рельеф колонии нево­оруженным глазом или с лупой при рассматривании сверху и сбоку.










Рис.14. Форма колоний:

а - круглая; б - круглая с фестончатым краем; в - круглая с валиком по краям; г, д - ризоидные; е - круглая с ризоидным краем; ж - амебовидная; з - нитевидная; и - складчатая; к - непра­вильная; л - концентрическая; м - сложная
Различают: 1) каплеобразные и куполообразные колонии правильной круглой формы с различно выраженной степенью выпукло­сти, которые в вертикальном разрезе представляют собой сегмент шара и отличаются только длиной радиуса. Коло­нии слабовыпуклые имеют большую длину радиуса; куполо­образные — меньшую;

2) колонии плосковыпуклые с плоским верхом, пологими или круто обрывающимися краями; имеют в вертикальном разрезе форму трапеции;

3) колонии конусообразные, имеющие в вертикальном разрезе форму треугольника:

4) колонии с приподнятой в виде соска серединой и ва­ликом по периферии;

5) колонии с вдавленным центром;

6) колонии плоские, стелющиеся по поверхности среды. Поверхность колонии изучают с помощью лупы или под микроскопом при малом увеличении. Поверхность коло­ний бывает матовая или блестящая с глянцем, сухая или влажная, гладкая или шероховатая. Гладкие колонии обозна­чают буквой S (smooth), шероховатые — буквой R (rough), что означает соответственно “гладкий” и “шероховатый”. Ме­ханизм формирования гладких и шероховатых форм колоний обусловлен различием процессов клеточного деления. Мик­робные клетки в колониях S-форм располагаются, соприка­саясь своими боковыми поверхностями, клетки R-форм, сохраняя при делении цитоплазматические мостики, об­разуют цепочки, которые, накладываясь, друг на друга, об­условливают шероховатую поверхность и неровный край колонии.

Переход S-форм в R-формы наблюдается при диссо­циации. Явление диссоциации у патогенных микробов на­блюдается под действием антибиотико - и химиотерапии, фак­торов специфического иммунитета, формирующихся в течение инфекционного процесса, а также факторов внешней среды. Среди шероховатых форм колоний различают: складча­тые, гирозные, по виду напоминающие исчерченную извили­нами поверхность мозга; бородавчатые, концентрически или радиально исчерченные; шагреневые, т. е. мелкозернистые.

Цвет колонии определяется пигментом, который проду­цирует культура микробов. Преобладающее большинство патогенных бактерий пигмента не образует, вследствие чего колонии их бесцветны или молочно-мутного цвета, похожи на опал. В проходящем свете такие колонии в большей или меньшей степени прозрачны. Пигментообразующие виды мик­робов дают колонии различных цветов: кремовые, желтые, золотисто-оранжевые, синие, красные, сиреневые, черные и др.

Структура колоний определяется в проходящем све­те при слабом увеличении микроскопа, суженной диафрагме или при несколько опущенном конденсоре. У пигментирован­ных колоний и колоний, не пропускающих света, она не опре­деляется.

По характеру структуры различают следующие виды ко­лоний:

1) гиалиновые — бесцветные, прозрачные, без видимой определенной структуры;

2) зернистые, которые в зависимости от величины зерен разделяются на мелко - и грубозернистые;

3) нитевидные или волокнистые, характеризующиеся на­личием длинных, густо переплетающихся нитей в толще ко­лонии.

Колонии бывают однородные и неоднородные. Строение первых одинаково во всех частях, у вторых центральная часть отличается от периферической или отдельные сектора имеют строение, неодинаковое с остальной массой.

Консистенцию колонии, определяющую ее физиче­ское состояние, исследуют посредством прикосновения или взятия из нее части материала бактериальной петлей. По характеру консистенции колонии бывают:

1) пастообразные, легко снимающиеся и размывающиеся по поверхности питательной среды наподобие сливочного масла;

2) вязкие или слизистые, прилипающие и тянущиеся за петлей;

3) волокнистые или кожистые, плотные, снимающиеся с поверхности питательной среды в виде упругой пленки, соот­ветствующей величине и форме колонии;

4) хрупкие, сухие, рассыпающиеся при прикосновении петли.

Особенности микробного роста на жидких питательных средах. На жидких питательных средах характер роста мик­робов менее разнообразен, чем на плотных питательных средах. Однако и здесь выявлены следующие формы роста бак­терий.

