Мед. Генетика Горбунова. Учебник для студентов медицинских вузов и слушателей последипломного образования
 Скачать 1.71 Mb.
|
|
Глава 1. 13. Структура генома прокариот и эукариот, мобильная генетика Под геномом понимается полная генетическая система клетки, которая обеспечивает передачу в ряду поколений всех ее свойств, как структурных, так и функциональных. Впервые термин геном был введен ботаником Винклером для обозначения гаплоидного набора хромосом. В дальнейшем этот термин использовали для обозначения количества ДНК в гаплоидной или диплоидной клетке. В молекулярной генетике геном и ДНК часто используют как идентичные понятия. У многих вирусов, которые называются ретровирусами , геном представлен молекулой РНК. Часто РНК заключена в белковую оболочку – капсид . РНК-содержащие вирусы вызывают у человека различные заболевания, такие как грипп, полиомелит, гепатит, краснуху, корь и многие другие. Геном РНК-вирусов мал, и может состоять всего из трех генов, один из которых кодирует белок капсида, а другие необходимы для самовоспроизводства вируса. При проникновении вируса в клетку на первом этапе происходит синтез однонитевой кДНК по матрице РНК вируса с помощью фермента обратной транскриптазы. Часто ген этого фермента находится в геноме самого РНК-вируса. По матрице кДНК строится двунитевая ДНК и происходит ее встраивание или транспозиция в хромосомную ДНК клетки хозяина, а затем ее транскрипция и трансляция с образованием вирусных белков. Подобный механизм включения генома РНК-вируса в хромосомную ДНК называется ретропозицией Геномы прокариот и эукариот, хотя и имеют определенное сходство, но все же существенно различаются по своей структуре. Геномы прокариот практически целиком состоят из генов и регуляторных последовательностей. В генах прокариот нет интронов. Часто функционально родственные гены прокариот находятся под единым транскрипционным контролем, то есть транскрибируются вместе, составляя оперон Геномы эукариот существенно больше геномов бактерий, у дрожжей примерно в 2 раза, а у человека – на три порядка, то есть в тысячу раз. Однако прямой зависимости между количеством ДНК и эволюционной сложностью видов не наблюдается. Достаточно сказать, что геномы некоторых видов амфибий или растений в десять или даже в сто раз превосходят по размеру геном человека. В некоторых случаях близкие виды организмов могут существенно различаться по количеству ДНК. Важным обстоятельством является то, что при переходе от прокариот к эукариотам увеличение генома происходит, главным образом, за счет появления огромного количества некодирующих последовательностей. Действительно, в геноме человека кодирующие области, то есть экзоны, суммарно занимают не более 3%, а по некоторым оценкам около 1% от общей длины ДНК. Более 50% генома человека занято последовательностями, многократно повторяющимися в молекуле ДНК. Большинство из них не входят в состав кодирующих областей генов. Некоторые повторяющиеся последовательности выполняют структурную роль. Эта роль очевидна для сателлитных повторов, составленных из относительно коротких монотонных последовательностей, сгруппированных в протяженные тандемные кластеры. Такие последовательности способствуют повышенной спирализации ДНК и могут служить своеобразными опорными точками в каркасе хромосом. Поэтому неудивительно, что большое количество сателлитных повторов локализовано в области гетерохроматина, на концах и в прицентромерных районах хромосом, где гены практически отсутствуют. Локализация большого количества сателлитных повторов в этих районах необходима для правильной организации хромосом и поддержания их как целых интегральных структур. Но на этом функции сателлитных ДНК не ограничиваются. Так, менее понятной остается роль многочисленного класса микросателлитных повторов, достаточно равномерно распределенных по всем хромосомам и составленных из 1-4 тандемно повторяющихся однотипных последовательностей нуклеотидов. Очень многие из них оказываются высоко полиморфными по числу повторяющихся элементов в кластере. Это значит, что в гомологичных местах локализации микросателлитов у разных индивидуумов может содержаться разное число повторяющихся элементов. Большая часть подобной изменчивости носит нейтральный характер, то есть не приводит к развитию каких-то патологических процессов. Однако в тех случаях, когда нестабильные микросателлитные повторы локализованы в генах, увеличение (экспансия) количества повторяющихся элементов выше допустимой нормы может существенно нарушать работу этих генов и реализоваться в виде