Бактерии 1-2. Триптофан стимулирует синтез иук до количеств 40 мкгмл культуральной жидкости, однако максимальное количество зависит от особенностей штамма
 Скачать 105.45 Kb.
|
1 2 2. Микробные метаболиты и их роль в формировании функциональных свойств В связи со все увеличивающимся влиянием на окружающую среду и здоровье человека токсических химически синтезированных соединений, в последнее время возрастает интерес к экологически безопасным способам их биодетоксикации, направленным на улучшение общего состояния почвы. Основная цель этих мероприятий – биоремедиация загрязн енных территорий, а также создание благоприятных условий для роста растений. Биотехнологии ремедиации загрязн енных почв с использованием полифункциональных микробных препаратов признаны в настоящее время наиболее перспективными [1]. Важным преимуществом биологических препаратов является отсутствие отрицательного влияния на окружающую среду. Известно, что одним из положительных свойств почвенных микроорганизмов является их способность синтезировать фитогормоны, стимулирующие рост и развитие растений. Использование биопрепаратов, содержащих фитогормоны микробного происхождения в растениеводстве перспективно ввиду простоты и сравнительной дешевизны получения, а также высокого сродства к растительной клетке и способности легко связываться и катаболизироваться [2]. Бактерии, относящиеся к группе PGPB (plant-growth-promoting bacteria), представители родов Bacillus и Pseudomonas, известны как продуценты фитогормонов [3]. При изучении видового распределения исследуемых штаммов по продукции ИУК в качественной реакции Сальковского установлено, что способность к биосинтезу ИУК присуща всем таксономическим группам взятых в эксперимент бактериальных штаммов. При этом представители различных групп в отношении продукции ИУК были крайне гетерогенны, далее для различных видов внутри каждого рода. Наибольшее количество ИУК-положительных штаммов обнаружено среди бактерий рода Envinia (91%), наименьшей способностью к синтезу ИУК обладали представители рода Bacillus (42%). Триптофан стимулирует синтез ИУК до количеств 40 мкг/мл культуральной жидкости, однако максимальное количество зависит от особенностей штамма. Большинство азотфиксирующих бактерий не способно ассимилировать N2 в условиях высокого содержания кислорода в окружающей среде, так как нитрогеназный комплекс, осуществляющий реакцию восстановления азота, необратимо инактивируется при взаимодействии с О2. Исключением из этого правила является строго аэробный микроорганизм Azotobacter vinelandii, который эффективно фиксирует молекулярный азот даже при очень высоких концентрациях О2 в среде роста. Azotobacter vinelandii – облигатно аэробная почвенная бактерия, известная большим количеством метаболических способностей, включая способность фиксировать атмосферный азот, превращая его в аммоний. Подобно Klebsiella pneumoniae, он фиксирует азот в свободном состоянии, не вступая в симбиоз с растениями (так как это делает Rhizobium, что вступает в симбиоз с бобовыми). Благодаря двум особенностям процесса фиксации азота эта бактерия очень широко исследуется. Также этот организм известен способностью фомуваты уникального цисты, позволяющие ему переносить периоды высушивания и отсутствии источника углерода. Сейчас частично завершен проект определения последовательности генома этой бактерии. Azotobacter vinelandii производит не только нитрогеназа с атомом молибдена в активном центре, как подавляющее большинство диазотрофив, таких как Klebsiella pneumoniae и Rhizobium leguminosarum, но также и две альтернативные нитрогеназы; в одной ион молибдена заменен ионом ванадия, а в другом совсем нет ионов переходных металлов, только железо. Способность проводить реакцию восстановления азота на подобных активных центрах очень важно для химиков, исследуют механизм фиксации азота. Альтернативные нитрогеназы кодируются отдельными группами генов, vnfHDGK и anfHDGK: гены vnfG и anfG кодируют субъединицы, отсутствуют в молибденовых Нитрогеназа, тогда большое количество генов, например, nifUSVWZ и nifM используются в биосинтезе всех трех ферментов. Синтез альтернативных Нитрогеназа регулируются наличием соответствующих металлов, т.