Целью включения такого широкого разнообразия лекарств в исследование, в том числе тех, которые обычно не считаются противосудорожными, было получение данных об эффективности в качестве основы для определения лучшего терапевтического агента для лечения отравления TETS. Одно исследование с идентичным воздействием и методами лечения предлагает высокую степень внутренней валидности, чего нельзя достичь путем сравнения терапевтических результатов в различных отдельных исследованиях. Более того, включение нескольких доз каждого препарата в верхний предел терапевтического диапазона обеспечивает точную оценку потенциала каждого препарата для лечения отравления TETS. Кроме того, были собраны данные о потреблении пищи в течение ночи, изменениях веса и поведенческих характеристиках, чтобы информировать не только об общей безопасности всех исследуемых терапевтических средств, но также для предварительного определения терапевтического результата после острого лечения. Материалы и методы Химические вещества: TETS (безводный) был получен из Химического биологического центра Эджвуда (Абердинский испытательный полигон, Мэриленд) с чистотой около 78% и хранился при 4 ° C. Первичной примесью (примерно 16% образца) в порошке был гексаметилентрисульфогексамин (HEXS), распространенный загрязнитель TETS (Hondrogiannis and Cullinan, 2011), который, как считается, примерно в 50 раз менее токсичен, чем TETS, и поэтому считается, что он практически не влияет на текущее исследование. TETS растворяли в ацетоне в концентрации 2 мг / мл. Ацетон (≥99,5%) был приобретен у Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури). Для лечения предпочтительно использовались препараты и растворители класса USP, если они были доступны. Для диазепама, фенобарбитала и пентобарбитала (по объему) использовали комбинированный носитель: 62% пропиленгликоль (Fisher Chemical; Питтсбург, Пенсильвания), 18% полиэтиленгликоль 400 (AppliChem Inc; Мэриленд Хайтс, Миссури), 10% этанол (Sigma Aldrich), 8% воды и 2% бензилового спирта (Sigma Aldrich). Два разных транспортных средства, используемые для лоразепама, состояли (по объему) из 80% пропиленгликоля, 18% полиэтиленгликоля 400, 2% бензилового спирта или 45% (2-гидроксипропил) -β-циклодекстрина (HPBCD, Sigma Aldrich) в стерильной воде. Аллопрегнанолон (4 мг / мл; Tocris Bioscience; Бристол, Великобритания) был свежеприготовлен перед использованием в 45% HPCD путем нагревания до 50 ° C и выдерживания до растворения. Солевой раствор (0,9% хлорид натрия) использовали для лечения мидазолама, кетамина, дексмедетомидина и этанола.
Кетамин (Ketaset ©, 100 мг / мл) и дексмедетомидин (Dexdomitor ©, 0,5 мг / мл) были приобретены в Zoetis (Парсиппани, Нью-Джерси). Лоразепам (4 мг / мл), мидазолам (5 мг / мл) и диазепам (5 мг / мл) были приобретены в Hospira (Lake Forest, IL). Фенобарбитал натрия (130 мг / мл) был приобретен в West-Ward Pharmaceutical (Итонтаун, Нью-Джерси). Нембутал © (пентобарбитал натрия 50 мг / мл) был приобретен в компании Akorn Pharmaceuticals (Лейк-Форест, Иллинойс). Fatal Plus © (пентобарбитал натрия 390 мг / мл) был приобретен у VortechPharmaceuticals (Дирборн, Мичиган). Чистый этанол был приобретен у Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури) и разбавлен до 60% (об. / Об.) Стерильной водой. Раствор этанола хранили в холодильнике при 4 ° C до дня использования. Испытуемые: самцы крыс Sprague Dawley (SAS SD 400) были получены из Charles River (Wilmington, MA) и содержались индивидуально при 12-часовом цикле свет / темнота. Все эксперименты проводились в световой фазе. Регулирование питания использовалось для увеличения вероятности быстрого потребления небольшого кусочка пищи (Froot Loops®; Kellogg Company, Батл-Крик, штат Мичиган) и для обеспечения минимального или полного отсутствия содержимого желудка во время перорального воздействия TETS. Отмеренную порцию корма для крыс давали ежедневно во второй половине дня для поддержания субъектов на уровне 90% от веса при свободном кормлении, определенного на основе установленных кривых роста. Любая еда, оставшаяся в клетке на следующее утро, взвешивалась и записывалась как потери корма. Вес крысы во время воздействия составлял 250–340 г (M = 295 г, SD = 14 г). В домашних клетках вода была доступна ad libitum. Протокол эксперимента был одобрен Комитетом по уходу за животными и их использованию при Медицинском научно-исследовательском институте химической защиты армии США (USAMRICD), и все процедуры проводились в соответствии с принципами, изложенными в Руководстве 2011 г. Уход за лабораторными животными и их использование и Закон о благополучии животных 1966 года (PL89–544) с поправками. USAMRICD - это исследовательский центр, полностью аккредитованный Международной ассоциацией по оценке и аккредитации лабораторных животных.
