Главная страница
Навигация по странице:

  • Регуляторные элементы эукариот

  • Строение и экспрессия генов класса II

  • Альтернативный сплайсинг.

  • Транскрипция генов класса I

  • Транскрипция генов класса III.

  • транскрипция_у_эукариот. Транскрипция у эукариот


    Скачать 69.5 Kb.
    НазваниеТранскрипция у эукариот
    Дата18.04.2018
    Размер69.5 Kb.
    Формат файлаdoc
    Имя файлатранскрипция_у_эукариот.doc
    ТипДокументы
    #41482

    Транскрипция у эукариот
    В основном, механизмы транскрипции у эукариот сходны с хорошо исследованной транскрипцией прокариот. Однако, имеются и значительные различия. Главными из них являются:

    1. Транскрипция у эукариот происходит в ядре с участием трех разных РНК-полимераз. В отличие от прокариот, РНК-транскрипты у эукариот не соединяются с рибосомами до завершения транскрипции. Трансляция (синтез белка) на иРНК происходит после ее выхода из ядра в цитоплазму клетки.

    2. Ни одна из полимераз эукариот не способна самостоятельно связываться с промоторами транскрибируемых ими генов. Для присоединения к транскриптонам эукариот служат специфичные для каждой РНК-полимеразы белковые факторы транскрипции (TF-факторы). РНК-полимеразы I, II и III требуют участия факторов транскрипции, называемых TFI, TFII, TFIII соответственно.

    3. Первичный РНК-транскрипт подвергается процессингу или созреванию: обычно к 5׳-концу добавляется кэп (шапочка), а к 3׳-концу – хвост (поли (А)-фрагмент), внутренняя последовательность РНК подвергается сплайсингу. Первичные транскрипты (пре-мРНК) намного длиннее зрелых мРНК и локализованы в ядре клетки, образуя группу гетерогенных ядерных РНК (гя РНК). Укорочение происходит за счет вырезания не кодирующих белка последовательностей и сшивания смысловых последовательностей (сплайсинг).

    Процесс транскрипции состоит из трех этапов: инициации, элонгации и терминации.

    РНК-полимеразы эукариот


    1. РНК-полимераза I транскрибирует гены класса I: это гены 28S рРНК, 18S рРНК и 5,8S рРНК (т.е. все типы рРНК, кроме 5S рРНК).

    2. РНК-полимераза II транскрибирует гены класса II: это гены, кодирующие белки (т.е. продуктом РНК-полимеразы II является мРНК). Кроме того, РНК-полимераза II синтезирует малые ядерные РНК (мяРНК) (U1-U5).

    3. РНК-полимераза IIIтранскрибирует гены класса III, т.е. осуществляет синтез тРНК, 5S рРНК, U6 (это одна из мяРНК).

    4. РНК-полимераза IVтранскрибирует все виды РНК митохондрий, по строению сходна с прокариотической.

    В состав РНК-полимераз эукариот входит большое количество субъединиц, они значительно крупнее прокариотических. РНК-полимеразы эукариот состоят из двух больших субъединиц и 10-15 малых. Две большие субъединицы сходны у разных типов РНК-полимераз эукариот и аналогичны субъединицам РНК-полимераз прокариот.
    Регуляторные элементы эукариот
    Элементы, регулирующие транскрипцию у эукариот многочисленны и могут находиться как в районе промотора, так и на большом расстоянии от него (цис-элементы). Промотор каждого эукариотического гена имеет свой определенный набор регуляторных последовательностей. Кроме того, для регуляции транскрипции у эукариот используется большое количество регуляторных белков (транс-действующие факторы).

    1. Последовательность ТАТА (блок Хогнесса) располагается на расстоянии примерно 25-30 нуклеотидов левее от точки старта транскрипции (-25). Эта последовательность (ТАТАААА) встречается в большинстве эукариотических промоторов. Последовательность блока Хогнесса гомологична последовательности блока Прибнова в прокариотических промоторах (-10). Данная последовательность способствует денатурации двойной спирали, т.к. связи А-Т менее прочные и стабильные, чем связи Г-Ц.