е. молибдена или ванадия, а экспрессия каждого набора генов регулююеться соответствующими регуляторным белком, продуктом одного из генов nifA, vnfA или anfA. Также интересно, каким образом A. vinelandii транспортирует молибден в клетку и отличает его от подобных ионов, как сульфат, за этот процесс отвечает целая группа транспортных генов, modEABC и modG, имеющих гомологи и в других бактериях. A. vinelandii сумел развить ряд физиологических механизмов, позволяющих ему фиксировать азот за аэробными условиями, несмотря на чувствительность нитрогеназы к кислороду. В частности, бактерия имеет высокий уровень дыхания и цитохромы, обеспечивающих практическое бескислородной среде для нитрогеназы, хотя энергия и получается путем аэробного метаболизма. Также бактерия синтезирует защитный белок 2Fe-2S, что связывается с Нитрогеназа в условиях кислородного стресса и формирует неактивный комплекс, нечувствителен к кислороду. Ризосферные бактерии рода Pseudomonas (P. putida, P. fluorescens, P. chlororaphis, P. aureofaciens) являются потенциальными объектами агробиотехнологии для разработки на их основе биологических средств как для защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов, так и стимуляции роста и повышения продуктивности растений. Известно, что защитные свойства ризосферных бактерий обусловлены синтезом антибиотиков (феназинов, пирролнитрина, 2,4-диацетилфлороглюцинола, пиолютеорина и ряда других) и сидерофоров, а также индукцией системной устойчивости растений к патогенам (4, 5). Недавно нами был описан новый штамм ризосферных бактерий P. aurantiaca B-162, антагонистическая активность которого по отношению к возбудителям болезней сельскохозяйственных культур связана с синтезом антибиотиков феназинового ряда и пирролнитрина (6, 7). Кроме того, было установлено, что бактерии изучаемого штамма обладают выраженной способностью стимулировать рост и развитие растений (8), однако природа этого явления изучена не была. Известно, что стимуляция роста растений ризосферными бактериями обусловлена синтезом индолилуксусной кислоты, гиббереллинов, цитокининов, витаминов; улучшением фосфорного питания растений путем перевода фосфатов в растворимые соединения; фиксацией атмосферного азота; деструкцией растительного гормона старения – этилена и индукцией устойчивости растений к абиотическим факторам (9-13). Бактерии рода Pseudomonas широко населяют биосферу и участвуют в процессах минерализации различных органических соединений, а также в очистке окружающей среды от загрязнений. Многие представители данного рода являются возбудителями заболеваний человека и животных, наиболее распространенной является синегнойная палочка (Смирнов,1990). Известно, что ризосферные бактерии рода Pseudomonas обладают совокупностью полезных свойств, благодаря которым, они положительно влияют нарост и развитие растений (Haasand Défago, 2005). Кроме того, данные ризобактерии являются наиболее изученной группой микроорганизмов, обладающих антагонизмом по отношению к почвеннымфитопатогенам (Червериков, 2012; Логинов и др., 2001; Bloemberg&Lugtenberg, 2001; Whipps, 2001). Ризобактерии P. putida, P. chlororaphis, P. fluorescens, P. сorrugate и др. способствуют ускорению роста и развития растений (Бурова, 2006; Криг, 2007; Анохина, 2011; Клыкова, 2016). В работе О.М. Минаевой (2008) отмечено, что период наибольшей численности микроорганизмов в ризосфере совпадает с периодом активного роста кукурузы, овса, пшеницы и картофеля. Инокуляция ризобактериальными штаммами P. fluorescens 92rk и P190r томатов и огурцов привела к увеличению объема плодов, общей длины корня и его площади поверхности (Saravana kumar, Samiyappan, 2007). Положительное воздействие формальдегидутилизирующих псевдомонад показано в работе Е.Е. Акимовой (2007), свидетельствующей об увеличении продуктивности картофеля при инокуляции как в лабораторных, так и в полевых опытах. Показана способность ризосферных бактерий P.chlororaphis контролировать заболеваемость растений и стимулировать их рост вусловиях засоления почв и засухи (Клыкова, 2016; Egamberdieva, 2012). Многими авторами показана способность псевдомонад фиксировать атмосферный азот, синтезировать различные фитогормоны, также сидерофоры и различной природы антибиотики и антибиотикоподобные вещества (Акимова, 2007; Клыкова, 2016). Показана способность к фиксации атмосферного азота бактериями рода Pseudomonas в неблагоприятных условиях. Так в холодных климатических зонах в ризосфере растений