Мед. Генетика Горбунова. Учебник для студентов медицинских вузов и слушателей последипломного образования
 Скачать 1.71 Mb.
|
|
Глава 2.1. Наследственные болезни, общая характеристика В настоящее время не существует единой классификации наследственных болезней, и часто их смешивают с врожденными и семейными болезнями. Причиной развития наследственных болезней являются присутствующие в половых клетках родителей мутаций в определенных генах. Эти мутации могут передаваться потомству в ряду поколений. Врожденные заболевания проявляются сразу после рождения, и они могут быть как наследственными, так и приобретенными, например, под действием тератогенных факторов или осложнений в родах. Приобретенные врожденные пороки развития не передаются по наследству. Семейными называются болезни, присутствующие у нескольких членов одной семьи. Они также могут быть наследственными или обусловливаться средовыми влияниями, например неправильным питанием, вредными привычками или присутствием токсических соединений в окружающей среде. В свою очередь, наследственные болезни не обязательно являются врожденными или семейными. В соответствии с генетической обусловленностью наследственные болезни разделяют на две группы: хромосомные и генные, то есть связанные с «поломками» на уровне хромосом или индивидуальных генов. Среди генных заболеваний выделяют моногенные и мультифакториальные, которые, строго говоря, не относятся к наследственным заболеваниям, а являются болезнями с наследственной предрасположенностью. Суммарная частота наследственных заболеваний достигает 1,5%, из них на долю хромосомных болезней приходится 0,5% и на долю моногенных – до 1%. К мультифакториальным относятся большинство наиболее распространенных болезней человека. 2.1.1. Хромосомные болезни Патологии, обусловленные аномалиями кариотипа, называются хромосомными болезнями. Одной из возможных причин хромосомных болезней может быть «перезревание» гамет в период копуляции. В некоторых случаях сперматозоид «встречается» с яйцеклеткой не в первые часы после проникновения в матку, а через 24-72 часа. За это время происходит «перезревание» половых клеток (чаще яйцеклетки), что приводит к нарушению «программы встречи». Заметим, что оптимальным временем зачатия является середина, обычно, 13 - 15 дни между циклом месячных женщины. Хромосомные болезни могут быть обусловлены нарушением числа хромосом или их структуры – числовые или структурные аберрации соответственно. Их диагностика проводится путем цитогенетического анализа кариотипа. Основная масса зародышей с дисбалансом хромосом погибает в ранний период развития плода. Часто женщина даже не замечает подобной беременности и расценивает свое состояние как задержку менструального цикла. Среди мертворожденных или погибших в возрасте до одного года частота больных с хромосомной патологией достигает 2,2%. Общее представление о частоте и структуре аномалий хромосом, а также об их вкладе в преждевременное прерывание беременности и перинатальную смертность дают результаты совместных исследований, проведенных в 70-80е годы в Европе, Америке и Японии. Из миллиона зарегистрированных зачатий только 850 тысяч закончились родами. 2% новорожденных (1700) погибли в перинатальном периоде. 0,7% (5848) выживших детей имели различные хромосомные аномалии. В 34% случаев это были анеуплоидии по половым хромосомам, в 30% - трисомии, главным образом, по 13, 18 и 21 хромосомам и в 36% - сбалансированные перестройки, то есть эти дети были клинически здоровы. У 5% погибших детей также были хромосомные аномалии, в 75% случаев – трисомии, в 20% – несбалансированные структурные перестройки и в остальных случаях – полиплоидии. Иная картина наблюдается у спонтанных абортусов. У половины из них имеются аномалии кариотипа. Более чем в 50% случаев это трисомии, в 19% – числовые аномалии половых хромосом и в 22% – полиплоидии. Таким образом, только небольшой процент плодов с хромосомными аномалиями доживают до родов. В настоящее время описано около 1000 нозологических форм хромосомных болезней. Все они характеризуются рядом общих признаков, таких как: маленькая масса и длина тела при рождении, пренатальная гипоплазия; отставание в умственном и физическом развитии с момента рождения, особенно выраженное при аутосомных аномалиях; задержка и аномалии полового развития: гипогонадизм, крипторхизм, аменорея, бесплодие и др., более выраженные при аномалиях половых хромосом; множественные ВПР в большей степени при аутосомных аномалиях; комплекс разнообразных по проявлениям и тяжести дизморфогенетических и диспластических признаков, одновременно затрагивающих многие системы и органы больного. Хромосомные болезни редко наследуются, и более чем в 95% случаев риск повторного рождения в семье больного ребенка с хромосомной патологией не превышает общепопуляционного уровня. Исключение составляют те случаи, когда родители больного ребенка несут сбалансированные хромосомные перестройки, чаще всего транслокации, при которых не происходит утраты генетического материала. Носители сбалансированных транслокаций являются практически здоровыми людьми, но вероятность у них выкидышей, замерших беременностей или рождения детей с несбалансированными хромосомными перестройками, а значит с хромосомными болезнями, очень велика. Поэтому при бесплодии, мертворождениях, привычной невынашиваемости беременности, а также при наличии в семье ребенка с хромосомной патологией необходимо проводить анализ кариотипа каждого из родителей с целью диагностики сбалансированных хромосомных перестроек. Подобный анализ делается в медико-генетических консультациях и в некоторых специализированных лабораториях. 