    2. Последовательность ЦААТ (ЦААТ-бокс) локализован в большинстве промоторов генов эукариот примерно на 80 нуклеотидов левее стартовой точки транскрипции (-50-150). Представляет собой последовательность ГГЦЦААТЦТ. ЦААТ-бокс оказывает сильное влияние на частоту транскрипции, возможно определяет связывание РНК-полимеразы. Большинство генов эукариот содержат ТАТА-бокс и ЦААТ-боксы.

    3. ГЦ-мотивы. Последовательность из 10-15 пар Г-Ц находится на расстоянии 300-400 нуклеотидов левее точки старта транскрипции.

    4. Энхансеры (усилители). Эти элементы удалены от точки начала транскрипции на значительные расстояния (несколько тысяч нуклеотидных пар). Их действие на транскрипцию осуществляется через соответствующие регуляторные белки. Вероятно, влияние этих элементов на транскрипцию связано с изменением топологии цепей ДНК, в частности с образованием петель, что приближает регуляторные последовательности к промоторам, с которыми они взаимодействуют посредством белковых факторов. Действие энхансеров имеет неспецифический характер, т.к. они способны усиливать транскрипцию с любого доступного промотора. Вероятно энхансеры обладают тканеспецифичностью. Энхансеры локализуются на 5׳- и 3׳- концах генов, а также внутри генов.

    5. Сайленсоры (глушители). Эти регуляторные элементы располагаются на большом расстоянии от точки начала транскрипции. Они блокируют транскрипцию генов при помощи регуляторных белков. Эти белки, связываясь с ДНК закрывают доступ к регуляторным областям белков, активирующих транскрипцию.

    Строение и экспрессия генов класса II
    Гены класса II кодируют все цитоплазматические мРНК и все, за исключением одной (U6) мяРНК. Гены класса II имеют наиболее типичное для эукариот строение.

    Гены эукариот имеют прерывистое (мозаичное) строение - последовательности, кодирующие последовательность аминокислот в белке (экзоны) чередуются с последовательностями, не несущими информации о структуре белков (интроны). мРНК после синтеза подвергаются модификации (процессингу). Одним из этапов процессинга является сплайсинг – вырезание интронов и сшивание экзонов. Все транскрипты (мРНК, мяРНК) генов класса II имеют характерные группировки (кэпы) на 5׳-конце и poly(A)-хвосты на 3׳-конце, сразу за кодирующей последовательностью. Многие гистоновые мРНК и некоторые мяРНК не имеют хвостов. мРНК эукариот несет информацию о структуре одного белка (моноцистронная). Только в некоторых случаях (альтернативный сплайсинг) с одной мРНК может образовываться несколько близких по строению белков.

    Во время инициации транскрипции к регуляторным последовательностям промотора присоединяются факторы транскрипции. Эти белки участвуют в связывании РНК-полимеразы II с промотором. Факторами транскрипции РНК-полимеразы II являются: TFIIA, TFIIB, TFIIC, TFIID и т.д. Фактор TFIID непосредственно связывается с ТАТА-боксом, поэтому его называют ТАТА-связывающим белком. После связывания ДНК с этим белком, с ним ассоциирует не менее семи факторов транскрипции, формируя комплекс, который затем взаимодействует с РНК-полимеразой. В конце инициации образуется открытый комплекс, после чего начинается элонгация.

    Сразу после образования 5׳-конца мРНК происходит кэпирование – первый этап посттранскрипционной модификации (процессинга). Кэпирование состоит в присоединении к 5׳-концу синтезирующейся мРНК 7-метилгуанозина (шапочки). Кэп защищает 5׳-конец мРНК от действия нуклеаз.

