|
|
Учебно-методическое пособие. Учебнометодическое пособие для самоподготовки и самостоятельной работы студентов лечебного факультета по микробиологии, вирусологии
ЗАНЯТИЕ 12 АНТИБИОТИКИ (ОКОНЧАНИЕ). ГЕНЕТИКА МИКРОБОВ,
ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ, БИОТЕХНОЛОГИЯ
Способность микроорганизмов изменять свои свойства имеет непосредственное отношение к практической медицине, так как может оказать влияние на результаты лечения, диагностики и профилактики инфекционных заболеваний. В последние годы основные достижения генетики получены на модели микроорганизмов. Возникли новые научные направления – молекулярная генетика и генетическая инженерия. Развитие этих направлений позволило изучить тонкую структуру гена и обеспечивает возможность получения организмов с запланированными свойствами, лечения наследственных заболеваний человека и получение антибиотиков, гормонов, антител и других биологических веществ промышленным путём (биотехнология).
Цель самоподготовки
После самостоятельного изучения темы студент должен знать:
- структуру и особенности генома микроорганизмов;
- формы изменчивости микроорганизмов, условия, вызывающие изменение их свойств;
- внехромосомные генетические факторы, их свойства и роль в изменчивости микроорганизмов;
- значение изменчивости микроорганизмов для практической медицины.
Исходный уровень знаний
Для усвоения материала темы необходимо знать основные законы генетики, тонкую структуру генов и механизмы, обеспечивающие их функционирование, а также нарушение функции генов в результате мутаций (биология); структуру и функции нуклеиновых кислот, ферменты, участвующие в реализации генетической информации (биохимия).
Цель занятия
1. Ознакомиться с особенностями генома бактериальной клетки, видами и формами изменчивости микроорганизмов.
2. Ознакомиться с практическим применением достижений генной инженерии.
План изучения темы
1. История развития учения о генетике микроорганизмов.
2. Формы изменчивости микроорганизмов.
3. Значение изменчивости микроорганизмов для теории и практики медицины.
Выявить проявления фенотипической изменчивости (модификации) у бактерий.
Интерпретировать результаты опытов по получению фено- и генотипической изменчивости у бактерий.
Учесть и оценить результаты ПЦР.
Дополнительный материал к занятию
Генетические методы диагностики инфекционных заболеваний
Идентификация нуклеиновых кислот
Метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот (НК) основывается на способности НК специфически соединяться (гибридизироваться) с комплементарными фрагментами гомологичных ДНК или РНК искусственно созданных нитей, меченных изотопами или ферментами (пероксидаза, щелочная фосфатаза).
Полимеразная цепная реакция (ПЦР). В случаях когда в исследуемом материале ДНК или РНК мало или недостаточно для того, чтобы установить её точную генетическую принадлежность, прибегают к полимеразной цепной реакции, основу которой составляет катализируемое ДНК-полимеразой многократное образование копий определённого участка ДНК. ПЦР была разработана в 1983 году американским учёным Керри Мюллисом. В 1993 году К. Мюллис за свои исследования был удостоен Нобелевской премии.
ДНК состоит из двух цепей, построенных из четырёх нуклеотидов: аденина, тимина, гуанина, цитозина (А, Т, Г, Ц). Последовательность нуклеотидов одной цепи комплементарна последовательности другой. У каждой цепи есть 3’- и 5’-концы. 3’-конец одной цепи связан с 5’-концом другой. ДНК-полимераза узнает азотистые основания в цепочке-матрице и наращивает вторую цепочку от 3’- к 5’-концу ДНК, делая подобие негатива. В среде, где производится синтез, должен присутствовать строительный материал – свободные нуклеотиды. ДНК-полимераза начинает работать только тогда, когда к цепи ДНК присоединяется праймер. Праймер представляет собой небольшую цепочку нуклеотидов, служащую затравкой для синтеза новой цепи. С матрицей она соединяется комплементарно. В праймере должно быть не менее 20-30 нуклеотидов: чем их больше, тем точнее выбирается антипоследовательность. Многократно повторяя эту операцию, полимераза способна удлинять 3’-конец праймера до тех пор, пока не достигнет 5’-конца матрицы. Однако если добавить в среду дидезоксинуклеотидтрифосфат (ddNTP), например, дидезоксиаденин (ddA), дальнейший рост цепи невозможен, поскольку к 3’-концу нуклеотиды присоединяться уже не могут.