2.1.2. Моногенные болезни В соответствии с современными представлениями разнообразие моногенных заболеваний достаточно велико и их количество по некоторым оценкам достигает 5000. С клинической точки зрения это очень разные, в большинстве своем достаточно тяжелые неизлечимые болезни. Однако во многих случаях использование методов симптоматической коррекции позволяет в определенной степени облегчить страдания больных. Причиной каждого из этих заболеваний является повреждение или мутация одного гена. Следствием мутации может быть нарушение структуры или синтеза кодируемого геном белка, часто сопровождающееся изменением его количественного содержания вплоть до полного отсутствия. Мутации генов способствуют формированию нарушения обмена нередко целой метаболической системы, ведущего к необратимым патологическим состояниям. Степень влияния мутации на развитие заболевания зависит от очень многих факторов. Мутации могут передаваться из поколения в поколение, но порой могут возникать в половых клетках родителей спонтанно. Причина спонтанных мутаций в большинстве случаев остается неизвестной. Среди моногенных болезней значительный процент составляют ферментопатии, различные формы умственной отсталости, дефекты органов слуха, зрения, скелетные дисплазии, врожденные пороки развития, болезни нервной, эндокринной, соединительно-тканной, иммунной и других систем. Моногенные варианты течения заболевания в редких случаях встречаются среди любых нозологических форм, которые в общем случае не являются наследственными. Так, например, описаны моногенные формы гипертензии, болезней Альцгейаера и Паркинсона, эпилепсии и других больших психозов, иммунодефицитов, различных онкологических заболеваний и многих других патологических состояний. Моногенные варианты заболевания, как правило, отличаются от спорадических форм более тяжелым течением и ранним дебютом. Большинство мутаций, ассоциированных с моногенными заболеваниями, жестко детерминируют развитие болезни, и факторы окружающей среды не оказывают или оказывают небольшое влияние на развитие заболевания. Поэтому они так трудно поддаются коррекции. Однако немало примеров моногенных болезней с неполной пенетрантностью и варьирующей экспрессивностью, причины которых чаще всего остаются неизвестными. Наследственные болезни классифицируют также по системному принципу: наследственные болезни нервной, сердечно-сосудистой, мочеполовой, эндокринной системы, органов зрения, слуха, кожи и т.д. Однако подобная классификация не всегда может быть проведена однозначно, так как для многих наследственных заболеваний характерна плейотропия, то есть одновременное вовлечение в патологический процесс нескольких систем, органов и тканей больного. К счастью, моногенные заболевания встречаются достаточно редко. Это объясняется двумя обстоятельствами. Далеко не все гены человека, а только около 5% связаны с моногенными заболеваниями. Кроме того, частоты распространения среди населения мутаций, ассоциированных с моногенными заболеваниями, достаточно низки. К числу наиболее известных моногенных болезней относятся фенилкетонурия, муковисцидоз, галактоземия, адреногенитальный синдром, гемофилия А и В, миодистрофия Дюшенна/Беккера, проксимальная спинальная мышечная атрофия, гепатолентикулярная дегенерация и многие другие болезни. Их частоты варьируют в пределах от 1 на 2-3 до 1 на 10-20 тысяч новорожденных. Другие моногенные заболевания встречаются с еще более низкими частотами – 1 на 100-300 тысяч или 1 на миллион. Однако, поскольку таких заболеваний достаточно много, суммарно они составляют значительный процент в перинатальной и детской смертности, и большой процент педиатрических коек занято такими больными. Несмотря на клиническое многообразие моногенных болезней, можно выделить некоторые общие черты, касающиеся возраста начала заболевания, характера его течения, вовлеченности в патологический процесс различных органов и систем, семейного анамнеза, наличия редких специфических симптомов и ответа на предлагаемую терапию. Большинство моногенных болезней распознаются в перинатальном или раннем детском возрасте. Около 25% этих болезней развиваются в эмбриональном периоде, и еще около 50% проявляются к 3 годам. К концу пубертантного периода диагностируются примерно 90% всех моногенных болезней. Наряду с этим известны наследственные болезни с поздними сроками проявления, такие как спинно-мозжечковые атаксии, хорея Гентингтона, моногенные формы болезней Паркинсона и Альцгеймера и другие. Типичными чертами многих наследственных заболеваний являются хронический характер и прогредиентность течения, то есть постепенное ухудшение общего состояния с нарастанием негативных симптомов. Множественность поражения, обусловленная плейотропным действием гена, типична для большинства наследственных заболеваний. В некоторых случаях удается проследить семейный характер заболевания. Однако отсутствие повторных случаев болезни у членов одной и той же семьи не исключает того, что заболевание является наследственным. Необходимо помнить, что наследуются не заболевания, а гены, точнее их аллельные состояния. Поэтому очень часто в семье может быть только один больной с наследственным заболеванием. При некоторых моногенных заболеваниях выявляются редкие специфические симптомы или даже сочетания этих симптомов. Иногда их проявления не имеют клинического значения, но являются ключевыми при постановке диагноза. Например, наличие симметричных ямок или фистул на слизистой нижней губы в сочетании с расщелиной неба при синдроме Ван дер Вуда, присутствие насечек на мочке уха у ребенка с макроглоссией и расхождением прямых мышц живота при синдроме Беквита-Видемана, широкий первый палец на кистях и стопах в сочетании с прогрессирующей умственной отсталостью при синдроме Рубинштейна-Тейби и т. д. Многие моногенные заболевания относятся к классу неизлечимых или трудно поддающихся лечению заболеваний. Для них характерна «резистентность» специфических клинических проявлений к наиболее распространенным методам терапии. Это объясняется тем, что в основе своей лечение направлено на устранение какого-то определенного симптома, но не причины заболевания. Каждая из перечисленных выше черт в отдельности может быть недостаточна для предположения о наследственном характере заболевания, но различные их сочетания часто позволяют заподозрить подобную патологию у обследуемого пациента. Моногенные болезни можно разделить на две группы. Первая