2.1. Обучение добровольному потреблению и воздействие За неделю до воздействия крыс приучали ежедневно (пн-пт) быстро потреблять целый кусок хлопьев Froot Loops®, как описано ранее (Rice et al., 2017). В день воздействия примерно 90 мкл (с поправкой на индивидуальный вес крысы) TETS в ацетоне (2 мг / мл) или только ацетоне добавляли порциями к кусочку злака, чтобы получить дозу 400 или 600 мкг / кг (скорректировано 312 или 468 мкг / кг). для чистоты) доза ТЭЦ. Отводилось примерно от 40 минут до 1 часа, чтобы дать ацетону испариться, прежде чем поместить его в камеру для экспонирования; Считалось, что воздействие произошло после того, как был съеден весь кусок злака. Признаки токсичности наблюдались непрерывно в течение первого часа после воздействия и один раз в час до конца рабочего дня (до 5 часов после воздействия). Кроме того, признаки токсичности наблюдались через 24 часа после воздействия, непосредственно перед началом сеанса избегания челнока. В состав группы лечения входили крысы, получавшие TETS и тестируемое лекарственное средство, группа по безопасности лекарственных средств, получавшая кусочек хлопьев с нанесенным ацетоном и тестируемое лекарство, группа положительного контроля, получавшая кусочек хлопьев TETS и лекарственное средство, и контрольная группа носителя, получавшая кусочек хлопьев с ацетоном и лекарство транспортное средство. Крыс случайным образом распределяли по группам в когорте до воздействия с использованием функции случайных чисел Microsoft Excel. Тестируемые препараты (или носители) вводили внутрибрюшинно через 10 минут после воздействия. Объемы лекарств и контрольных носителей не поддерживались постоянными из-за большого разброса растворимости тестируемых лекарств. Диапазон объемов составлял от 1 мл / кг веса тела крысы до 15 мл / кг (60 мг / кг аллопрегнанолона), в зависимости от растворимость препарата. В случае, если объем дозы был менее 1 мл / кг, препарат разводили в физиологическом растворе до объема, обеспечивающего объем дозы не менее 1 мл / кг.