Зная последовательность оснований, на его границе синтезируют праймер-антипоследовательность из 20-30 нуклеотидов. Их добавляют к препарату расплетённой ДНК, они связываются с родственным участком. С этого места начинает работать фермент-копировщик ДНК-полимераза. Чтобы ограничить нужный участок с другой стороны, с 3’-конца, нужны ddNTP четырёх типов. Копия антипараллельна, и по ней ДНК-полимераза движется в обратную сторону. Работу она начинает с праймера ко второму граничному участку (он должен быть антипоследовательностью, то есть таким же, как в матрице). Дойдя до конца, который был началом в предыдущем проходе, фермент уже во втором цикле выдаёт точную копию избранного участка. Полимераза копирует её в следующем цикле, потом обе копии, потом – 4 и т.д. Заставив полимеразу работать дальше побочных продуктов реакции - копий с длинными хвостами с обеих сторон, будет всё меньше. После 20 проходов будет около 1 миллиона копий нужного участка, а других фрагментов – лишь несколько десятков.
Техника ПЦР
Исследуемым материалом для ПЦР может быть культура бактерий, нуклеиновые кислоты, выделенные из клеток, биологические жидкости (кровь, моча), материал из внешней среды – вода, почва, пищевые продукты и т.д., содержащие ДНК или РНК.
На I этапе молекула ДНК разделяется нагреванием до 950С на 2 комплементарные нити.
На II этапе в реакционную смесь добавляют искусственно синтезированные ДНК-олигонуклеотидные праймеры двух типов. Одни из них комплементарны началу одной цепи ДНК, другие – концу второй. Одновременно вводится смесь 4 типов ddNTP. Праймеры соединяются с цепями ДНК.
На III этапе смесь нагревают до 700С и добавляют фермент ДНК-полимеразу (термостабильную), выделенную в 1980 году Калединым из бактерий Thermus aquaticus, живущих в горячих источниках. Этот фермент достраивает вслед за каждым праймером вторую цепь. Процесс удвоения повторяется 20-30 раз до получения миллиона копий исходной молекулы ДНК. Для проведения ПЦР применяются специальные термостаты – термальные циклеры, позволяющие многократно и быстро проводить нагревание и охлаждение исследуемых проб.
На IV этапе проводится оценка результатов ПЦР с помощью электрофореза в 1% геле с окраской фракций ДНК бромидом этидия, ярко светящимся в ультрафиолетовых лучах. Полученные электрофореграммы затем анализируются.
ПЦР наиболее эффективна для обнаружения микроорганизмов, трудно культивируемых в лабораторных условиях. Как правило, эти возбудители – внутриклеточные паразиты, длительно персистирующие в организме хозяина.
Контрольные вопросы
Дайте определение понятий «наследственность» и «изменчивость». Основные этапы развития учения о наследственности и изменчивости у микроорганизмов. Что такое генотип, фенотип? Особенности структуры генома прокариотов. Структурная модель ДНК по Уотсону и Крику. Что такое генетический код? Какими символами обозначается генотип и фенотип бактерий? Перечислите внехромосомные факторы наследственности. Перечислите бактериальные плазмиды; какие свойства они кодируют? Что такое трансмиссивные, нетрансмиссивные плазмиды? Что такое транспозоны, Is-последовательности? Формы изменчивости микроорганизмов: генотипическая и фенотипическая. Механизмы наследственной изменчивости бактерий: мутации и рекомбинации, виды рекомбинаций. Укажите фамилию учёного, опыты которого с пневмококками наметили пути для поиска материальной основы наследственности. Опишите механизм трансформации, трансдукции, конъюгации. Применение генетических методов в диагностике инфекционных заболеваний.
ЗАДАЧА. У больного К. с диагнозом бактериальная дизентерия в первый день заболевания выделен возбудитель дизентерии с типичными для этого вида биохимическими и другими свойствами (не ферментировал лактозу). Через два дня у этого же больного был выделен микроб, у которого все свойства были типичными для возбудителя дизентерии: у него появилась способность ферментировать лактозу. Какой генетический механизм возникновения у возбудителя дизентерии нового свойства можно предположить? Как доказать наличие предполагаемого вами механизма изменчивости?
Дайте определение понятий: молекулярная биология, биотехнология, генетическая инженерия. Опишите последовательность этапов генной инженерии. Укажите способы получения чистых генов для генетической инженерии; векторы (проводники) с помощью которых рекомбинантную ДНК можно ввести в клетку. Ферменты, с помощью которых можно расщеплять молекулу ДНК на отдельные фрагменты, «сшивать» отдельные фрагменты ДНК. Достижения генетической инженерии и биотехнологии: перечислите основные продукты, применяемые в медицине. Геномная инженерия: методы, достижения. Значение изменчивости микроорганизмов для практической медицины.
Задания для выполнения в процессе самоподготовки
Составьте схему: «Формы изменчивости бактерий».
Работа студента на практическом занятии
1. Учёт посевов предыдущего занятия (см. занятие 11).
2. Опыт по выявлению спонтанных мутаций у бактерий.
Цель опыта: определить, имеются ли мутанты, устойчивые к стрептомицину, в культуре бактерий, которая не соприкасалась со стрептомицином.