группа – менделирующие заболевания. Их наследование соответствует законам Менделя о рецессивности и доминантности гена и пребывании его в гомо- или гетерозиготном состоянии. В зависимости от локализации мутантного гена и характера доминирования выделяют аутосомно-доминантные, аутосомно-рецессивные и сцепленные с полом заболевания, которые также могут быть доминантными или рецессивными. Наследование некоторых моногенных заболеваний не подчиняется законам Менделя. Они составляют группу болезней с нетрадиционными типами наследования. Это митохондриальные заболевания, болезни экспансии, обусловленные динамическими мутациями, болезни геномного импринтинга и болезни, обусловленные другими нарушениями эпигенетической регуляции работы генов. Большое разнообразие и редкость моногенных болезней делают дорогостоящей разработку специфических методов их диагностики и терапии. В разных странах эта проблема решается по-разному. Но наиболее эффективная помощь пациентам с моногенными заболеваниями оказывается там, где развиты родительские общества, привлекающие внимание общественности к таким больным и добивающиеся спонсорской и государственной поддержки соответствующих программ. Профилактика моногенных заболеваний проводится на базе пренатальной диагностики. Заметим сразу, такой подход применим только в случае тяжелых неизлечимых болезней. К сожалению, пренатальная диагностика практически проводится только в тех семьях, где уже имеется больной ребенок. Целью ее является предотвращение повторного рождения в семье больного. Напомним, что у гетерозиготных родителей при каждой беременности сохраняется высокий риск рождения больного ребенка, независимо от того, кто родился перед этим - больной или здоровый. Кроме того, этот риск может быть повышен и у других родственников больного. Поэтому так важно проводить молекулярную диагностику не только самому больному, но и его родственникам, особенно тем, которые хотят иметь детей. 2.1.3. Мльтифакториальные болезни Мультифакториальные заболевания обусловлены комбинированным действием неблагоприятных внешних и генетических факторов риска, формирующих наследственную предрасположенность к заболеванию. К мультифакториальным заболеваниям относятся подавляющее большинство хронических болезней человека, включая сердечно-сосудистые, эндокринные, иммунные, нервно-психические, онкологические и др. Генетические составляющие могут присутствовать в этиологии даже тех заболеваний, развитие которых целиком индуцируется внешними воздействиями и невозможно без их присутствия, таких, например, как инфекционные болезни. Однако и в этих случаях индивидуальная чувствительность к подобным внешним неблагоприятным воздействиям может быть генетически детерминирована. В настоящее время в качестве генетических факторов риска рассматривают широко распространенные среди населения полиморфные аллели, обладающие относительно небольшим повреждающим эффектом на функцию гена. Те гены, полиморфные аллели которых участвуют в формировании наследственной предрасположенности к определенной патологии, иногда называют генами предрасположенности или генами- кандидатами . Для разных мультифакториальных заболеваний число генов- кандидатов может достигать десятков или даже сотен. Поиск таких генов осуществляется с учетом знаний об основах этиологии и патогенеза заболевания. Какие метаболические циклы дефектны при тех или иных заболеваниях? Какие белки оперируют в этих патологических метаболических циклах и как устроены гены, кодирующие эти белки? Имеются ли там полиморфные аллели, ухудшающие работу всей метаболической системы в целом, и не являются ли они генетическими факторами риска развития определенной патологии? Для ответа на этот последний вопрос проводят сравнение частот полиморфных аллелей в выборках больных и здоровых людей. Считается, что полиморфный аллель участвует в формировании наследственной предрасположенности к заболеванию в том случае, если его частота у больных достоверно превышает контрольный уровень. Например: существует повышенная вероятность возникновения у пациента инфаркта миокарда или развития атеросклероза при наличии полиморфных аллелей в генах, ответственных за оптимальную работу сердечно-сосудистой системы. Это могут быть гены, участвующие в контроле липидного метаболизма, ренин-ангиотензин-альдестероновой системы или системы свертывания крови и фибринолиза. С развитием медицинской генетики ученые открывают все большее число генов- кандидатов, от состояния которых зависит происхождение и тяжесть течения заболевания у конкретного пациента. В последнее время в отдельную группу выделяют заболевания, обусловленные мутациями, возникающими в соматических клетках пациента. Иногда их называют болезнями нуклеиновых кислот. Прежде всего, это онкологические и, возможно, некоторые аутоиммунные заболевания. Глава 2.2. Методы медицинской генетики Существуют различные методы изучения наследственных болезней, главными из них являются клинико-генеалогический, близнецовый, популяционный, цитогенетический, биохимический и молекулярно- генетический. 2.2.1. Клинико-генеалогический метод Клинико-генеалогический метод включает клиническое обследование членов семьи пациента, обратившегося за консультацией, составление ее родословной и проведение генеалогического анализа. Генеалогический анализ является самым распространенным, наиболее простым и одновременно высоко информативным методом, доступным каждому, кто интересуется своей родословной и историей своей семьи. Он не требует никаких материальных затрат и аппаратуры. Убеждены, что со временем в каждой истории болезни будет представлена родословная пациента, как обязательная часть анамнеза жизни. Один из основателей клинической генетики и медико-генетического консультирования в России С.