наследственных заболеваний, получивших название болезней экспансии. Высокий уровень полиморфизма многих нейтральных микросателлитных повторов приводит к тому, что у большей части населения они находятся в гетерозиготном состоянии. Это свойство полиморфных микросателлитных последовательностей в сочетании с их повсеместным распространением делает их удобными молекулярными маркерами, доступными для анализа практически любого гена. Другой тип уже не сгруппированных более протяженных повторяющихся элементов составляют комплементарные последовательности, ориентированные в противоположных направлениях по отношению друг к другу. Их называют инвертированными или обращенными повторами . Такие последовательности способны обеспечить приближение удаленных друг от друга участков молекулы ДНК, что может быть важно для выполнения многих ее нормальных физиологических функций. Попутно отметим, что в геноме человека много регуляторных элементов, функции которых связаны с самовоспроизводством молекул ДНК, координированной работой многих генов, составляющих «генные сети», и рядом других процессов. Регуляторные элементы, как правило, также многократно повторяются в молекулах ДНК. Гены эукариот не организованы в опероны, и потому каждый ген имеет собственную систему регуляции. Кроме того, у высших, в том числе и у человека, имеется дополнительная по сравнению с микроорганизмами система регуляции экспрессии генов. Это связано с необходимостью обеспечения избирательной работы разных генов в дифференцированных тканях многоклеточного организма. И, наконец, наиболее многочисленными являются диспергированные повторы , более протяженные по сравнению с сателлитными ДНК и не сгруппированные, но в виде отдельных элементов разбросанные по геному. Количество таких повторов может достигать в молекулах ДНК человека десятков, а иногда и сотен тысяч копий. Их роль еще менее понятна, но очевидно, что они выполняют скорее регуляторные, чем структурные функции. Некоторые виды этих повторов оказываются способны выстраиваться из ДНК, существовать автономно от хромосом в виде небольших кольцевых молекул, а затем встраиваться в те же самые или другие места хромосомной ДНК, меняя тем самым свою локализацию. Такие последовательности относятся к числу мобильных элементов генома. Способность к перемещению некоторых типов мобильных элементов иногда подчеркивается в их названиях, которые в переводе с английского звучат, как «бродяга» или «цыган». На концах мобильных элементов имеются определенные структурные особенности, обеспечивающие им возможность включаться в хромосомную ДНК. Кроме того, часто в самих этих элементах имеется генетическая информация о ферментах, катализирующих процесс встраивания. Перемещение мобильных элементов способствует структурным реорганизациям генома, межвидовому (горизонтальному) переносу генетического материала и мутационной нестабильности генов. К мобильным элементам можно отнести и последовательности некоторых вирусов, которые могут встраиваться в молекулы ДНК человека и длительно присутствовать в таком скрытом литическом состоянии. Мобильные элементы найдены у всех исследованных в этом отношении видов, при этом разные таксономические группы характеризуются специфическими классами мобильных элементов. У эукариот они составляют весьма значимый компонент генома. Около 40% генома мышей и более 45% генома человека занято подобными последовательностями. Таким образом, общая площадь, занимаемая в геноме человека мобильными элементами, значительно превосходит суммарную площадь генов. У прокариот и у низших эукариот передвижение мобильных элементов осуществляется, главным образом, за счет непосредственного встраивания или транспозиции ДНК мобильного элемента в хромосомную ДНК, то есть эти элементы относятся к классу транспозонов . В зависимости от типа мобильного элемента механизмы транспозиции могут быть различными. Подавляющее большинство мобильных элементов млекопитающих и в том числе человека поддерживаются в геноме посредством ретропозиции РНК, то есть являются ретропозонами . Ретропозиция включает в себя обратную транскрипцию РНК с образованием кДНК и ее транспозицию в хромосомеую ДНК. Большая часть ретропозонов представлена либо длинными (LINE), либо короткими (SINE) диспергированными повторами. У человека наиболее многочисленным элементом типа SINE является Alu- повтор , представленный в геноме более чем миллионом копий. Примерно десятую часть составляют LTR-элементы , сходные с ретровирусами последовательности, имеющие длинные терминальные повторы, обеспечивающие