азотфиксирующие псевдомонады доминировали над представителями других таксономических группазотфиксаторов (Боронин, 2000; Свешникова, 2003; Клыкова, 2016). Синтез данными бактериями фитогормонов считается одним из важных механизмом стимулирования роста и развития растения. У них отмечают синтез ауксинов, гибберелинов, цитокининов и других биологически активных веществ, стимулирующих рост и развитие растения (Феклистова, 2004; Четвериков, 2011; Клыкова, 2016). Способность синтезировать индолил-3-уксусную кислоту доказана для видов P. amygdali, P. aureofaciens, P. fluorescens, Р. putida, P. syringae pv savastanoi (Свешникова, 2003; Храмцова, 2006; Лукаткин, 2009). А.А. Лукаткин и соавторы (2009) производили обработку семян овощных культур бактериальной суспензией P. aureofaciens, что приводило к ускоренному всходу и развитию ростков, авторы объясняют это синтезом псевдомонадами фитогормона – индолил-3-уксуной кислоты. Установлено, что Р. putida способны разлагать фитогормоны при их высоких концентрациях для снятия ингибирующего действия суперпродуцентов ИУК (Leveau, Lindow, 2005). Однако показано, что лишь 9 видов ризосферныхпсевдомонад из 40 обладали способностью к синтезу ИУК в прикорневой зоне некоторых растений. Кроме того, для фитопатогенных микроорганизмов рода Pseudomonas также отмечают способность к синтезу индолил-3-уксусной кислоты, однако корреляционной зависимости между патогенностью и способностью к синтезу фитогормонов выявлено не было (Свешникова, 2003). Для ряда представителей рода Pseudomonas отмечают способность к синтезу фитогормона – гибберелина, оказывающий влияние на прорастание семян. Бактерии Рseudomonas aureofaciens синтезируют широкий ряд антибиотических веществ феназиновой природы (феназин, феназин-1-карбооновая кислота, оксифеназин, пиоцианин). По сравнению с типичными антифунгальными препаратами, феназины имеют более широкий спектр действия. Они препятствуют развитию не только фитопатогенных грибов, таких как Rhizoctonia solani, Alternaria solani, Septoria tritici, Fusarium oxysporum, Pythium myriotylum, Candida albicans и других, но и целого ряда фитопатогенных бактерий – Erwinia carotovora, Pseudomonas syringae, Xanthomonas campestris. Кроме того, соединения феназинового ряда улучшают способность растений усваивать минеральные вещества из почвы. B. subtilis может поддерживать постоянный контакт с высшими растениями и стимулировать их рост. Благодаря широкому кругу хозяев, способности формировать эндоспоры и продуцировать различные антибиотики лучше других представителей рода Bacillus вид B. subtilis пригоден в качестве агента биоконтроля (14). Бактерия обладает супрессивными качествами in vitro по отношению более чем к 20 типам фитопатогенных организмов за счет способности продуцировать значительное количество вторичных метаболитов: циклических липопептидов, полипептидов, белков и непептидных соединений (15, 16). Эти вещества, преимущественно пептиды, имеют либо рибосомальное, либо нерибосомальное происхождение (17). Основная фракция антибиотиков B. subtilis, подавляющая фитопатогены, – нерибосомально синтезируемые пептидные производные, в основном липопептиды (17). Липопептидные антибиотики образуются при соединении β-гидроксильных остатков или β-аминогрупп и жирных кислот. Длина и разветвленность цепочек жирных кислот и заместителей аминокислот определяют свойства продукта (20). Бактерии B. subtilis широко распространены в окружающей среде, поскольку многие дикие штаммы способны формировать биопленку на поверхности корней растений (19, 20). Циклический липопептид сурфактин содержит карбоксильную кислоту (3-гидрокси-13-метилтетрадекановая кислота) и семь аминокислот. Структура характеризуется наличием гептапептида, соединенного с жирной β-гидроксикислотой через лактоновую связь (21, 22). Другие аналоги сурфактина – пумилаципдин, бацирцин и лихенизин (23). Сурфактин – один из наиболее активных биосурфактантов (15, 23), известный стимулятор формирования биопленки. Частично это объясняется его действием как активатора мембраночувствительной гистидинкиназы (19, 24, 25). Экзополимерные соединения играют важную роль в формировании биопленки, а их химическое строение влияет на ее свойства и качество (26, 27). Биопленка способствует колонизации корней бактериями и тем самым повышает локальную концентрацию антибиотиков (28). В