Н. Давиденков (1960) писал: «В постановке клинического диагноза, то есть в непосредственной практической работе врача генеалогическое исследование относится к чрезвычайно важным, а нередко и к решающим моментам распознавания; привычка пользоваться для диагностики методом генеалогии и личного обследования родственников оказывается настолько сильным подспорьем в ежедневной работе, что всякому имеющему в этом хотя бы небольшой опыт, кажется странным, как можно было довольствоваться рассмотрением одних голых фенотипов, совершенно игнорируя наследственные особенности, которые были свойственны этим людям (семье) еще задолго до заболевания». Родословная раскрывает медико-патологический фон семьи, по ней можно с определенной точностью судить о типе наследования патологии, о членах семьи, нуждающихся в обследовании и наблюдении врача. Во время составления родословной возникает значительно более теплый и доверительный контакт с больным и его родными, чем просто разговор о болезнях близких. Хорошо составленная родословная помогает прогнозировать состояние здоровья родственников больного, их детей и будущего потомства. Основателем генеалогического метода изучения наследственности считается немецкий историк О. Лоренц, опубликовавший в 1898 году учебник генеалогии, в котором рассматриваются закономерности происхождения различных семейных заболеваний. В этом учебнике генеалогия рассматривается не как отрасль исторических знаний, а как самостоятельная наука, доставляющая обильный материал для биологии, психологии, психиатрии и др., и имеющая свои задачи по установлению закономерностей в смене поколений. В 1912 году американский евгенический институт выпустил образцы прямолинейных родословных таблиц, которые применяются до настоящего времени, не претерпев практически никаких изменений. Символы, применяемые при составлении родословной, отражены на рис.1, принцип составления родословной представлен на рис. 2. Лицо, с которого начинается исследование родословной называется пробанд , и далеко не во всех случаях это бывает больной, особенно в детской практике. Родословную лучше всего рисовать на большом листе бумаги, разлинованным по горизонтали. На одной линии должны быть размещены все родственники, относящиеся к одному поколению. Поколения обозначают римскими цифрами, а отдельных членов каждого поколения – арабскими. В этом случае каждый член семьи будет иметь свой индивидуальный номер из одной римской и одной арабской цифры. Необходимо указывать возраст всех членов родословной, так как разные заболевания проявляются в разные возрастные периоды жизни, и отмечать лично обследованных знаком «!». Более подробные объяснения к родословной называют легендой, их обычно записывают на отдельных карточках. По хорошо составленной родословной можно получить ответы на многие вопросы. В частности, по ней можно увидеть, какие заболевания наиболее распространены в семье, и кого из ее членов нужно обследовать на генетическую предрасположенность к определенной патологии. По родословной можно определить тип наследования заболевания и выяснить, кто из членов семьи имеет высокий риск заболеть или родить подобного больного. Из этих данных вытекает выбор метода диагностики и проведения профилактических мероприятий, оказание своевременной медицинской помощи. Использование клинико-генеалогического метода предполагает тщательное клиническое обследование максимального количества членов родословной с целью выявления стертых и атипичных признаков заболевания. Сбор анамнестических данных проводят по определенной схеме. Сведения о пробанде, данные о сибсах и родителях пробанда, сведенья о родственниках со стороны матери и со стороны отца записываются в медико-генетическую карту. Очень важен при этом акушерский анамнез женщин – как протекала и на каком фоне наступила беременность, подробности о спонтанных абортах, мертворождениях, наличии бесплодных браков и ранней детской смертности. Необходимо учитывать также наличие и характер профессиональных вредностей, факторов, влияющих на патологию плода (прием лекарственных препаратов, заболевания матери и т.д.). Родословная семьи может быть хорошим подспорьем для молодых ее членов в решении социально-профессиональных вопросов. «Создание и накопление «историй жизни» и «семейных хроник» есть задача не только гуманитарно-научная, но и общекультурная», - считает петербургский социолог А.Н.Алексеев. Причем, добавляет ученый: «Всякая «история жизни», для какой бы цели она ни создавалась, должна включать генеалогическую информацию – столь подробную, насколько это под силу автору данной истории. Семейные хроники строятся на четком определении степеней родства, желательно построение генеалогического древа, что требует минимального обучения». Владимир Набоков в автобиографическом романе «Другие берега» пишет: «Восемнадцати лет покинув Петербург, был слишком молод в России, чтобы проявить какое-либо любопытство к моей родословной; теперь я жалею об этом – из соображений технических: при отчетливой личной памяти неотчетливость семейной отражается на равновесии слов». 2.2.2. Близнецовый метод Близнецовый метод основан на клиническом обследовании и сравнении моно- и дизиготных близнецов, воспитывающихся в одинаковых или различных условиях окружающей среды. Монозиготные близнецы развиваются из одной оплодотворенной яйцеклетки и имеют одинаковую наследственную конституцию. Таким образом, выявляемые между ними различия не связаны с наследственными факторами. Дизиготные близнецы развиваются из разных яйцеклеток, оплодотворенных различными сперматозоидами. Степень их генетического сходства такая же, как у обычных сибсов, но благодаря одновременному рождению и совместному воспитанию они имеют больше общих средовых факторов. Особую ценность при изучении наследственных факторов, влияющих на тип поведения, психологические или интеллектуальные особенности, представляют монозиготные близнецы, разделенные в младенческом или раннем детском возрасте и воспитывающиеся в разных условиях. С помощью близнецового метода удалось доказывать значение генетической предрасположенности ко многим широко распространенным заболеваниям. Результатом сравнения двух групп близнецов является расчет процента идентичности или конкордантности различных признаков или болезней, проявляющихся у каждого из пары близнецов. Чем больше наследственная