им возможность встраивания в ДНК. Происхождение большинства умеренных диспергированных повторов, широко представленных в геноме позвоночных и человека, непосредственно связано с ретропозицией обратно-транскрибированных РНК. В 80-е годы прошлого века в работах М. Д. Голубовского с соавторами было показано, что перемещение мобильных элементов является основной причиной возникновения спонтанных мутаций в природных популяциях дрозофилы. У человека это не так, хотя описаны мутации у пациентов с определенными наследственными заболеваниями, обусловленные внедрением в ген мобильных элементов. Так, например, у некоторых больных синдромом Апера идентифицирована инсерция Alu-повтора в 9 экзоне гена рецептора 2 фибробластных факторов роста (FGFR2). В некоторых случаях у больных миодистрофией Дюшенна удается проследить присутствие Alu-элемента в точке разрыва, образованного делецией в гене DMD. Напомним, что при этом заболевании протяженные внутригенные делеции обнаруживаются у более чем 60% больных. Показано, что один из концов делеций, локализованных в 43 интроне гена DMD, расположен внутри мобильного элемента, принадлежащего семейству ретротранспозонов. Однако подчеркнем еще раз, что в отличие от дрозофилы у человека перемещение мобильных элементов не является основной причиной спонтанного возникновения мутаций. Обнаружение в геноме человека и других видов живых существ большого количества последовательностей, способных менять свою локализацию, явилось основой для развития нового направления в генетике, получившего название мобильная генетика . Существование мобильных элементов впервые было предсказано в 50-х годах прошлого века Барбарой МакКлинток, которая наблюдала в одной из генетических линий кукурузы возникновение нестабильных мутаций в области локализации точки разрыва одной из хромосом. При перемещении точки разрыва соответственно менялся спектр мутаций, которые всегда оказывались расположены вблизи от данного цитогенетического нарушения. Эти экспериментальные наблюдения позволили Барбаре МакКлинток высказать предположение о существовании особого класса генетических элементов, способных внедряться в разные локусы и влиять на темпы мутирования генов. Сначала эта гипотеза не нашла поддержки среди научной общественности, но в дальнейшем она была непосредственно подтверждена на молекулярном уровне. Большой вклад в развитие мобильной генетики внесли работы отечественных исследователей Р. Б. Хесина, Г. П. Георгиева, В. А. Гвоздева, М. Д. Голубовского. В соответствии с классическими представлениями все элементы генома имеют постоянную локализацию. Оказалось, что это положение справедливо только в отношении так называемых структурных элементов, прежде всего, генов. Стабильное расположение генов на хромосомах позволяет строить цитогенетические карты, то есть располагать гены относительно цитологически видимых маркеров хромосом. Но наряду с такими обязательными или, как говорят, облигатными элементами генома в молекулах ДНК человека имеется большое число факультативных элементов, присутствие которых не является строго обязательным, а их отсутствие не приводит к каким-то заболеваниям. Роль таких факультативных элементов особенно важна в эволюционных процессах. Изменения числа и топографии факультативных элементов М. Д. Голубовский предложил называть вариациями в отличие от мутаций генов. Вариации происходят в геноме закономерно и с высокой частотой. Факультативные элементы первыми воспринимают происходящие в окружающей среде изменения, причем даже такие, которые не обладают мутагенным эффектом. Под влиянием возникших вариаций могут происходить направленные массовые наследственные изменения или мутации, которые проявляются в виде вспышек мутабильности. Это явление впервые описано в работах ленинградских генетиков Р. Л. Берг, выполненных на природных популяциях дрозофилы, а затем в работах Л. З. Кайданова, проведенных на инбредных линиях дрозофилы, длительно селектировавшихся по неадаптивному признаку. Таким образом, факультативные элементы представляют своеобразную оперативную память генома, и их роль особенно важна в эволюции. Наряду с генами и повторяющимися последовательностями в геноме человека присутствует много уникальных последовательностей, не связанных с кодирующими функциями. Среди них можно выделить класс псевдогенов , таких последовательностей, которые хотя и близки по своему нуклеотидному составу к определенным генам, но отличаются от них присутствием множества мутаций, не позволяющих им транскрибироваться или транслироваться. Характер расположения