1. Рост бактерий с равномерным помутне­нием среды, цвет которой остается неизмененным или из­меняется в соответствии с цветом водорастворимого пигмен­та, образующегося в культуре микроба. Такой рост харак­терен для многих патогенных бактерий, относящихся к груп­пе факультативных анаэробов.

2. Придонный рост бактерий характеризуется обра­зованием осадка на дне пробирки с жидкой питательной сре­дой. Осадок может быть скудным или обильным, крошковидным, гомогенным, волокнистым или в виде крупных рыхлых хлопьев, по консистенции вязким, слизистым, хрупким или пастообразным. Питательная среда над осадком может быть прозрачной или мутной. Цвет осадка и среды, находящейся над ним, определяется наличием пигмента, продуцируемого культурой микробов. Если культура пигмента не образует, цвет среды не изменяется, а осадок приобретает, как прави­ло, серовато-белый или желтоватый цвет. Придонный рост специфичен для бактерий с анаэробным типом дыхания.

3. Пристеночный рост бактерий выражается в том, что питательная среда, находящаяся в пробирке, остается совершенно прозрачной. Бактерии растут, образуя более или менее крупные рыхлые хлопья или, наоборот, компактные зерна, прикрепленные к внутренней поверхности стенок со­суда, с которых в зависимости от вида бактерий снимаются легко или с трудом.

4. Поверхностный рост бактерий характеризуется появлением на поверхности жидкой питательной среды пленки, внешний вид и характер которой могут быть раз­личны:

а) пленка тонкая, нежная, бесцветная, имеет вид едва заметного налета, исчезающего при встряхивании пробирки и взбалтывании среды;

б) пленка влажная, толстая, хорошо видимая простым глазом, вязкой, слизистой консистенции, прилипает к петле и тянется за ней;

в) пленка плотная, сухая, внешним видом напоминает ку­сочки кожи и при попытке взятия из нее материала сни­мается целиком в виде круглого диска, соответствующего диаметру пробирки:

г) пленка плотная, сухая, со сморщенной, а иногда боро­давчатой поверхностью, краями прикрепленная к стенкам со­суда; при взбалтывании жидкости или прикосновении бакте­риальной петли разбивается на кусочки, погружающиеся в глубь жидкости.

Цвет пленки, как и питательной среды, зависит от пигмен­та, вырабатываемого растущей культурой микробов. Рост бактерий в виде поверхностной пленки характерен для микробов-аэрофилов.

Рост на полужидкой питательной среде. Для выявления особенностей микробного роста на полужидкой питательной среде исследуемую культуру засевают в столбик 0,2—0,5% полужидкого агара. Для того чтобы особенности роста про­являлись наиболее четко, прокол среды делают в непосред­ственной близости к стенке пробирки. Посев, произведенный таким образом, дает возможность выявить подвижные расы микробов и дифференцировать их от неподвижных.

Подвижные микробы в столбике полужидкого агара вы­зывают выраженное помутнение, распространяющееся более или менее равномерно по всей толщине среды.

Неподвижные формы микробов растут только по ходу прокола среды, напоминая сосульки цилиндрической или ко­нической формы. При этом окружающая среда остается со­вершенно прозрачной.
ЗАНЯТИЕ 7. Методы изучения биохимических свойств микроорганизмов.

Цель занятия. Изучить биохимическую дифференциацию микроорганизмов.

Материалы и оборудование. Набор питательных сред. Изучаемая культура микроорганизмов.

МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКИХ СВОИСТВ МИКРООРГАНИЗМОВ

В жизнедеятельности микробов ферменты играют боль­шую роль. Они являются обязательными участниками разно­образных биохимических реакций, лежащих в основе функ­ций питания, дыхания, размножения. Каж­дый вид микроорганизмов продуцирует постоянный для него набор ферментов, одни из которых расщепляют в разной сте­пени белки и углеводы, а другие вызывают окисление и вос­становление различных субстратов. Стабильность ферментативных систем бактерий позволя­ет использовать биохимические свойства бактерий в сочета­нии с их морфологическими, культуральными и другими по­стоянными признаками для определения видов и типов бак­терий. Для обнаружения ферментов исследуемую культуру мик­робов засевают на специальные дифференциально-диагности­ческие питательные среды.