составляющая признака или заболевания, тем выше значения конкордантности, но самое главное – больше уровень расхождения между моно- и дизиготными близнецами. Количественной оценкой доли наследственной обусловленности признака является коэффициент наследуемости (H), рассчитываемый по следующей формуле, предложенной Хольцингером: Н = (КМБ – КДБ)/(100- КДБ), где КМБ и КДБ – выраженная в процентах конкордантность признака для моно- и дизиготных близнецов соответственно. Если Н>70%, решающая роль в проявлении признака принадлежит наследственным факторам. При H<30% – средовые факторы являются основными в формировании признака. При промежуточных значениях Н предполагается примерно равное участие в контроле признака как генетических, так и средовых факторов. Например, при заболевании корью или коклюшем одного из партнеров близнецовой пары вероятность заболевания второго (конкордантность пары) в группах моно и дизиготных близнецов практически одинаковая: 98% и 94% и 97% и 93%, соответственно. Преобладающая роль инфекционного фактора в данном случае очевидна. При туберкулезе вероятность заболевания второго близнеца в монозиготной паре почти в 3 раза больше, чем в дизиготной – 67% и 23 %. То есть при идентичном генотипе сходная реакция на туберкулезную инфекцию наступает чаще, чем при разных генотипх. Этот факт показывает значительную роль наследственной предрасположенности ребенка к туберкулезу, что в настоящее время очень важно иметь в виду в связи с данными об увеличении распространенности туберкулеза. 2.2.3. Популяционный метод Популяционный метод направлен на изучение частот аллелей и генотипов в различных популяциях, а также факторов, влияющих на их динамику. Этот метод особенно важен при проведении эпидемиологических исследований. Генетическое изучение популяций человека невозможно без учета географических и климатических условий. Но особенно важны демографмческие характеристики популяции, такие как численность, рождаемость, смертность, возрастная и социальная структура, национальный состав, религиозная принадлежность, образ жизни, особенности питания, наличие вредных привычек и др. Наследственные заболевания в разных популяциях, этнических группах и расах встречаются с разными частотами, и это обусловлено различиями в частотах и спектрах мутаций. Анализ соответствия распределения частот аллелей и генотипов в различных популяциях закону Харди-Вайнберга позволяет судить о том, является ли популяция панмиктической, то есть соблюдается ли в ней принцип случайности скрещивания вне зависимости от генотипов особей. Важными практическими задачами являются анализ спектров и частот распределения в отдельных популяциях мутантных аллелей, ассоциированных с определенными наследственными заболеваниями, и выявление среди них мажорных мутаций. 2.2.4. Цитогенетический метод Цитогенетический метод применяется для анализа кариотипа и его аномалий у отдельных индивидуумов. Для проведения исследования достаточно получить образец периферической крови пациента объемом 1-2 мл. Анализ кариотипа проводят в три этапа: культивирование лимфоцитов крови, окраска препарата и его микроскопический анализ. Культивирование проводят для того, чтобы стимулировать деление лимфоцитов, так как успех цитогенетического исследования зависит от количества клеток, находящихся на стадии метафазы, когда хромосомы находятся в наиболее компактной форме. Продолжительность культивирования обычно составляет 72 часа. Для увеличения количества метафазных клеток в конце культивирования в среду вводят колхицин, который приостанавливает деление на стадии метафазы, разрушает веретено деления и увеличивает конденсацию хромосом. Далее клетки помещают в гипотонический раствор, который приводит к разрыву ядерной оболочки и свободному перемещению хромосом в цитоплазме. На следующем этапе клетки фиксируют смесью этанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1, их суспензию раскапывают на предметные стекла и высушивают. В зависимости от целей кариотипирования используют различные методы дифференциального окрашивания хромосом (G-, R-, C-, Q-методы). Процедура окрашивания занимает несколько минут и приводит к появлению рисунка поперечной исчерченности, специфичного для каждой хромосомы. Световое микроскопирование окрашенных препаратов является самым трудоемким этапом всего исследования, требующим высокой квалификации. Для выявления хромосомных аномалий необходимо проанализировать не менее 30 метафазных пластинок. Большой эффективностью обладают методы компьютерного анализа хромосом. Внедрение молекулярных технологий в сочетании с использованием флюоресцентных окрасок резко увеличивает разрешающую способность цитогенетического анализа. При этом отдельные сегменты хромосом могут быть окрашены в разные цвета, а кариотипы в целом выглядят как фантастические удивительно красочные картины. Разработаны также методы окрашивания хромосом в клетках, находящихся в состоянии покоя, когда хромосомы максимально растянуты. С их помощью могут быть идентифицированы сегменты хромосом размером около 50 килобаз. 2.2.5. Биохимический, иммунологический и микробиологический методы Биохимический и иммунологический методы основаны на анализе различных классов органических и неорганических соединений, дефектных при разных наследственных заболеваниях, в первую очередь, при наследственных болезнях обмена. Биохимические нарушения, как правило, предшествуют появлению клинических симптомов заболевания и являются по сравнению с ними более константными. Предметом биохимической диагностики могут быть белки, аминокислоты, углеводы, липиды, ионы металлов и др., а также их метаболиты. При этом исследовать можно разные ткани и секреты организма (кровь, моча, слюна, пот, ликвор, амниотическая жидкость, биоптаты мышц, кожи, печени и других специализированных тканей). Биохимические методы играют первостепенную роль в диагностике наследственных нарушений обмена веществ. В некоторых случаях они позволяют выявлять гетерозиготных носителей мутаций. Очень важна роль биохимических методов анализа при