2.3. Избегание шаттлбокса Через 24 часа после воздействия TETS животных оценивали в задании активного избегания для измерения обучения и производительности. Сеанс активного избегания проводился в испытательных камерах GEMINI ™ (San Diego Instruments Inc., Сан-Диего, Калифорния), которые имеют два отдельных отделения и набор фотолучей для определения местоположения крысы. Сеанс избегания начинался с 5-минутного периода акклиматизации, в течение которого все освещение камеры и звук были выключены. В каждой тестовой сессии было представлено 50 дискретных испытаний, разделенных интервалом между испытаниями (20 ± 5 с). В каждом испытании определялось местоположение тераты, и в этом отсеке подавался предупреждающий стимул (WS), состоящий из света и звукового давления
75 дБ. Неспособность пройти в темный отсек в течение 5 секунд привела к скремблированию электрического тока 1,2 мА, пока продолжалась WS. Переход в темный отсек в течение 15 с прекращал все стимулы (WS, шок) и регистрировался как реакция бегства. Неспособность добраться до темного отсека в течение максимальной продолжительности разряда 15 с регистрировалась как «неудавшийся побег». Если происходило 10 последовательных попыток «неудачного побега», животное считалось недееспособным, и сеанс прекращался. Металлические сетки очищали сразу после каждого сеанса, используя 70% изопропиловый спирт и губку для чистки. После завершения задачи избегания челнока крыс умерщвляли передозировкой раствора на основе пентобарбитала (Fatal Plus ©), вводимого внутрибрюшинно.
2.4. Анализ данных животных, подвергшихся воздействию TETS, которые были умирающими (т. Е. Не реагировали, простреливались и задыхались) во время лечения или до него, были исключены из исследования. Данные о выживаемости (процент выживания) анализировали с использованием z-критерия с уровнем значимости (α), установленным на 0,05. Был также проведен апостериорный анализ данных о выживаемости с использованием одностороннего z-теста с преобразованием арксина (G * Power v. 3.1.92). Статистически значимый z-критерий (р <0,05) и мощность ≥,80 считались показателями большей выживаемости по сравнению с носителем. Статистический анализ пищевой стадии wa, процентного изменения массы тела и процента избегания проводился для каждого лечения с использованием однофакторного дисперсионного анализа ANOVA с тестом множественных сравнений Даннета для сравнения дозированных групп с контрольной группой. Экспериментальные данные предполагали потенциальный эффект носителя для потери пищи и процентное изменение массы тела. Статистический анализ для изучения возможных различий между транспортными средствами был выполнен с использованием одностороннего анализа ANOVA с тестом множественных сравнений Даннета для сравнения различных групп транспортных средств с контрольной группой с физиологическим раствором.
3. Результаты 3.1. Воздействие TETS В начальных экспериментах крысы в одной когорте подвергались воздействию 400 мкг / кг TETS, и тяжесть токсических признаков была меньше, чем ожидалось на основе прошлых экспериментов; поэтому в качестве положительного контроля добавляли еще четыре крысы (TETS + носитель). Добавленные крысы также показали менее серьезные признаки интоксикации, включая более низкий, чем ожидалось, процент животных с судорогами. Поэтому во всех дальнейших экспериментах доза TETS была увеличена до 600 мкг / кг для достижения тяжелой интоксикации у большинства животных. Крысы, получавшие меньшую дозу TETS (TETS + лекарство, n = 11; TETS + носитель, n = 5), были исключены из анализа данных. Данные по крысам в этих когортах, которые были отнесены к группе лекарственной безопасности (ацетон + лекарственное средство, n = 2) или отрицательному контролю (ацетон + носитель, n = 4), были включены во все анализы. Только 5 из 510 крыс, участвовавших в исследовании исследования были исключены из-за не быстрого или полного употребления злаков. Семь крыс умерли или умерли до лечения (<10 мин после употребления злаков) и впоследствии были исключены. Из-за ошибки в расписании кормления вне протокола эксперимента 8 крысам давали больший рацион за ночь перед воздействием. Все эти крысы, которые потребляли злаковые, зараженные TETS, не проявляли серьезных признаков интоксикации и поэтому были исключены, однако две крысы были контрольными по безопасности лекарственного средства (ацетон + лекарственное средство) и были включены в исследование. Три крысы из разных когорт были исключены после частичных инъекций терапевтического препарата. Появление токсических признаков происходило в течение 1–5 минут после приема, начиная с летаргии и миоклонических подергиваний, обычно прогрессирующих тотонно-клонических судорог. Примерно 71,3% крыс испытали тонико-клонические судороги до или во время лечения (M = 7 мин, SD = 2 мин) после воздействия. Первоначальные судороги, возникшие после лечения, наблюдались у 28 из 363 (7,7%) крыс. Судороги не наблюдались в течение первого часа непрерывного наблюдения после воздействия или во время любых ежечасных проверок у остальных животных (20,9%).