то же время ее образование способствует повышению антимикробной устойчивости (29-31). Сурфактин обладает антибактериальной, антивирусной, антигрибной, антимикоплазменной, инсектицидной и гербицидной активностью (32-36), стимулирует устойчивость к проникновению патогена, воздействуя на защитный механизм растения (37, 38). Биоконтроль фитопатогенного гриба Aspergillus flavus с помощью сурфактина способствует снижению контаминации растений микотоксинами (39). Близкие по строению циклические липогептапептиды микосубтилин, итурин и бацилломицин с мощной антигрибной и гемолитической, но ограниченной антибактериальной активностью многие авторы объединяют под общим названием итурины. Антигрибной эффект проявляется при взаимодействии с цитоплазматической мембраной клеток, при этом формируются ионопроницаемые поры (40, 41). В Китае выделен новый штамм B. subtilis, который продуцирует антибиотик jiean-пептид, близкий по строению к итурину (42). Jiean-пептид проявляет фунгицидные свойства против возбудителей болезней различных сельскохозяйственных культур (43, 44). Штамм продуцирует это биофунгицидное соединение при условии, что клетки бактерии адсорбированы на кусочках дерева. Фенгицин (синоним плипастаин) сочетает в своем строении несколько соединений с необычной структурой: составляющие части циклических, разветвленных и редких веществ (45). Он содержит жирную βгидроксикислоту, связанную с N-конечным декапептидом, который включает четыре β-аминокислотных остатка и редкую аминокислоту L-орнитин. С-конечный остаток пептида частично связан с остатком тирозина в положении 3, при этом сохраняется точка разветвления ацилпептида и восьмичленного циклического лактона (17). Фенгицин обладает антигрибной активностью против некоторых нитевидных грибов (46). Соединение успешно применяется для контроля Fusarium moniliforme, при этом подавляется рост мицелия и образование спор. Возможный механизм антигрибной активности фенгицина состоит во взаимодействии молекул стирола и фосфолипида в мембране, из-за чего нарушается структура мембран клеток мишени (47-49). Ризоктицин – фосфатсодержащий олигопептидный антибиотик, синтезируемый грамположительной бактерией B. subtilis АТСС 6633 (50). Это ди- и трипептид, содержащий аминокислоту аргинин и L-2-амино-5- фосфорно-3-пентеноиковую аминокислоту, не встречающуюся в структуре белков. Ризоктицины проникают в грибную клетку через олигопептидную транспортную систему. В результате пептидазой освобождается небелковая фосфатсодержащая аминокислота, которая ингибирует синтез белка. Фосфонатные соединения распространены среди биологически активных веществ главным образом благодаря способности влиять на карбокси- и фосфатсодержащие метаболиты (48). Лантибиотики – рибосомально синтезируемые пептидные антибиотики с уникальными особенностями (лантионинсодержащие антибиотики). Лантионин образуется за счет рибосомального синтеза либо модификации (дегидратации серина и последующего соединения с тиолоновыми группами цистеина) (51). Свойства разных типов лантибиотиков, основанные на их структуре, неодинаковы. Лантибиотики типа А (21-38 аминокислотных остатка) имеют более линейную вторичную структуру и разрушают грамположительные клетки-мишени, формируя поры в цитоплазматической мембране. Субтилин – 32-аминокислотный пентациклический лантибиотик, структурно связанный с низином (Lactococcus lactis), который широко используется в биозащите (52). Синтез лантибиотиков регулирует как плотность клеток, так и механизм споруляции. Биологическая активность лантибиотиков, образуемых грамположительной бактерией, ингибирует синтез пептидогликана и укорачивает его молекулу, что облегчает формирование пор (53). В синтезе субтилина участвуют также сериновые протеазы. Высокое содержание липопептида микосубтилина (880 мг/г) обнаружено у штамма B. subtilis – антагониста Candida sp. (20). Эрицин S и субтилин различаются только по четырем аминокислотам, то есть антимикробные свойства обоих лантибиотиков сопоставимы. Однако эрицин А отличается от эрицина S строением кольца и расположением 16 аминокислот (18). Лантибиотик мерсацидин относится к лантибиотикам типа В, которые имеют более крупный размер молекул и разнообразную структуру. Субтиломицин синтезируется B. subtilis MMA7, выделенной из морской губки Halilona simulans. Субтилозин А синтезируют несколько штаммов