Учебно-методическое пособие. Учебнометодическое пособие для самоподготовки и самостоятельной работы студентов лечебного факультета по микробиологии, вирусологии
 Скачать 1.36 Mb.
|
ЗАНЯТИЕ 16РЕАКЦИЯ ИММУННОГО ЛИЗИСА (ИММУННОГО БАКТЕРИОЛИЗА,ИММУННОГО ГЕМОЛИЗА). РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА. РЕАКЦИИ С МЕЧЕНЫМИ КОМПОНЕНТАМИ: ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИЯ (РИФ), ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ (ИФА), ИММУНОБЛОТТИНГ, РАДИОИММУННЫЙ АНАЛИЗ (РИА), ИММУННАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ (ИЭМ) На данном занятии изучаются реакции иммунитета с участием комплемента и реакции иммунитета с мечеными компонентами (меченые антигены или антитела). Необходимо продумать механизмы и схемы постановки этих реакций. В последние годы перечисленные реакции широко используются для диагностики инфекционных заболеваний и вытесняют традиционные методы (агглютинации, преципитации). Цель самоподготовкиПосле самостоятельного изучения темы студент должен знать о каждой из реакций: - ингредиенты; - механизм реакции; - методы и схемы постановки; - практическое применение; - диагностические препараты. Исходный уровень знанийДля усвоения материала необходимо восстановить знания, полученные на предыдущих двух занятиях: комплемент и пути его активации; антигены и антитела; механизмы реакций иммунитета. Цель занятия1. Изучить механизм и методы постановки реакции иммунного бактериолиза и иммунного гемолиза. 2. Изучить механизм и методы постановки реакции связывания комплемента (РСК). 3. Изучить механизм и методы постановки реакции иммунофлюоресценции (РИФ). 4. Изучить механизм и методы постановки реакций иммуноферментного анализа (ИФА), радиоиммунного анализа (РИА), иммуноблоттинга. 5. Изучить механизм и методы постановки реакции иммунной электронной микроскопии (ИЭМ). 6. Научиться интерпретировать результаты серологических исследований. План изучения темы1. Реакция иммунного бактериолиза. 2. Реакция иммунного гемолиза. 3. Реакция связывания комплемента. 4. Реакция с мечеными компонентами: РИФ, ИФА, РИА. ИЭМ, иммуноблоттинг. 5. Реакции иммобилизации. После изучения темы студент должен уметь
Дополнительный материал к занятиюРеакция локального гемолиза в геле Реакция предложена Н. Йерне в 1963 г., её применяют для подсчета клеток-антителопродуцентов. Клетки, продуцирующие антитела (например, плазмоциты селезёнки, после иммунизации животного эритроцитами барана), вносят вместе с эритроцитами барана в гель (агар). Затем в реакционную систему вносят комплемент (наслаивая его на агар) и наблюдают образование зон гемолиза вокруг каждой клетки, образующей антитела к эритроцитам барана. Метод получил распространение во многих областях экспериментальной иммунологии, так как даёт возможность оценить образование антител на уровне отдельных тканей и органов и клеточных популяций иммунной системы после различных воздействий. Иммуноферментный анализ (ИФА) ИФА – это выявление антигенов (или антител) с помощью соответствующих им антител (антигенов), конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, β-галактозидазой или щелочной фосфатазой). Наиболее распространён твердофазный ИФА, когда один из компонентов иммунной реакции (антигены или антитела) сорбирован на твёрдом носителе, например, в лунках пластиковой микропланшетки из полистирола. Для определения антител в лунки с сорбированным антигеном последовательно добавляют:
Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путём тщательного промывания. При положительном результате изменяется окраска раствора хромогена в жёлто-коричневый цвет (при использовании пероксидазы) или жёлто-зелёный цвет (при использовании фосфатазы). Если необходимо определить в исследуемом материале антиген, тогда в лунку с сорбированными антителами вносят исследуемый материал, добавляют иммунную сыворотку против антигена, меченную ферментом, и смесь растворов субстрата для фермента и хромогена. Для постановки ИФА выпускаются специальные тест-системы с набором всех необходимых ингредиентов. К настоящему времени созданы многочисленные модификации базовой методики ИФА. Конкурентные методы ИФА: искомый антиген и меченный ферментом антиген конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки. Этот тест используется для определения количества антигена в исследуемом материале. Сэндвич-ИФА (метод двойных антител для определения антигена):фиксированные на твёрдой фазе антитела инкубируют с анализируемым антигеном. После отмывания добавляют избыток меченых антител, специфичных к тому же антигену. Несвязавшиеся антитела отмывают. Продукт ферментативной реакции образуется в количествах, пропорциональных количеству связанного антигена. Можно использовать немеченые вторые антитела; о реакции в данном случае судят по связыванию энзим-меченых антител, специфичных по отношению к IgG (вторые антитела). В любом случае первые и вторые антитела должны принадлежать животным разных видов. Измерение количества продуктов реакции ИФА проводят в автоматизированном варианте в приборах-ридерах с помощью спектрофотометра, по оптической плотности растворов в лунках при определённой длине волны. Иммуноблоттинг Иммуноблоттинг – (от англ. «blot» – пятно) – метод идентификации антигенов (или антител) с помощью известных сывороток (или антигенов). Представляет собой сочетание гель-электрофореза с ИФА. Первоначально бактериальные клетки или вирионы разрушают при помощи ультразвука, а затем методом электрофореза разделяют все антигены вируса или бактериальных клеток и получают коммерческий реагент на специальной нитроцеллюлозной плёнке. При постановке иммуноблоттинга на плёнку с известными антигенами наносится исследуемая сыворотка пациента. После инкубации и отмывания несвязавшихся антител, приступают к ИФА – на плёнку наносят антисыворотку к иммуноглобулинам человека, меченную ферментом, и хромогенный субстрат, изменяющий окраску при взаимодействии с ферментом. При наличии комплексов антиген-антитело-антисыворотка к иммуноглобулину-фермент на носителе появляются окрашенные пятна. Метод иммуноблоттинга позволяет отдельно обнаружить антитела на различные антигены возбудителя (например, при ВИЧ-инфекции иммуноблоттинг выявляет антитела на gp120, gp24 и другие антигены вируса). Радиоиммунный анализ (РИА) В основе метода лежит реакция антиген-антитело с применением метки антигена или антитела радионуклидом. В качестве метки используются 125I, 14C, 3H, 51Cr и другие радионуклиды. Образующиеся иммунные комплексы выделяют из системы и определяют их радиоактивность на счётчиках (β-излучение). Интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. Широко распространён твёрдофазный вариант РИА с использованием меченых антител или антигенов, сорбированных в лунках полистироловых панелей. РИА применяют для выявления антигенов микробов, вирусов, различных гормонов, ферментов, лекарственных веществ, иммуноглобулинов, а также других веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях 10-12–10-15 г/л. Контрольные вопросыРеакция иммунного бактериолиза: что это за реакция; что является антигеном, что – антителами, механизм реакции, методы постановки, практическое применение. Реакция иммунного гемолиза: необходимые ингредиенты, методика постановки; контроли, практическое применение. Реакция локального гемолиза в геле (реакция Йерне): принцип реакции, методика постановки, практическое применение. Реакция связывания комплемента: принцип реакции; что образуется при взаимодействии иммунной сыворотки со специфическим антигеном; что происходит с комплементом, если он присутствует при этом взаимодействии? Какова судьба комплемента в том случае, если между антигеном и антителами нет специфического сродства? С помощью какой реакции можно определить, что произошло с комплементом; почему используется именно эта реакция; каков видимый положительный результат РСК? Почему? Какое свойство комплемента используется в первой фазе РСК? Во второй фазе? Если конечным результатом РСК является гемолиз, что это означает – положительный или отрицательный