Вводимые большие дозы терапевтических средств часто приводили к введению больших объемов носителей контрольным животным. Предварительные результаты предполагают возможный эффект носителя после больших инъекций носителей, содержащих пропиленгликоль, который, как было продемонстрировано, обладает некоторой противосудорожной активностью (Gasior et al., 1997). Первоначально эксперимент был разработан с целью объединения всех контрольных носителей в одну группу. Однако возможность воздействия носителя на выживаемость потребовала добавления дополнительных животных в контрольные группы носителя. Животные, которым вводили физиологический раствор (n = 19), показали худшие результаты: 24-часовая выживаемость составила 14%, в то время как выживаемость при использовании всех других транспортных средств колебалась в пределах 30-40%. Выживаемость в каждой из групп носителя (HPBCD, n = 14; комбинация, n = 35; и носитель лоразепама, n = 13) достоверно отличалась от физиологического раствора (p <0,001 для каждой), но не отличалась существенно от друг друга. Однако наблюдаемая мощность при сравнении носителей с физиологическим раствором была 0,51 или ниже, и поэтому носители были объединены (n = 53) для оценки эффективности лекарственного средства на 24-часовую выживаемость. Эффективность Ряд обработок увеличивал 24-часовую выживаемость после воздействия 600 мкг / кг TETS, но результаты только нескольких лекарств и доз были статистически значимыми и достаточно мощными, чтобы предполагать существенную эффективность (рис. 1). Как класс бензодиазепины были наиболее эффективными в повышении выживаемости после приема TETS (рис. 1A). Однократные дозы диазепама (12,5 мг / кг, p <0,01, наблюдаемая мощность = 0,92) и мидазолама (25 мг / кг, p <0,001, наблюдаемая мощность = 0,99) обеспечивали достаточную защиту с показателями выживаемости. 80% и 100% соответственно. Лоразепам был эффективен при 12,5 мг / кг (выживаемость 100%; p <0,001, наблюдаемая сила = 0,99) и 25 мг / кг (выживаемость 90%; p <0,01, наблюдаемая сила = 0,89). Диазепам (25 мг / кг) значительно улучшил выживаемость, но не достиг нашего критерия наблюдаемой силы ≥80 (наблюдаемая сила = 0,77). Фенобарбитал оказался наиболее эффективным из протестированных барбитуратов (рис. 1В). Выживаемость 80% была достигнута при максимальной испытанной дозе (100 мг / кг, p <0,01, наблюдаемая мощность = 0,92), тогда как доза 25 мг / кг улучшила выживаемость по сравнению с носителем (70% по сравнению с 30%, p < 0,05), но наблюдаемая мощность составляла всего 0,77. Точно так же и дозы аллопрегнанолона в дозе 20 и 60 мг / кг, и доза кетамина 37,5 мг / кг (рис. 1C) имели значительную выживаемость 70% по сравнению с крысами, получавшими носитель (p <0,05 для всех), но не соответствовали критерию наблюдаемой мощности. Ни этанол, ни дексмедетомидин не обеспечивали значительной защиты от летальности TETS при любой испытанной дозе. Лоразепам был очень эффективен при дозе 12,5 мг / кг со 100% выживаемостью через 24 часа и требовал дальнейших исследований при более низких дозах. Дозу лоразепама уменьшали вдвое в последующих когортах, пока не была достигнута самая низкая испытанная доза (1,56 мг / кг). Примечательно, что выживаемость была высокой (> 88%) для всех протестированных доз лоразепама (рис. 2). Носитель лоразепама содержал 80% пропиленгликоля, что, возможно, способствовало повышению эффективности лоразепама. Чтобы исключить эту возможность, лоразепам вводили в самой низкой испытанной дозе (1,56 мг / кг) с 45% раствором HPCD и без пропиленгликоля. Выживаемость 88% лоразепама (1,56 мг / кг) в HPCD существенно не отличалась от 100% выживаемости животных, получавших такую же дозу лор-азепама в растворе, включающем пропиленгликоль, что позволяет предположить, что лор-азепам, а не носитель. ответственны за наблюдаемую высокую выживаемость.