B. subtilis, он имеет макроциклическую структуру с тремя промежуточными связями, включая эфирные связи между сульфатом цистеина и α-углеводом аминокислоты (17). Субланцин 168 с β-метиллантиониновым мостиком и редкими для лантибиотиков двумя дисульфидными связами активен преимущественно против грамположительных бактерий. Бактерии B. subtilis применяют в качестве продуцентов амилаз, протеаз, хитиназ, ксиланаз, липаз, глюконаз, целлюлаз и других ферментов (54, 55). Бациллы прикрепляются к грибным гифам, лизируют клеточные стенки фитопатогенного гриба и используют продукты лизиса в качестве дополнительного источника питания и энергии (56). B. subtilis наряду с пептидными антибиотиками продуцирует поликетоны, которые служат активными агентами в биологическом контроле фитопатогенов. Поликетоны – семейство метаболитов, представляющих собой ферменты поликетонсинтетазы, которые проявляют антимикробную активность благодаря способности собирать многофункциональные полипептиды в большие пестицидные комплексы. По строению это линейные молекулы с двумя амидными связями, состоящие из разнообразных остатков и заместителей. В зависимости от строения и функций эти метаболиты объединены в следующие группы: бациллоены, дегидробациллоены, диффицидин, оксидиффицидин, макролацин (42, 45). Внутри клеток B. subtilis 168 непосредственно после прекращения роста и перед формированием термостабильных спор вырабатывается фосфолипидный антибиотик бацилизоцин. Его активность в большей степени проявляется против эукариотического организма Sacharomyces cerevisiae, а также низших грибов Candida pseudotropicalis и Cryptococus neoformans, которые характеризуются ненитевидным ростом (57, 58). Фосфолипиды, продуцируемые B. subtilis, проявляют антимикробную активность против грамотрицательных бактерий (Escherichia coli, Proteus mirabilis и Pseudomonas aeruginosa), грамположительных бактерий (Staphylococcus aureus и Enterococcus faecalis), Actinomyces sp. и грибов (Aspergillus niger, Candida albicans) (599). Обнаружено, что их антимикробный эффект усиливается с повышением температуры (до 50 С) и рН (до 10) (60, 61). Некоторые штаммы B. subtilis синтезируют метаболиты, относящиеся к полиеновым антибиотикам с сопряженными двойными связями. Гексаены других штаммов B. subtilis в разной степени ингибируют рост фитопатогенных грибов Fusarium culmorum, F. sporotrichiella, F. oxysporum, Botrytis sorokiniana, Alternaria tenui и Phytophthora infestans (62). Изокумарины представляют интересную группу фенольных соединений, которые встречаются у видов Bacillus как производные фенилпропанола. Одиннадцать штаммов B. subtilis, выделенных из различных географических и экологических ниш, продуцируют амикумацины, отнесенные к антибиотикам изокумариновой группы. Амикумацин и бациллосарцин, выделенные из культуральной жидкости морской бактерии B. subtilis ТР-В0611, защищают растения от амбарной моли (45). Изопрен – самый малочисленный представитель природных терпеноидов. В отличие от других бактерий, B. subtilis 6051, B. subtilis 23029 и B. subtilis 23856 выделяют летучее вещество изопрен в относительно высоких концентрациях (45). Спорулены А, В и С – три терпеноида, выделенные из спор B. subtilis, которые могут защищать споры бацилл от оксидативного стресса. Биологическая роль споруленов определяется споруляцией B. subtilis (45). Некоторые штаммы B. subtilis продуцируют гиббереллины и гиббереллиноподобные вещества (63). Цитокинины – регуляторы клеточного деления и дифференциации в различных тканях растения. Они играют важную роль в росте и формировании узелков. У B. subtilis показано выделение смеси летучих соединений, главным образом 3-гидроксибутан-2-она и бутан-2,3-диола, стимулирующих рост растений (48, 59). Индуцированная системная устойчивость – результат взаимодействия микроорганизмов и растения, особая роль в котором отводится ризобактериям, в частности B. subtilis. Элиситорами, запускающими защитный механизм растения, могут быть белки, липопептиды, полисахариды и другие соединения, ассоциированные с клеточной стенкой бактерии B. subtilis (63, 64). Бактериальные метаболиты, обладающие свойствами индуцированной устойчивости, включают цепочку взаимосвязанных друг с другом защитных реакций, в том числе образование активных форм кислорода, фосфорилирование белков, запуск базовых механизмов фитоиммунитета, которые приводят к развитию системной устойчивости (65, 66). Циклические липопептиды сурфактин, итурин и фенгицин способны оказывать влияние на сигнальные клетки растений, в результате чего запускаются природные иммунные реакции (67). Соединения, которые высвобождаются из клеточной стенки фитопатогенов в результате воздействия гидролаз антагонистов, могут функционировать как элиситоры устойчивости, вызывая в растении возникновение защитных реакций: синтез фитоалексинов, активацию гидролитических ферментов, лигнификацию и т.