    Транскрипция многих генов белков эукариот заканчивается далеко за сайтом, в котором происходит расщепление РНК с образованием 3׳-конца мРНК. Терминация осуществляется во множественных сайтах последовательности ДНК протяженностью в сотни, а иногда и тысячи пар нуклеотидов. Некоторые гены белков эукариот, напротив имеют четко определенные сигналы терминации транскрипции. Такие последовательности богаты остатками Т и А. Одна из них – последовательность ААТААА, находящаяся на 10-30 нуклеотидов левее сайта расщепления-полиаденилирования (ЦА). 3׳-конец РНК отщепляется ферментами в указанной точке, затем происходит полиаденилирование этого конца молекулы РНК. Поли (А)-хвост есть практически у всех мРНК, за исключением транскриптов гистоновых генов. В отсутствии поли (А)-хвоста РНК-транскрипты быстро деградируют под действием ферментов. Полиаденилирование является вторым этапом процессинга мРНК. После полиаденилирования образуется предшественник зрелой мРНК - гетерогенная ядерная РНК (гяРНК), которая содержит в своем составе последовательности интронов. Третьим этапом созревания мРНК является сплайсинг – процесс вырезания интронов и сшивание экзонов.
    Сплайсинг
    Сплайсинг – процесс вырезания интронов и сшивание экзонов.

    Существует несколько механизмов сплайсинга: аутосплайсинг, собственно сплайсинг и альтернативный сплайсинг.

    Аутосплайсинг осущестляется без участия каких-либо белков. Аутосплайсинг выявлен для генов рРНК у примитивных эукариот (Tetrahymena), мРНК и тРНК митохондрий и хлоропластов. Интрон содержится в 26S рРНК тетрахимены. Вырезание данного интрона и сшивание экзонов осуществляется в присутствии ионов магния и свободного гуанозина. Аутосплайсинг катализируется гуанозином, гидроксильная группа которого атакует фосфатную группу на 5׳-конце интрона, в результате чего разрывается фосфодиэфирная связь и высвобождается 3׳-конец экзона 1. Затем гидроксильная группа, содержащаяся на 3׳-конце экзона 1, атакует фосфатную группу на 3׳-конце интрона, что ведет к вычленению интрона и замыканию фосфодиэфирной связи между ОН-группой 3׳-конца экзона 1 и 5׳-фосфатной группой экзона 2. Таким образом, в результате реакции трансэтерификации без дополнительных затрат энергии осуществляется лигирование двух экзонов с образование зрелой рРНК. В состав вышепленного интрона входит последовательность из 19 нуклеотидов, которая представляет собой РНК-фермент (рибозим). Т.о. интрон обладает ферментативной активностью, необходимой для вырезания себя самого. Данный рибозим узнает последовательности ЦУЦУ в составе атакуемого субстрата.

    В настоящее время осуществляется искусственный синтез специально сконструированных рибозимов, способных расщеплять РНК вируса ВИЧ 1, что открывает возможности создания антивирусных преператов пренципиально нового типа.

    Собственно сплайсинг характерен для пре-мРНК высших эукариот. Интроны в незрелых предшественниках ядерных мРНК могут достигать большой длины и их удаление требует более сложного механизма. В сплайсинге пре-мРНК у высших эукариот задействован ряд белков, а также РНК особого вида – малые ядерные РНК (мяРНК). мяРНК богаты урацилом, поэтому они обозначаются как U1, U2, U3, U4, U5, U6 и т.д. Гены мяРНК транскрибируются РНК-полимеразой II и имеют различную локализацию в геноме: часть из них представляет собой независимые гены, не имеющие интронов, другая часть располагается внутри интронов генов, кодирующих белки (чаще рибосомальных).

    мяРНК присутствуют в ядрах в комплексах с белками, получившими название малые рибонуклеопротеиновые частицы (мяРНП). Комплекс мяРНК и мяРНП носит название сплайсингосомы. Сплайсингосома собирается на интроне перед его вышеплением. Различные мяРНК по принципу комплементарности связываются с пограничными участками интронов в РНК. Для этого взаимодействия существенны короткие последовательности, находящиеся на концах интронов. На 5׳-конце находится последовательность ГУ, на 3׳-конце – АГ. Взаимодействие мяРНК и мяРНП с концами интрона придает ему петлеобразную структуру. При этом сближаются концы экзонов, чему способствует образование неканонических водородных связей между двуми гуанинами, на 5׳- и 3׳-сайтах сплайсинга. Сближение экзонов создает условия для реакций трансэтерификации. В результате в интроне образуется структура типа «лассо» и он вышепляется с соединением экзонов.