проведении массовых скринингов беременных или новорожденных с целью более раннего выявления наследственных заболеваний. Ключевая роль в патогенезе любого моногенного заболевания принадлежит первичному биохимическому дефекту – тому белку, который кодируется мутантным геном. Идентификация и анализ первичного биохимического дефекта, определение первичной патологической метаболической цепи – вот главные цели биохимической генетики, решение которых является основой для разработки патогенетических методов профилактики и терапии наследственных заболеваний. Не менее важна роль биохимических методов при диагностике вторичных нарушений. Например, первичным биохимическим дефектом при мышечной дистрофии Дюшенна/Беккера является недостаточность дистрофина – белка, соединяющего цитоскелет мышечной клетки с внеклеточным матриксом. В результате этого нарушения в крови больных повышается уровень одного из мышечных ферментов креатинфосфокиназы, как в начале заболевания, так и в его развернутой стадии. Более того, содержание этого фермента повышено у 30% гетерозиготных носительниц мутации. Хотя это нарушение является вторичным, но простата тестирования креатинфосфокиназы и стойкость его повышения у больных делают его удобным диагностическим маркером заболевания. Разнообразие биохимических методов огромно, и они постоянно совершенствуются. Их подразделяют на качественные, количественные и полуколичественные. Качественные реакции позволяют обнаруживать избыточное количество промежуточных метаболитов, накапливающихся при наследственных болезнях обмена в результате блока ферментативной реакции. Они просты, недороги и достаточно чувствительны. Часто в качестве субстрата для качественной реакции используется моча. Полуколичественные и количественные тесты проводятся как с мочей, так и с кровью. Наиболее простые из них измерение пирувата, лактата, ионов аммония, измерение кислотно-щелочного баланса. Ведущая роль в диагностике наследственных болезней обмена принадлежит высокоточным количественным тестам, использующим методы флуориметрии, спектрофотометрии, хромотографии, электрофореза, масс-спектрометрии. Некоторые методы позволяют одновременно проводить количественную оценку нескольких тысяч метаболических маркеров. Однако эти методы требуют использования достаточно дорогого оборудования и расходных материалов. В некоторых случаях иммунологические методы анализа белков оказываются более эффективными по сравнению с биохимическими. Среди них следует упомянуть иммуногистохимический метод, позволяющий проводить анализ белков и определять их локализацию в специализированных клетках и тканях организма. Иммунологические методы применяют при обследовании больных с иммунодефицитными состояниями (агаммаглобулинемия, атаксия-телеангиэктазия-синдром Луи- Бар и др.), при подозрении на антигенную несовместимость крови матери и плода, при установлении отцовства. Микробиологические методы используются для анализа присутствия в биологическом образце определенных веществ – аминокислот, сахаров и др., необходимых для роста определенных штаммов микроорганизмов. Этот метод лежит в основе известного теста Гатри, применяемого при диагностике фенилкетонурии, гистидинемии, галактоземии и лейциноза. 2.2.6. Молекулярно-генетический метод Молекулярно-генетический метод основан на анализе нуклеиновых кислот, в первую очередь, молекул ДНК. Основной целью этих методов является диагностика мутаций, исследование их ассоциации с наследственными заболеваниями, а также выявление гетерозиготных и гомозиготных носителей мутации. По-существу, молекулярная диагностика является наиболее объективным методом верификации наследственных заболеваний. Важно подчеркнуть, что нахождение мутаций в гомозиготном или гетерозиготном состояниях соответственно при рецессивных или доминантных заболеваниях является бесспорным подтверждением диагноза. Однако в тех случаях, когда мутации не удается обнаружить, решающее заключение при постановке диагноза сохраняется за клиницистом, так как используемые на практике методы молекулярной диагностики чаще всего не позволяют идентифицировать все возможные мутации в исследуемом гене. Внедрению молекулярно-генетической методологии в клиническую практику способствовала разработка метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) или специфической амплификации ДНК, произошедшая более 20 лет назад. Первооткрыватель этого метода Керри Мулис за свое изобретение был удостоен Нобелевской премии в 1993 году. Метод ПЦР позволяет тестировать состояния генов у отдельных индивидуумов. Его суть заключается в избирательном копировании in vitro небольшого фрагмента гена, в котором предположительно может быть локализована мутация, с использованием в качестве матрицы геномной ДНК обследуемого. Небольшие размеры копируемого (или амплифицируемого) фрагмента гена в сочетании с их огромным числом позволяют в дальнейшем использовать очень простые методы для анализа этого участка ДНК, выявления его особенностей у обследуемого пациента. Главными из этих методов являются электрофорез амплифицированной ДНК , ее окрашивание, разрезание специфическими ферментами – рестриктазами , и определение нуклеотидной последовательности этого фрагмента - секвенирование. ПЦР лежит в основе ДНК-диагностики любых наследственных заболеваний. Данный подход широко используется и для анализа генетических факторов риска, предрасполагающих к развитию широко распространенных мультифакториальных заболеваний. В случае молекулярной диагностики инфекций амплифицируется фрагмент ДНК, специфичный для определенного возбудителя, а затем с помощью электрофореза и окрашивания на ДНК тестируется наличие этого фрагмента, а значит и самого возбудителя, в том биологическом образце, который был взят для анализа. Использование ПЦР в судебной медицине основано на амплификации высоко изменчивых областей генома, позволяющих проводить идентификацию личности – метод геномной дактилоскопии . Преимуществом ДНК-диагностики по сравнению с биохимической или иммунологической диагностикой является использование