генов по хромосомам и внутри хромосом очень неравномерен. В некоторых областях генома наблюдается высокая плотность генов, в то время как в других – генов вообще не обнаруживают. Как правило, гены эукариот разделены так называемыми спейсерными промежутками, в которых наряду с повторами локализованы и уникальные последовательности, не являющиеся генами. Назначение большинства уникальных некодирующих последовательностей остается неясным. Также непонятна роль интронов – протяженных некодирующих участков генов, которые переписываются в молекулы преРНК на начальном этапе экспрессии генов, а затем вырезаются из этих молекул в процессе образования мРНК. В связи с обнаружением в геноме человека большого количества «избыточных» последовательностей, не связанных непосредственно с кодирующими, регуляторными, структурными или иными функциями, в 80-е годы прошлого века было высказано предположение о том, что они являются эгоистическими или даже паразитическими. В процессе эволюции эти последовательности каким-то образом внедрились в геном высших и сосуществуют вместе с ним, не выполняя никаких функций. Такие геномные паразиты! Нам это предположение кажется вероятным только в отношении очень ограниченного числа последовательностей. Не исключено, что в настоящий момент мы еще не понимаем назначение и функции «эгоистических» ДНК , и в последующем их роль станет более очевидной. Наряду с существованием в геноме человека большого количества «избыточных» ДНК, имеется огромное количество примеров чрезвычайно компактной упаковки информации в областях локализации генов. Во-первых, внутри интронных областей одних генов могут располагаться другие гены, прочитывающиеся в противоположном направлении. Примером является ген гемофилии А – F8C, кодирующий фактор VIII свертывания крови. В 22-ом интроне этого гена были обнаружены 2 других гена A и B, которые прочитываются в противоположном направлении. Продукты этих генов никак не связаны с фактором VIII свертывания крови. Однако для одного из этих генов (А) был идентифицирован гомолог, расположенный в противоположной ориентации в непосредственной близости от 5’-конца гена F8C. Наличие двух так близко расположенных протяженных комплементарных последовательностей способствует структурным перестройкам в этой области генома и, в частности, инверсиям, то есть перевороту на 180 0 области ДНК, расположенной между двумя гомологичными копиями гена А. В результате этих инверсий происходит полная инактивация гена F8C. Такие инверсии обнаруживаются у 45% больных с тяжелыми формами гемофилии А. Во-вторых, наряду с общим регулятором работы гена – промотором, в его интронных областях могут присутствовать дополнительные промоторы, каждый из которых способен запускать синтез преРНК с разных начальных точек. Это явление называется альтернативной транскрипцией При этом с одного и того же гена могут образовываться белки разной длины, имеющие между собой сходство по конечным участкам, но различающиеся по начальным последовательностям. Удивительным примером регуляции на уровне транскрипции является ген миодистрофии Дюшенна (DMD). По крайней мере 8 независимых промоторов осуществляют альтернативную транскрипцию гена DMD вразных тканях и на разных стадиях эмбрионального развития. Продуктом гена DMD в сердечной и скелетных мышцах является стерждневидный белок дистрофин, участвующий в поддержании целостности мембраны мышечного волокна и в формировании нейромышечного синапса. Его экспрессия осуществляется с основного мышечного промотора, располагающегося в 5’-нетранслируемой области гена. В кортикальном отделе мозге и в клетках Пуркинье экспрессия гена DMD с образованием полноразмерных мозговых изоформ дистрофина осуществляется с двух альтернативных промоторов, расположенных в первом интроне гена. Полноразмерные изоформы дистрофина мышечного и мозгового типов имеют небольшие отличия в N-концевых областях. Начиная с середины гена, и ближе к его концу расположены 5 других промоторов, обеспечивающие экспрессию гена DMD в других тканях с образованием укороченных изоформ, так называемых аподистрофинов, не имеющих N- концевых участков дистрофина, но гомологичных его С-концевым областям. Рассмотрим, к каким клиническим последствиям может приводить такая сложная организация работы гена? Мы уже писали о том, что основным типом мутаций при миодистрофии Дюшенна являются протяженные внутригенные делеции. В частности, были описаны пациенты с тяжелой дилатационной кардиомиопатией без проявлений скелетной мышечной слабости, у которых оказалась делетирована область