    Альтернативный сплайсинг. Несколько экзонов, содержащихся в составе мРНК, могут сшиваться в разных комбинациях с образованием различных мРНК.

    У эукариот альтернативный сплайсинг мРНК, содержащих большое количество интронов, является эффективным способом регуляции активности генов, создает возможность для возникновения изоформ белков, наборы которых могут существенно различаться в различных клетках, тканях и органах многоклеточных организмов. Альтернативный сплайсинг позволяет организму синтезировать разные по структуре и свойствам белки на базе одного гена. Такие гены кодируют семейства родственных белков, участвующих в мышечных сокращениях, формировании цитоскелета, нервных волокон, молекул иммуноглобулинов, пептидных гормонов.

    В формировании альтернативных мРНК могут быть задействованы три основные механизма. Первый из них состоит в том, что для образования различных мРНК могут использоваться разные промоторы. В этом случае образуются транскрипты, имеющие по длине 5׳-концы и разное число экзонов. Такой механизм выявлен для пре-мРНК легкой цепи миозина позвоночных животных.

    Второй тип альтернативного сплайсинга имеет место при изменении сайта полиаденилирования. В этом случае изменяются размеры и структура 3׳-концевого участка пре-мРНК. Таким способом образуются два вида мРНК тяжелой цепи иммуноглобулинов.

    Третий тип альтернативного сплайсинга включает выбор различных экзонов из одинаковых пре-мРНК. При этом часть инторнов не включается в сплайсинг. Таким образом происходит сплайсинг пре-мРНК тропонина Т скелетных мышц млекопитающих, содержащий 18 экзонов. Выбор экзонов зависит от стадии развития организма: экзон 16 присутсвует в мРНК тропонина Т у взрослых, экзон 17 – у эмбрионов. Одной из причин возникновения альтернативных продуктов могут служить мутации, нарушающие последовательности сайтов сплайсинга и возникновение новых сайтов. Такой механизм выявлен у больных талассемией (у больных резко падает содержание гемоглобина). Т.о. подобные мутации могут стимулировать образование новых белков, а альтернативный сплайсинг может играть решающую роль в эволюции высших организмов.

    Процесс созревания РНК кроме кэпирования, полиаденилирования и сплайсинга может включать еще ряд модификаций первичной структуры, называемых редактированием РНК (эдитинг). К этим реакциям относятся модификации азотистых оснований (дезаминирование, метилирование, и др.), в результате которых образуются необычные для РНК основания (инозин, тимин, дегидроурацил). К редактированию относятся вставки и делеции нуклеотидов внутрь цепи РНК. В результате трансляции таких «отредактированных» РНК в клетке могут синтезироваться белки, аминокислотная последовательность которых будет не вполне соответствовать нуклеотидной последовательности ДНК матрицы (гена).
    Транскрипция генов класса I
    К генам класса I относятся гены рРНК. У большинства эукариот в состав рибосом входят 18S рРНК, 28S рРНК, 5,8S рРНК, 5S рРНК. Все эти рРНК, кроме 5S рРНК транскрибируются РНК-полимеразой I. Число генов, кодирующих рРНК, колеблется от сотен до нескольких тысяч в зависимости от вида эукариот.

    На долю генов класса I приходится половина общей транскрипционной активности в большинстве клеток эукариот.

    Гены рРНК находятся в одной или нескольких хромосомах (у человека около 200 генов рРНК, расположенных в 13, 14, 15, 21 и 22 хромосомах). В этих хромосомах расположены области с характерной морфологией, названные ядрышковыми организаторами, в которых и располагаются гены рРНК.