унифицированного набора методов, практически не зависящего от целей проводимого исследования. Это методы выделения ДНК, ПЦР, электрофорез, рестрикция ДНК, гибридизация со специфическими ДНК-зондами и секвенирование. Таким образом, в пределах одной лаборатории можно заниматься ДНК- диагностикой широкого спектра заболеваний. Остановимся более подробно на ключевых методах молекулярной диагностики. Выделение ДНК. Прежде всего, необходимо помнить, что основная масса ДНК находится в ядрах в составе хромосом в суперскрученном состоянии за счет взаимодействия с определенными белками. Таким образом, ДНК можно выделять из любого типа тканей или клеток, в которых содержатся ядра. Существует много модификаций методов выделения ДНК. Мы разберем только принципиальные основы одного из этих методов. У человека ДНК чаще всего выделяют из лейкоцитов крови, для чего производят забор из вены от 1 до 5 мл крови. Кровь нужно собирать в присутствии антикоагулянтов. После отстаивания крови отбирают слой, обогащенный лейкоцитами, и добавляют детергенты для разрушения мембраны клеток. С помощью мягкого центрифугирования осаждают ядра на дно пробирки. Сливают надосадочную жидкость, и к суспензии ядер добавляют детергенты, разрушающие их мембраны, а также протеолитические ферменты, разрушающие белки. Чаще всего используют протеиназу К. Таким образом ДНК выходит в раствор. На следующем этапе необходимо отделить фракцию высокомолекулярных ДНК от низкомолекулярных соединений, таких как фрагменты белков, липиды, углеводы и т.п. Одним из способов такого разделения является экстракция фенолом. При добавлении фенола и тщательном перемешивании низкомолекулярные соединения перейдут в фенол, который окрасится при этом в бурый цвет за счет присутствия фрагментов гемоглобина, а молекулы ДНК останутся на поверхности фенола, так как не смогут войти в этот плотный раствор. Светлый раствор над фенолом, содержащий ДНК, отбирают и проводят несколько раундов повторных очисток фенолом с добавлением на последних этапах хлороформа. Затем можно осадить ДНК из раствора, добавляя этанол. При 70 0 спирта ДНК выпадает в осадок в виде аморфного образования. В таком состоянии ее можно длительно хранить при низких температурах. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) или специфическая амплификация ДНКэто избирательный синтез in vitro большого количества копий (порядка миллиона) небольшого фрагмента ДНК размером, обычно, в сотни нуклеотидов по матричной молекуле ДНК. Для проведения ПЦР необходимо искусственно синтезировать небольшие однонитевые молекулы ДНК размером от 15 до 30 нуклеотидов, комплементарные концам амплифицируемого фрагмента ДНК. Эти молекулы носят название праймеры . Они служат «затравкой» для синтеза ДНК и потому определяют его специфичность. ПЦР проводится в специальных одноразовых пробирках в очень небольшом объеме, не превышающем, обычно, 50 мкл. В этот объем определенного буфера добавляют матричную ДНК (ДНК обследуемого), два типа искусственно синтезированных на коммерческой основе праймеров, фермент комплементарного синтеза ДНК – термофильную ДНК-полимеразу, выделенную из термофильных бактерий и потому способную выдерживать высокие температуры, и 4 типа дезокситрифосфатов (dNTP), которые служат в качестве строительного материала для синтеза ДНК. Схема ПЦР представлена на рис. 32. Рисунок 32. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) или специфическая амплификация ДНК На первом этапе матричную ДНК переводят в однонитевую форму путем нагревания раствора выше 95 0 в течение нескольких минут. Затем начинают циклически чередовать три кратковременные процедуры, длящиеся несколько десятков секунд: (1) отжиг или посадка праймеров - это происходит при охлаждении раствора до температуры, оптимальной для образования двунитевой структуры матричной ДНК с праймерами; (2) синтез ДНК, начиная с праймера – это происходит при повышении температуры раствора до значений, оптимальных для работы термофильной ДНК- полимеразы и (3) денатурация синтезированной ДНК – достигается повышением температуры раствора свыше 90 0 для перехода ДНК в однонитевую форму. Затем все повторяют, начиная с процедуры (1). Таким образом, при каждом цикле смены температур, происходит удвоение участка ДНК, расположенного между праймерами, причем длина этого участка в точности соответствует расстоянию между внешними концами праймеров. После проведения 25-30 подобных циклов количество вновь синтезированных фрагментов ДНК достигает или даже превышает миллион копий. Выбор программы смены температур и длительности каждой из процедур цикла, наряду с выбором праймеров и буфера, зависят от длины и специфики амплифицируемого фрагмента ДНК. Эти параметры и определяют искусство проведения ПЦР, и очень часто они подбираются эмпирически. Циклическая смена температур производится автоматически в приборе, который называется амплификатор ДНК или термоциклер . Таким образом, ПЦР простой в исполнении, не дорогостоящий, высокоточный и современный метод молекулярной диагностики. Электрофорез ДНК принципиально не отличается от белкового электрофореза. Амплифицированную ДНК наносят на полиакриломидный или агарозный гель и включают ток. При этом начинается продвижение ДНК в геле от минуса к плюсу, и скорость этого продвижения зависит от длины молекулы и ее конфигурации. Через определенное время молекулы ДНК одинаковой длины сконцентрируются в узких зонах. Количество копий синтезированных в процессе проведения ПЦР ДНК, обычно, бывает достаточным для ее визуализации при использовании рутинного метода окрашивания ДНК этидиумом бромидом. При добавлении этого красителя к гелю полосы ДНК высвечиваются красным цветом при просмотре геля под ультрафиолетовой лампой. Существует много модификаций ПЦР, удобных для проведения специфических исследований. Так, одномоментно можно амплифицировать не один, а несколько фрагментов ДНК – мультиплексная или множественная ПЦР. Асимметричная ПЦР позволяет вести преимущественный синтез одной цепи ДНК. Вводя специфические красители в праймеры можно оценивать