д. Например, штамм B. subtilis AF1, выделенный из почв, супрессивных к Fusarium udum, способен индуцировать устойчивость арахиса против Aspergillus niger (68). Обнаружено, что этот штамм стимулирует накопление фенилаланинаммиаклиазы и пероксидазы, выступая в качестве индуктора устойчивости. В других системах значительные изменения в защитной реакции растительных клеток связаны с модификацией фенолов (68). Обработка суспензией клеток табака с добавлением низких концентраций сурфактина вызывает у растения активацию фосфорилирования и окислительных реакций, приводящих к гибели растительных клеток, а также проникшего в них фитопатогена (69). Таким образом, Bacillus subtilis продуцирует значительное количество биологически активных метаболитов, имеющих разнообразную химическую структуру: циклические липопептиды, белки, полипептиды, кетоны, полиеновые соединения и ряд других. Способность бактерий синтезировать соединения определенной структуры предполагает наличие специфичного механизма действия на фитопатогенный объект, а также объясняет биологическую активность определенного штамма в отношении конкретных микроорганизмов. При подборе штаммов-продуцентов для создания эффективных биопрепаратов необходимо уделить внимание исследованию структуры и свойств активных метаболитов, которые они синтезируют, поскольку на этой основе могут быть разработаны новые экологически безопасные технологии защиты растений от фитопатогенов. В настоящее время для очистки загрязненных нефтью почв успешно применяют физические, химические и биологические методы. Наиболее перспективными и экономически выгодными является биологический метод, при котором возможна реализация двух стратегий осуществления биоремедиации: - использование только биопрепаратов-деструкторов углеводородов; - посев растений-фиторемедиантов, которые формируют в области своей корневой системы сообщество микроорганизмов, способных разрушать поллютанты; - совместное использование деструктивного потенциала бактерий (несколько реже грибов), обладающих высокой деструктивной активностью, с метаболическими возможностями высших растений. Такое использование обеспечивает более устойчивый и эффективный процесс очистки благодаря высокой скорости адаптации растений за счет жизнедеятельности бактерий, а также взаимовыгодной стратегии сосуществования между растениями и микроорганизмами. Кроме того, не требуется больших финансовых вложений и энергозатрат, т.е. способ является экономически выгодным и перспективным при очистке загрязненных токсикантами территорий. Известен способ получения растительно-микробных ассоциаций для фиторемедиации на основе микроразмножаемых растений томата, рапса и арабидопсиса и плазмидосодержащих ризосферных бактерий, обладающих антимикробной активностью против бактерий вида Erwinia carotovora и грибов вида Phytophthora infestans, характеризующийся тем, что колонизируют посадочный материал культивируемых in vitro растений штаммом Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2500 Д, несущим плазмиды pBS216, pKS1, придающие устойчивость ему к нафталину и мышьяку, или Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2501 Д, несущим плазмиды pBS216, pBS501, придающие устойчивость ему к нафталину и никелю (патент RU №2443771, МПК C12N 1/00 (2006.01), C12N 1/14 (2006.01), A01N 63/00 (2006.01), В09С 1/10 (2006.01)). Способ позволяет защитить растения от токсического воздействия нафталина и тяжелых металлов, а также повышает устойчивость растений к фитопатогенным микроорганизмам, однако способ не предполагает использования получаемых растительно-микробных ассоциаций в условиях нефтяного загрязнения. Известен способ выращивания многолетних трав на нефтезагрязненной почве, включающий посадку многолетних трав в нефтезагрязненную почву (патент RU №2249933, МПК7 А01В 