результат? Объясните результаты: РСК+ + + +, РСК+ + +, РСК+ +, РСК+. Назовите ингредиенты первой системы РСК и ингредиенты второй системы РСК. Почему исследуемую сыворотку необходимо инактивировать? Как титруют комплемент? Гемолитическая сыворотка: что она содержит, как её получают, что такое титр и как его определяют? Какие животные используются для получения компонентов РСК? Методика постановки РСК на холоде. При постановке каких из перечисленных реакций необходимо участие комплемента: преципитации, флоккуляции, агглютинации, выявления неполных антител, иммунного бактериолиза, иммунного гемолиза, Йерне, РСК? Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) – укажите последовательность событий при прямой реакции Кунса; необходимые ингредиенты. Что является антигеном, что – антителами, чем помечены антитела, как учитывается результат реакции, как выглядит положительный результат? Практическое применение – что можно определить с помощью этой реакции? Непрямая реакция иммунофлюоресценции – укажите последовательность событий при этой реакции, необходимые ингредиенты, что является антигеном, какие иммунные сыворотки применяются; практическое применение; преимущество непрямой РИФ по сравнению с прямой реакцией. Иммуноферментный анализ (ИФА) – принцип реакции; необходимые ингредиенты; укажите последовательность событий при постановке реакции с целью обнаружения антигена в исследуемом материале; необходимые ингредиенты; что происходит при положительном результате, как он выглядит? Укажите последовательность действий при постановке ИФА с целью обнаружения антител в исследуемой сыворотке; необходимые ингредиенты; что происходит при положительном результате? Иммуноблоттинг – принцип реакции; основные этапы; необходимые ингредиенты; как учитывается результат; преимущества реакции. Радиоиммунный анализ (РИА) – из каких основных этапов складывается реакция; чем помечены антитела или антигены, как учитывается результат? Иммуноэлектронная микроскопия – принцип метода; основные этапы; необходимые ингредиенты; чем помечены антитела; как учитывается результат реакции. Реакции иммобилизации – принцип метода, техника постановки, компоненты, учёт результатов. Задания для выполнения в процессе самоподготовки.Заполните таблицу «Реакции иммунитета» в отношении реакций, разбираемых в рамках данной темы. Реакции иммунитета
Работа студента на практическом занятииРаботу начать сразу с постановки 1 фазы РСК, но в тетрадь записать позже (см. ниже). 1. Реакция иммунного гемолиза. Посмотреть демонстрационную реакцию иммунного гемолиза, зарисовать в виде схемы, объяснить результат в опытной и в контрольных пробирках. 2. Реакция связывания комплемента а) разобрать РСК по таблице; б) начертить в тетрадь схему постановки РСК в виде таблицы; в) поставить вторую фазу РСК (первая фаза ставится в начале занятия); г) разобрать диагностические препараты, необходимые для РСК; д) учесть результат. Сформулировать вывод о наличии специфических антител в исследуемой сыворотке. 3. Реакция иммунофлюоресценции. Изучите таблицу, составьте в тетради схему постановки реакции; посмотрите диагностические сыворотки; определите – что содержит сыворотка, как приготовлена, для какой реакции (прямой или непрямой РИФ) она применяется. Посмотрите демонстрационный результат РИФ в люминесцентном микроскопе. 4. Иммуноферментный анализ (ИФА). Составьте в тетради схему постановки реакции в двух вариантах: для обнаружения антигена в исследуемом материале и для обнаружения антител в сыворотке. Ознакомьтесь с набором ингредиентов для диагностики ВИЧ-инфекции и гепатита В. Определите, что содержит каждый ингредиент и для чего он применяется. 5. Иммуноблоттинг. Составьте в тетради схему постановки реакции; посмотрите демонстрацию – результат реакции. 6. Радиоиммунный анализ (РИА). Составьте в тетради схему реакции. 7. Иммунная электронная микроскопия (ИЭМ). Посмотрите демонстрацию – результат реакции, составьте в тетради схему реакции, укажите стрелками антиген (вирус) и меченые антитела. |