Сахаролитические свойства микроорганизмов. Свойство расщеп­лять углеводы и высокоатомные спирты, которые принято объединять в одну группу, именуемую сахарами, присуще многим микробам. Под действием сахаролитических ферментов бактерий сахара расщепляются на альдегиды и кислоты. Конечными продуктами их расщепления явля­ются газообразные вещества: С02 и Н2. Характерно, что различные виды и даже разновидности микробов относятся по-разному к одним и тем же сахарам. Так, например, одни бактерии, ферментируя лактозу, оста­ются нейтральными в отношении глюкозы, другие, наоборот, сбраживают глюкозу, а третьи, наиболее активные, вызыва­ют расщепление и глюкозы, и лактозы. Для обнаружения сахаролитических ферментов исследуе­мую культуру бактерий засевают в питательные среды Гисса, называемые также “пестрым” рядом. Короткий “Пестрый” ряд Гисса содержит обычно 5 пробирок: с глюкозой, лактозой, маннитом, мальтозой и сахарозой. При некоторых исследова­ниях для более углубленного изучения биохимических свойств выделенного микроба ряд Гисса дополняют дульцитом, сорбитом, ксилозой, арабинозой и некоторыми другими сахарами. Название “пестрый” ряд обусловлено тем, что под дей­ствием ферментов микроба одни углеводы остаются неизмен­ными и, следовательно, цвет питательной среды не меняет­ся, в то время как другие сахара расщепляются, образуя кислые продукты распада, которые изменяют цвет индикато­ра и соответственно цвет питательной среды. Среды Гисса бывают жидкими и полужидкими (с добав­лением 0,2—0,5% агар-агара). В пробирки с жидкими сре­дами Гисса для обнаружения газов, являющихся конечными продуктами распада сахаров, опускают “поплавок” — трубоч­ку диаметром 0,5—0,7 см, запаянную с одного конца. “По­плавок” помещают запаянным концом кверху; при стерили­зации он полностью заполняется питательной средой. При образовании в среде газообразных продуктов они вытесняют часть жидкости, находящейся в “поплавке”, вследствие чего у запаянного конца его собирается воздушный пузырек. В полужидких средах Гисса газообразование определяют по наличию мелких пузырьков газа в толще среды и стой­кой пены на ее поверхности. Таким образом, при изучении сахаролитических фермен­тов, выделяемых микробами, учитывают не только явления расщепления тех или иных Сахаров по кислотообразованию, но и глубину ферментативного процесса по наличию в пита­тельной среде конечных газообразных продуктов. Пробирки с набором сред Гисса ставят в штатив в один ряд. На каждой пробирке надписывают название сахара, со­держащегося в среде. На первой пробирке каждого ряда, кроме названия сахара, указывают номер или вид исследуе­мой микробной культуры. Культуру берут на кончик петли в очень небольшом количестве и засевают по общепринятой методике.

Протеолитические свойства микроорганизмов. Некоторые виды микроорганизмов продуцируют и выделяют во внешнюю сре­ду протеолитические ферменты — протеазы, катализирующие расщепление белков. В результате расщепления молекулы белка образуются высокомолекулярные промежуточные про­дукты распада — пептоны, альбумозы и полипептиды. Под действием других протеолитических ферментов пептоны в свою очередь расщепляются на полипептиды (соединения двух или нескольких аминокислот) и отдельные аминокис­лоты. Для выявления протеолитических ферментов исследуемую культуру микроба засевают в питательную среду, содержа­щую тот или иной белок. Чаще всего для этой цели приме­няют желатин, реже — свернутую лошадиную сыворотку, коа­гулированный яичный белок, молоко или кусочки вареного мяса. Протеолитическая активность одного и того же микроба при определении ее на разных питательных средах будет проявляться неодинаково, что обусловлено специфичностью ферментов. Поэтому для разных видов микробов рекоменду­ют питательные среды различного состава.