79/02, В09С 1/00). При этом многолетние травы предварительно выращивают не менее одного вегетационного периода в незагрязненной почве с последующим высаживанием в почву корневищами, и/или столонами, и/или рассадой. В качестве многолетних трав используют клевер гибридный (Trifolium hybridum L.), клевер луговой (Т. pratense L.), ежу сборную (Dactylisglo merata L.), тимофеевку луговую (Phleum pratense L.), кострец безостый (Bromopsis mermis (Leys.) Holub.), пырей ползучий (Elytrigia repens (L.) Nevski), тысячелистник обыкновенный (Achillea millefolium L.), овсяницу луговую (Festuca pratensis Huds), клевер ползучий (Т. repens). Однако данный способ трудоемок, так как для его реализации требуется дополнительное время для выращивания и ухода за посевным материалом. Известен способ биорекультивации нефтезагрязненных почв с использованием микроорганизмов (патент RU 2253209, МПК А01В 79/02). На участок нефтезагрязненной почвы высаживают предпочтительно растения, формирующие в своей прикорневой зоне микробное сообщество с повышенным их содержанием и одновременно повышенными эмульгирующими свойствами, причем биомасса подземной части растений должна составлять не менее 71,8 г/м2 в пересчете на сухой вес или 143,6 г/м2 сырого веса биомассы. Используют следующие растения: клевер луговой, клевер ползучий, кострец безостый, полевица тонкая, пырей ползучий, мятлик луговой, ежа сборная, тимофеевка луговая, овсяница луговая, тысячелистник обыкновенный. Недостатком способа является очистка нефтезагрязненной территории за счет потенциала аборигенной микрофлоры, активность которой может зависеть от условий окружающей среды и произрастающей растительности. Наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ фиторемедиации грунта, загрязненного углеводородами, включающий посев растений-фиторемедиантов, в качестве которых используют смесь семян бобовых растений, а также люцерну посевную и семена злаковых растений: райграс пастбищный, и/или рожь озимую, и/или сорго веничное, в соотношении 1:1-3, предварительно бактеризованных штаммом микроорганизма деструктором углеводородов, стимулирующим рост растений, в качестве которого использован штамм Sinorhizobium meliloti Р221 или штамм Azospirillum braselense SR80 (патент RU 2403102, МПК В09С 1/10 (2006.01)). Перед посевом в грунт вносят минеральное азотное удобрение в количестве не менее 120 г/м2. Бактеризацию проводят погружением семян в суспензию, содержащую клетки штамма микроорганизма в концентрации 1-3⋅108 клеток/мл с последующим выдерживанием семян в суспензии в течение 2-3 ч. В качестве минерального азотного удобрения используют аммиачную селитру. Недостатком данного способа является ограниченная применимость при высоких концентрациях углеводородов: данный способ фиторемедиации может быть применен для очистки почвы с концентрацией нефтепродуктов до 30 г/кг грунта. Известно применение родококков для задержки процессов развития растений (патент RU №2482681, МПК A01N 63/00 (2006.01), C12N 1/20 (2006.01)). На растение или часть растения воздействуют одной или более бактериями, продуцирующими один или более ферментов, выбранных из группы, состоящей из нитрилгидратаз, амидаз, аспарагиназ и их смесей. Указанную одну или более бактерий выбирают из группы, состоящей из видов Rhodococcus, Brevibacterium ketoglutamicum, и их смесей, и при этом указанная одна или более бактерий воздействуют на растение или часть растения в количестве, достаточном для задержки процесса развития растений. Однако известно применение родококков в составе биопрепарата, который представляет собой ассоциацию штаммов бактерий Pseudomonas putida ВКПМ В-10997, Bacillus subtilis ВКПМ В-10999 и Rhodococcus erythropolis ВКПМ - Ас-1882 в массовом соотношении (1-2):(1-2):1 и обладающий стимулирующим рост растений активностью (патент №2484131 RU, МПК C12N 1/26 (2006.01), C02F 3/34 (2006.01), В09С 1/10 (2006.01), C12R 1/125 (2006.01), C12R 1/01 (2006.01), C12R 1/40 (2006.01)). Биопрепарат дополнительно содержит сорбент, органические, минеральные и стимулирующие добавки. Его вводят в виде водного раствора путем дождевания в загрязненный грунт, почву или промышленный сток в эффективном количестве. Использование в составе описанного биопрепарата штамма Rhodococcus erythropolis ВКПМ-Ас-1882 не раскрывает его фитостимулирующую активность. Техническим результатом