локализации промотора мышечного типа гена DMD. У таких больных мышечный дистрофин полностью отсутствует. Однако в скелетных мышцах компенсаторно начинают работать промоторы мозгового типа, и образуются мозговые изоформы дистрофина, способные восполнить недостаточность мышечного дистрофина. При этом по неизвестным пока причинам подобной компенсации в сердечной мышце не происходит, и полноразмерные изоформы дистрофина в сердце больных полностью отсутствуют. Эта недостаточность и лежит в основе этиологии данной формы дилатационной кардиомиопатии. Не исключено, что делеции в гене DMD, разрушающие альтернативные промоторы, также могут приводить к другим наследственным сцепленным с полом заболеваниям, не сопровождающимся мышечной дистрофией. И, наконец, одним из вариантов компактности упаковки информации в кодирующих областях генов является альтернативный сплайсинг . Это широко распространенное явление заключается в разном вырезании интронов из одной и той же молекулы преРНК. В результате образуются разные мРНК, отличающиеся друг от друга по набору экзонов. Этот процесс носит ярко выраженный тканеспецифический характер. То есть в разных тканях один и тот же ген может по-разному прочитываться, в результате образуются тканеспецифические изоформы белков, хотя и имеющие между собой определенную гомологию, но значительно различающиеся, как по своей структуре, так и по исполняемым функциям. В частности, высоко консервативные последовательности шести последних экзонов гена DMD альтернативно сплайсируются. В результате образуются структурно различающиеся изоформы дистрофина, осуществляющие различные функции. С учетом альтернативной транскрипции и сплайсинга количество продуктов, образующихся с одного только гена DMD достигает нескольких десятков. В настоящее время активно изучаются функции многочисленных изоформ дистрофина, обильно экспрессирующихся в различных специализированных тканях и способных взаимодействовать со множеством белков и не только мышечного или нейронального происхождения. Таким образом, в одном и том же гене может содержаться информация о структуре нескольких, а иногда даже нескольких десятков различных белков. Не так как хромосомный геном устроен геном митохондрий. Мы уже упоминали о том, что около 5% ДНК человека находится в митохондриях - органеллах, ответственных за энергоснабжение клетки. Митохондриальная ДНК почти целиком состоит из генов и регуляторных элементов. В ней содержится гены транспортных и рибосомальной РНК, а также гены, кодирующие различные субъединицы пяти комплексов окислстельного фосфорилирования. Мутации в генах митохондриальной ДНК также приводят к наследственным заболеваниям, о которых мы будем говорить в дальнейшем. В митохондриальной ДНК нет повторяющихся и уникальных некодирующих последовательностей, так обильно представленных в хромосомной ДНК человека. Кроме того, гены митохондрий не содержат интронов. Подобным образом устроен геном бактерий. И это сходство позволяет предполагать бактериальное происхождение митохондрий. Конечно, митохондрии не существуют сейчас в виде отдельных организмов, и их ДНК полностью относится к элементам генома человека. К подобным же элементам, играющим определенную роль в функционировании генома человека, относят чужеродные и экстрахромосомные ДНК – линейные и кольцевые плазмиды, а также ДНК вирусных и бактериальных цитосимбионтов. Конечно это факультативные элементы, и их присутствие в клетках человека не является строго обязательным. Итак, два парадокса характерны для структуры генома эукариот: существование огромного количества «избыточных» некодирующих последовательностей ДНК, функции которых нам не всегда понятны, и чрезвычайно компактная упаковка информации в местах локализации генов. Подчеркнем еще раз, что структура генома также является видовым признаком. Различные индивидуумы, народы и расы не отличаются по набору и локализации не только генов, но и других элементов генома, таких как повторы, спейсерные промежутки, регуляторные последовательности, псевдогены. Да и множества мобильных элементов генома обладают высокой видовой специфичностью. Таким образом, наследственность в широком смысле этого слова определяется структурой генома различных видов организмов. В основе внутривидовой изменчивости лежат вариации, мутации и рекомбинации генов. Эволюционная межвидовая изменчивость сопровождается структурными изменениями, происходящими на геномном уровне. Эти положения имеют важнейшее значение, в частности, для понимания молекулярной природы наследственной патологии человека. |