Определение протеолитической активно­сти микробов

а) На желатине. Мясопептонный желатин разливают в пробирки столбиком по 5— 6 мл. Посев производят уколом, погружая петлю с исследуе­мой культурой в глубь питательной среды до дна пробирки. Микробы, способные расти при низкой температуре, остав­ляют стоять в комнате при 20—22°С. Остальные посевы ин­кубируют в термостате при 37 °С. Вместе с опытными про­бирками в термостат ставят одну или две пробирки с неза­сеянным желатином для контроля. При температуре 37 °С желатин плавится, поэтому после инкубации пробирки, вы­нутые из термостата, опускают в холодную воду или ставят в холодильник. После застудневания желатина в контроль­ных пробирках приступают к просмотру роста и учету изме­нений в питательной среде опытных пробирок. Там, где под действием фермента желатиназы произошло расщепление белков желатина, отмечается разжижение питательной сре­ды. Пробирки, в которых после суточного инкубирования среда остается без изменения, оставляют в термостате, наблю­дение за изменением среды ведется в течение 20 сут. В прото­коле исследования обязательно отмечают день появления признаков разжижения среды, степень и характер ее разжи­жения.

б) На молочном агаре Эйкмана. Молочный агар Эйкмана, разлитый и остуженный в чашках Петри, засевают исследуемой культурой микробов. Посев делают петлей или шпателем так, чтобы получить изолированные ко­лонии. Через 24—48 ч инкубации в термостате культуры, продуцирующие протеолитический фермент, обусловливают пептонизацию молочного белка — казеина, в результате чего вокруг таких колоний образуются прозрачные зоны, четко выделяющиеся на общем молочно-мутном фоне среды.

в) На свернутой кровяной сыворотке. Куль­туру исследуемых аэробных микробов засевают на чашки, анаэробных — уколом в столбик свернутой лошадиной сыво­ротки, инкубируют в термостате при 37 °С. Штам­мы, продуцирующие протеолитические ферменты, разжижая питательную среду, образуют углубления вокруг колоний или на поверхности столбика среды.

г) В бульоне с куриным яичным белком. В пробирку с мясопептонным бульоном или бульоном Хоттингера, содержащим кусочек свернутого куриного белка, вносят одну петлю исследуемой культуры микроба. Посевы просматривают ежедневно в течение 5 дней. Протеолитически активные культуры микробов расщепляют коагу­лированный яичный белок; кусочки белка, содержавшиеся в среде, заметно уменьшаются в размере, превращаясь в крошкообразную массу, или полностью растворяются. Аналогичным образом проявляются протеолитические свойства микробов в средах с кусочком вареного мяса.

Некоторые виды патогенных микробов с выраженной про­теолитической активностью обладают способностью расщеп­лять белок и пептон до продуктов глубокого распада: индо­ла, сероводорода, мочевины и аммиака. При определении видов и дифференциации разновидно­стей патогенных микробов наибольшее значение имеет выяв­ление двух первых продуктов: индола и сероводорода.

Определение индола в культуре микроор­ганизмов. Индол образуется при расщеплении сложной гетероциклической кислоты - триптофана. Для выявления индолообразования петлю исследуемой культуры засевают в среду Строгова или другие среды, рекомендуемые для обнаружения индола. Тотчас после посева в пробирку вносят полоску индикаторной бумаги, пропитанную раствором щавелевой кислоты, так, чтобы индика­торная бумага не касалась питательной среды. Для этого верхнюю треть бумажной полоски прижимают пробкой к стенке пробирки. Посевы инкубируют 24—48 ч при темпера­туре 37°С. Образование индола определяют по окрашиванию нижнего конца индикаторной бумаги в бледно-розовый цвет, хорошо заметный в проходящем свете.

Определение сероводорода. Сероводород яв­ляется конечным продуктом расщепления аминокислот: цистина, цистеина и метионина, содержащих серу. Петлю ис­следуемой культуры микробов засевают в пробирку с мясопептонным бульоном или бульоном Хоттингера. Тотчас после посева в пробирку вносят пропитанную ацетатом свинца по­лоску индикаторной бумаги на определение сероводорода. В положительных случаях образующийся в культуре сероводород вступает в соединение с бесцветным ацетатом свинца и превращается в сульфат свинца, который придает индикаторной бумаге черно-бурое окрашивание.

Окончательный учет результатов на образование индола и сероводорода проводят на 7—10-й день после посева, так как процесс ферментативного расщепления белка и образова­ния конечных продуктов распада происходит иногда в тече­ние длительного времени.