Подавляющее большинство выживших крыс, подвергшихся воздействию TETS, независимо от лечения, демонстрировало признаки физических и поведенческих нарушений, включая, но не ограничиваясь: сутулость, пилоэрекцию и гиперчувствительность или пониженную чувствительность к стимулам. Потери пищи оставались высокими даже у выживших, которым вводили четыре наиболее эффективных препарата (рис. 3А). Только лоразепам 12,5 мг / кг (среднее ± стандартное отклонение; 46,5 ± 37,4%, p <0,0001) и фенобарбитал 100 мг / кг (44,6 ± 38,6%, p <0,0001) показали улучшение (снижение потерь пищи) по сравнению с необработанным контролем. Другие препараты или дозировки, не входящие в число четырех лучших терапевтических средств, включая кетамин 37,5 мг / кг (62,7 ± 23,7%, p <0,001, данные не показаны), пентобарбитал 12,5 мг / кг (73,9 ± 14,8%, p <0,05, данные не показано), а фенобарбитал в дозе 25 мг / кг (57,4 ± 25,1%, p <0,01, данные не показаны) показали снижение стадии wa-продукта питания по сравнению с контролями (92,8 ± 11,6%). Значительные неблагоприятные изменения массы тела наблюдались у контрольных носителей, а также у выживших, которым после воздействия TETS вводили четыре наиболее эффективных терапевтических средства (фиг. 3B). Фенобарбитал в дозе 25 мг / кг (-6,3 ± 2,9%, p <0,05; данные не показаны) и 100 мг / кг (-4,7 ± 5,1%, p <0,05) был единственным терапевтическим средством, которое показало меньшее снижение процента тела. вес, чем контроли транспортного средства, подвергнутые TETS (-10,8 ± 3,3%). Аналогично тому, что наблюдалось в отношении потерь пищи и потери веса, четыре лучших терапевтических препарата не оказали значительного улучшения результатов в тесте «шаттлбокс» (рис. 4). Серьезные нарушения наблюдались у выживших животных, независимо от лечения, у 24,8% (38/153) животных, удовлетворяющих критерию неудачного побега. Безопасность Практически все животные из контрольной группы по безопасности препарата и носителя полностью выздоровели (определялись отсутствием признаков токсичности) к 24-часовой отметке после введения препарата, за некоторыми примечательными исключениями. Эксперимент был разработан с минимальным количеством животных, отнесенных к группам безопасности лекарственных средств, потому что все протестированные препараты в настоящее время одобрены FDA или проходят клинические испытания. Самые высокие дозы лоразепама и этанола (50 мг / кг и 5,0 г / кг соответственно) неизменно приводили к летальному исходу при введении в отсутствие TETS. Введение максимального объема (12,5 мл / кг, что эквивалентно 50 мг / кг лоразепама) коммерческий носитель лоразепама (80% пропиленгликоль, 18% полиэтиленгликоль 400, 2% бензиловый спирт) привело к смерти одного из трех животных, при этом второе животное стало нечувствительным, сильно переохлажденным и почти страдающим апноэ через 24 часа после -инъекция. Серьезная наблюдаемая токсичность предполагает, что коммерческий носитель лоразепама, наиболее вероятно, содержащий пропиленгликоль в составе, в значительной степени способствовал токсичности лоразепама.
|
Скачать 43.38 Kb.