является высокая скорость очистки почв, загрязненных сырой нефтью, и применение способа на сильно загрязненных почвах. Технический результат достигается за счет использования растительно-микробной ассоциации, включающей в себя люцерну посевную Medicago sativamm пшеницу озимую Triticum durum и суспензию клеток штамма Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017Д, совместно с содержащей фитогормоны средой культивирования следующего состава, г/л: KNO3 - 4; Na2HPO4 - 1,4; KH2PO4 - 0,4; MgSO4×H2O - 0,8; сахароза - 10; триптофан - 1. Применение штамма Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017Д в качестве фитостимулятора роста растений. Признаками общими с прототипом являются: - посев растений-фиторемедиантов, в качестве которых используют семена люцерны посевной и семена злаковых растений; - применение суспензии штамма микроорганизма - деструктора углеводородов, стимулирующего рост растений. Отличительными признаками от прототипа являются применение: - в качестве растений семян люцерны посевной Medicago sativa или пшеницы озимой Triticum durum; - в качестве штамма микроорганизма - деструктора углеводородов, стимулирующего рост растений суспензии клеток штамма микроорганизма Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017Д совместно с содержащей фитогормоны средой культивирования следующего состава, г/л: KNO3 - 4; Na2HPO4 - 1,4; KH2PO4 - 0,4; MgSO4×H2O - 0,8; сахароза - 10; триптофан - 1. Выбранные растения используются в технологии фиторемедиации почв загрязненных различными поллютантами. В качестве микроорганизма - интродуцента использовали штамм Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017Д, который депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов. Непатогенность данного микроорганизма была доказана в остром опыте на белых мышах и токсикологических исследованиях, проведенных Научно-исследовательским центром токсикологии и гигиенический регламентации биопрепаратов Министерства здравоохранения РФ. Используемый штамм является высокоактивным деструктором различных нефтепродуктов и индивидуальных углеводородов в широком диапазоне температур и значений рН (патент RU №2317162, МПК В09С 1/10 (2006.01), C12N 1/26 (2006.01)). Скрининг культур микроорганизмов на фитостимулирующую активность проводили в присутствии нефтепродуктов на песке. Песок предварительно промывали от органических остатков, просеивали через сито с диаметром пор 2 мм, стерилизовали в сухожаровом шкафу 3 ч при температуре 180°С. В качестве поллютанта использовали сырую Западно-Сибирскую нефть, которая вносилась в концентрации 5% от массы песка, составившей 50 г в чашке Петри. Для равномерного распределения гидрофобных поллютантов их вносили в виде раствора в гексане. Растительным тест-объектом являлся редис обыкновенный (Raphanus sativus), который обладает высоким уровнем отзывчивости на наличие фитогормонов в среде. Критериями оценки являлись такие параметры как всхожесть (7 сутки) и приживаемость (10 сутки). Песок с внесенными в него семенами обрабатывался суспензиями клеток штаммов микроорганизмов объемом 5 мл с титром жизнеспособных клеток 107 КОЕ/мл. В ходе эксперимента было выявлено, что из 25 штаммов исследуемых культур наиболее ярко влияние на показатели всхожести и приживаемости проявлялось при обработке суспензией клеток штамма микроорганизма Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-2017Д, при внесении которой показатели всхожести были в 1,5 раза выше по сравнению с контролем. Эффект обнаруживается при концентрации углеводородов до 50 г/кг. Для оценки количества синтезируемого фитогормона проводили качественную реакцию на индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) с реактивом Сальковского, состоящего из 0,05 М FeCl3 в 37% растворе хлорной кислоты HClO4. Осаждение клеток проводили на центрифуге Dastan РС-6 МЦ (Киргизия) в течение 20 мин при 3000 об/мин. К 2 мл исследуемого образца добавляли 1 мл реактива. Измерение оптической плотности производили на колориметре фотоэлектрическом КФК-2 МП (Россия) при длине волны 540 нм. В контрольную кювету помещалась минеральная среда и добавленный в нее реактив Сальковского. В качестве источников энергии и углерода выступали сахароза и гексадекан; триптофан вносили в концентрации 0,5 г/л минеральной среды, их влияние на концентрацию ИУК отражено в таблице 1. 1 2 |