    Гены рРНК практически всех эукариот построены в виде длинных повторов типа «голова к хвосту». Как правило, кодирующие области генов 18S, 5,8S, и 28S рРНК сгруппированы в указанном порядке в одну транскрипционную единицу (кластер).

    Каждый кластер имеет длину от 7 до 14 т.н.п. (в зависимости от вида) и отделен от других кластеров межгенным спейсером, длина которого у разных видов значительно различается, но в пределах одного вида относительно постоянна.

    Единица трнскрипции начинается от области межгенного спейсера на 5׳-конце и заканчивается в разных сайтах межгенного спейсера за областью, кодирующей 28S рРНК.

    Кодирующие области генов рРНК у разных видов являются консервативными, а длина и нуклеотидные последовательности межгенных спейсеров сильно различаются от вида к виду.

    После завершения транскрипции происходит созревание про-рРНК (процессинг). Для рРНК он заключается в нарезании первичного транскрипта эндонуклеазами, и вышеплении зрелых рРНК при участии мяРНК (они взаимодействуют с пограничными участками спейсерных последовательностей в молекуле – предшественнике рРНК). Кроме того, происходит сплайсинг интрона в последовательности 28S рРНК.

    Сигналы инициации транскрипции генов рРНК видоспецифичны (т.е. свои для каждого вида). У млекопитающих обнаружено две последовательности, предположительно выполняющие функцию промотора. С этими последовательностями связываются соответствующие регуляторные белки, которые облегчают связывание РНК-полимеразы.

    Терминация транскрипции генов рРНК осуществляется в сайте, расположенном примерно на 200 н.п. (и более) левее последовательности 28S рРНК, находящейся на 3׳-конце кластера. Выявлены специфические последовательности, служащие сигналом к окончанию транскрипции. Они несколько отличаются у разных видов. У человека предположительно такая поледовательность выглядит следующим образом: 5׳-ГГГТТГАССА-3׳. Есть данные, что терминация в указанном сайте происходит при связывании белковых факторов транскрипции.
    Транскрипция генов класса III.

    Гены разных тРНК (в эукариотических клетках насчитывается 40 – 60 основных типов тРНК) также часто сгруппированы в кластеры, расположенные в разных хромосомах. У человека на гаплоидный геном приходится 1300 генов тРНК (по 10 – 20 копий для каждой тРНК). Характер организации генов тРНК в составе блоков сильно варьирует у разных организмов. Расположение генов тРНК в кластерах не столь регулярно, как в случае рибосомных генов: направление транскрипции близлежащих генов бывает противоположным, а гены могут быть разделены промежутками, включающими 100 - 150, а иногда и несколько тысяч нуклеотидных пар. Природа и функции участков ДНК, разделяющих гены тРНК, не выяснены.

    Промотор гена тРНК располагается внутри кодирующей последовательности и имеет два района (А- и В-боксы), необходимые для правильной и эффективной транскрипции. А-бокс локализован в области от +10 до +20 н.п., а В-бокс – между парами оснований +50 и +65. Канонические последовательности А- и В-боксов имеют вид: 5׳-ТГГЦNNАГТГГ-3׳ и 5׳-ГГТЦСГАNNЦ-3׳ (N – любой нуклеотид). Расстояние между А- и В-боксами составляет 50 н.п.

    В транскрипции генов тРНК участвуют факторы TFIIIA, TFIIIB, TFIIIC и т.д.

    В генах тРНК многих организмов имеется один интрон размером от 14 до 60 н.п. (в зависимости от вида тРНК). Он всегда локализуется в одном и том же месте у разных тРНК: через один нуклеотид от 3׳-конца антикодона. Единый транскрипт подвергается процессингу: нарезается эндонуклеазами и подравнивается экзонуклеазами. Интрон вышепляется при сплайсинге.

    Для терминации используются специальные последовательности на 3׳-конце, содержащие остатки тимина.


    написать администратору сайта