количество копий амплифицированных фрагментов ДНК на автоматическом сканере – количественная ПЦР. Очень мощным является метод ПЦР в реальном времени . На базе ПЦР разрабатываются методы молекулярной цитогенетики – PRINS , количественная флуоресцентная ПЦР. Последний метод, основанный на мультиплексной амплификации повторяющихся хромосом-специфических полиморфных последовательностей ДНК, позволяет оценить количество копий специфических хромосом или их фрагментов, и он очень удобен для проведения пренатальной диагностики анеуплоидий у плода, таких как синдром Дауна, Эдвардса, Патау и др. Молекулярная диагностика мутаций или ДНК-диагностика Клинические методы молекулярной диагностики зависят от характера повреждения гена, то есть от типа мутации. Наиболее просто диагностируются структурные внутригенные мутации – делеции и инсерции, так как они изменяют длину, а значит, и электрофоретическую подвижность амплифицируемого фрагмента ДНК. Для диагностики таких мутаций достаточно провести ПЦР с использованием специфических праймеров и электрофорез, а затем сопоставить длину амплифицированного фрагмента ДНК в норме и у больного. У гомозигот по делеции размер амплифицированного фрагмента будет короче на величину делеции, а значит, этот фрагмент при электрофорезе будет двигаться быстрее и расположится ниже нормального. У гетерозигот на электрофореграмме будут два фрагмента – один нормальной величины и другой более короткий. Аналогично диагностируются инсерции, только длина амплифицированного фрагмента у мутантных гомозигот будет больше, а сам фрагмент на электрофореграмме будет располагаться выше нормального. У гетерозигот на электрофореграмме также будут два фрагмента – нормальной величины и длинный, то есть расположенный выше нормального. На рис.33 представлены результаты диагностики мажорной мутации в гене муковисцидоза – delF508 – делеции 3 нуклеотидов в 10-ом зкзоне гена CFTR. Рисунок 33. Диагностика делеции delF508 в гене муковисцидоза (CFTR) Для диагностики более протяженных внутригенных делеций удобным является метод мультиплексной ПЦР с последующим электрофоретическим разделением маплифицированных фрагментов ДНК. На рис. 34 представлены результаты диагностики делеций в гене миодистрофии Дюшенна методом мультиплексной ПЦР. Рисунок 34. Диагностика делеций в гене миодистрофии Дюшенна (DMD) методом мультиплексной ПЦР Молекулярная диагностика точковых мутаций миссенс- или нонсенс- типа более сложна, так как длина амплифицированного фрагмента при этом не меняется. Наиболее распространенным методом диагностики таких мутаций является метод рестрикционного анализа . Этот метод может быть использован только в тех случаях, когда мутации случайным образом изменяют последовательности, специфичные для узнавания рестриктазами - эндонуклеазами, катализирующими разрезание двунитевых последовательностей ДНК в местах локализации этих специфических сайтов. Для диагностики таких мутаций достаточно провести ПЦР, рестрикцию амплифицированного фрагмента ДНК с использованием специфической эндонуклеазы и электрофорез. При наличии в норме сайта рестрикции произойдет разрезание амплифицированного фрагмента и на электрофореграмме будет две полосы, соответствующие фрагментам ДНК, суммарная длина которых равна величине исходного амплифицированного фрагмента. Исчезновение сайта рестрикции в результате мутации приведет к тому, что у мутантных гомозигот разрезания амплифицированного фрагмента не произойдет и на электрофореграмме будет одна полоса, причем характер ее расположения будет аналогичен тому, который можно наблюдать после электрофореза до рестрикции. У гетерозигот выявятся все три полосы, одна из которых соответствует неразрезанному амплифицированному фрагменту, а две – продуктам рестрикции. В настоящее время идентифицировано более 500 различных рестриктаз, и для каждого из этих ферментов существует свой сайт узнавания. Поэтому, как только описывается какая-то новая мутация, сразу же с помощью определенной компьютерной технологии производится анализ окружающей ее нуклеотидной последовательности на предмет выявления сайтов рестрикции. Если этот поиск оказывается успешным, клиническая диагностика подобной мутации проводится методом рестрикционного анализа с использованием специфичной для данного сайта эндонуклеазы. Поскольку метод рестрикционного анализа очень прост и удобен в исполнении, существует много модификаций этого метода, направленных на искусственное введение сайтов рестрикции и т.п. Однако на них мы останавливаться не будем. На рис. 35 представлены результаты диагностики мутации R408W в гене фенилкетонурииметодом рестрикционного анализа. Рисунок 35. Диагностика мутации R408W в гене фенилкетонурии (PAH) методом рестрикционного анализа Универсальным методом диагностики точковых мутаций является метод аллель-специфических олигонуклеотидов (АСО) . Этот метод основан на гибридизации амплифицированных ДНК со специфическими олигонуклеотидными ДНК-зондами. Он более трудоемок, так как требует синтеза и специфического мечения ДНК-зондов. Однако этот метод поддается автоматизации, и на его базе разрабатываются технологии, позволяющие одновременно тестировать десятки или даже сотни мутаций. При этом используются микрочиповые технологии, то есть меченные олигонуклеотиды в микроколичестве наносятся на твердые носители (чипы), а затем проводится их гибридизация с исследуемыми образцами ДНК. Сходная технология – «микроэррей» – используется для анализа экспрессионного профиля генов , то есть множества генов, избирательно экспрессирующихся в специфических тканях или клетках, у пациентов с определенными патологическими состояниями, различающихся по возрасту, этнической принадлежности и другим параметрам. Техника «микроэррей» позволяет одновременно анализировать экспрессию десятков тысяч генов. Секвенирование ДНКявляется самым объективным методом регистрации мутаций, при котором точно идентифицируется молекулярный характер повреждения. Однако в клинической практике этот метод используются редко в виду его трудоемкости и высокой стоимости. |