Окислительно-восстановительные свойства микроорганизмов. В культуре микробов могут быть обнаружены окисли­тельно-восстановительные ферменты, связанные главным об­разом с дыхательной функцией микроорганизма. Как известно, процесс окисления субстрата может про­исходить посредством присоединения к нему кислорода с участием ферментов оксидаз или в результате отщепления от него водорода с участием ферментов дегидраз. Для этого типа реакции характерно то, что окисление какого-либо од­ного вещества всегда сопровождается восстановлением (ре­дукцией) другого органического вещества. Первое вещество, от которого отщепляется водород, называют донором, а то вещество, к которому он присоединяется, - акцептором. Акцептором водорода чаще всего является кислород воз­духа, однако им могут быть также многие органические со­единения, способные легко окисляться и восстанавливаться. С целью выявления ферментов дегидраз и определения их активности в практике микробиологических исследований предложен метод, основанный на введении в питательную среду органической краски, выполняющей роль акцептора водорода. В результате присоединения водорода краситель восстанавливается, превращаясь в бесцветное соединение, называемое лейкобазой. При обильном доступе кислорода оно может вновь окислиться и приобрести прежний цвет. В качестве акцептора водорода используют метиленовый синий, лакмусовую настойку, малахитовый зеленый, индиго-кармин, нейтральный красный и др. Для выявления редуцирующих свойств микроорганизмов указан­ные красители добавляют к обычным питательным средам: мясопептонному бульону, мясопептонному агару, молоку. Один и тот же вид микроба ведет себя неодинаково по отношению к краскам разного состава. Это свойство микро­ба использовано в микробиологической практике в качестве дифференциального признака. Бактерии брюшного тифа ре­дуцируют метиленовый синий, но не редуцируют лакмуса и не изменяют нейтрального красного в противоположность ки­шечной палочке, которая остается нейтральной в отношении метиленового синего, но восстанавливает лакмус и нейтраль­ный красный.

Определение редуцирующей способности.

1. В 5 мл среды - молока с метиленовым синим - засевают петлю исследуемой культуры с плотной питательной среды или 0,1 мл 18-часовой бульонной культуры н после ч инкубации учитывают результаты роста. При положительной реакции на редукцию метиленового синего среда из голубой становится кремового цвета, а при слабоположи­тельной — приобретает зеленоватое окрашивание.

2. .Пробирки с лакмусовым молоком, средой Минкевича засевают так же, как молоко с метиленовым синим, суточной культурой с плотной или жидкой питательной сре­ды. Посевы инкубируют в термостате в течение 10 дней, еже­дневно наблюдая за изменением цвета среды. Редукция лак­муса проявляется полным обесцвечиванием молока, имеюще­го розовато-сиреневый цвет до посева. В протоколе иссле­дования редукцию лакмуса обозначают буквой Р.

Среда Минкевича позволяет также выявлять кислото - или щелочеобразование, выражающееся соответственно в покрас­нении или посинении молочной среды. Образование кислоты обозначается буквой К, щелочи — буквой Щ.

Определение фермента каталазы. Некоторые виды микроорганизмов, принадлежащие к группе аэробов, в процессе дыхания образуют перекись водорода, являющую­ся клеточным ядом. Количество перекиси водорода в культуре никогда не достигает высоких концентраций, так как по ме­ре образования перекись расщепляется на воду и молекуляр­ный кислород при участии фермента каталазы. На поверх­ность микробной культуры, выращенной на плотной пита­тельной среде в чашке Петри, наносят 1—2 мл 1% раствора перекиси водорода так, чтобы она покрывала поверхность культуры тонким слоем. Появление пузырьков газа в слое нанесенной жидкости свидетельствует об образовании кис­лорода в результате расщепления перекиси водорода под действием каталазы. Подобный результат в протоколе опыта отмечается знаком + как положительный результат реакции на каталазу.
ЗАНЯТИЕ 8. Методы микробиологического исследования воды, воздуха и почвы.

Цель занятия. Ознакомиться с правилами взятия и пересылки проб воды и почвы для исследования. Определить общее количество живых микроорганизмов в 1 г или 1 мл. Исследо­вать воздух седиментационным (метод Коха).

Оборудование и материалы. Стерильные колбы с пробкой, пробирки с 9 мл стерильной воды в каждой, стерильных чашки Петри, завернутые в бумагу. Стерильные пипетки (на 2 мл каждая). Пробирки с расплавленным МПА, по 12 мл в каждой. Микробиологические петли. Предметные и покровные стекла. Раствор Люголя. Кедровое масло. Горелки.