Методика: на чашке с МПА производится рассев культуры бактерий с целью получения изолированных колоний. После суточного инкубирования в термостате выросшие колонии с помощью игольчатого штампа-репликатора переносятся на чашку с МПА, содержащим стрептомицин, и контрольную чашку. После суточного инкубирования в термостате учитывают результат.
Результат: зарисовать чашки с колониями.
Вывод: сформулировать.
3. Опыт конъюгации бактерий.
Цель опыта: определить, возможна ли конъюгация между данными штаммами.
ЗАДАЧА: получить прототрофный рекомбинант путём конъюгации двух ауксотрофных культур.
Материал: донор, ауксотроф по лейцину, реципиент - ауксотроф по треонину.
Методика: суточные бульонные культуры этих штаммов смешивают во флаконе и оставляют в термостате на 30-60 минут. В результате конъюгации от клеток донора к реципиенту передаются гены, кодирующие способность синтезировать треонин, и образуются прототрофные клетки. Для выявления этих клеток смесь бактерий высевают на среду, в которой отсутствуют лейцин и треонин (так называемая минимальная среда). Если конъюгация произошла, то на минимальной среде вырастут колонии прототрофных рекомбинантов. Донор и реципиент не вырастают.
Результат: нарисовать чашку с готовым результатом опыта.
Вывод: сформулировать.
4. Нарисовать в тетради схемы опытов трансформации и трансдукции.
5. Опыт бактериоциногении.
Цель: определить, какие из испытуемых культур кишечной палочки способны продуцировать колицины.
Методика: испытуемые культуры засеяны бляшками на чашке с МПА. После двухсуточной инкубации в термостате выросшие культуры убиты парами хлороформа. На поверхность посева наливается растопленный МПА, содержащий колицинчувствительную культуру. После инкубации в термостате учитывается результат по зонам отсутствия роста вокруг колоний колициногенных культур.
Результат: зарисовать.
Вывод: сформулировать (указать колициногенные культуры).
6. Диссоциация бактерий. Посмотреть с помощью бинокулярной лупы колонии эпидермального стафилококка: гладкие (S) и шероховатые (R).
РАЗДЕЛ 4.
Учение об инфекции. Иммунологические основы диагностики лечения и профилактики заболеваний.
Темы практических занятий раздела «Учение об инфекции. Иммунологические основы диагностики лечения и профилактики заболеваний».
1. Инфекция. Экспериментальный метод исследования.
2. Иммунитет. Факторы врождённого иммунитета. Антигены.
3. Антитела. Реакции иммунитета: реакция нейтрализация токсинов антитоксинами, реакция преципитации, реакция агглютинации.
4. Реакция иммунного лизиса (иммунного бактериолиза, иммунного гемолиза). Реакция связывания комплемента. Реакции с мечеными компонентами: иммунофлюоресценция (РИФ), иммуноферментный анализ (ИФА), иммуноблоттинг, радиоиммунный анализ (РИА), иммунная электронная микроскопия (ИЭМ).
5. Медицинские биологические препараты для диагностики, профилактики и терапии инфекционных болезней.
6. Итог по разделу «Инфекция. Иммунологические основы диагностики лечения и профилактики заболеваний»
Содержание компетенций и планируемый пороговый уровень развития компетенций в результате изучения раздела
«Учение об инфекции. Иммунологические основы диагностики лечения и профилактики заболеваний».
№
|
Код компетенции
|
Содержание компетенции
(или её части)
|
В результате изучения дисциплины обучающиеся должны:
|
Знать
|
Уметь
|
Владеть
|
1.
|
ПК–7
|
Способность и готовность применять методы асептики и антисептики, проводить санитарную обработку лечебных и диагностических помещений медицинских организаций
|
классификацию, морфологию и физиологию микроорганизмов и вирусов, их влияние на здоровье человека, методы микробиологической диагностики, применение основных антибактериальных и противовирусных препаратов, методы асептики и антисептики
|
пользоваться физическим, химическим и биологическим оборудованием для проведения санитарной обработки помещений медицинских организаций
|
алгоритмом применения методов асептики и антисептики
|
2.
|
ПК–11
|
Способность и готовность использовать методы оценки природных и медико-социальных факторов среды в развитии болезней у взрослого населения и подростков, осуществлять профилактические мероприятия по предупреждению инфекционных болезней
|
основные понятия и проблемы биосферы и экологии, феномен паразитизма и биоэкологические заболевания; функциональные системы организма человека, их регуляцию и саморегуляцию при воздействии с внешней средой в норме и патологии
|
работать с увеличительной техникой (микроскопами, оптическими и простыми лупами); проводить микробиологическую и иммунологическую диагностику
|
алгоритмом проведения профилактических мероприятий по предупреждению инфекционных болезней
|
3.
|
ПК–20
|
Способность и готовность осуществлять алгоритм выбора медикаментозной терапии больным с инфекционными заболеваниями
|
структурные и функциональные основы болезней и патологических процессов, причины, основные механизмы развития и исходов типовых патологических процессов, нарушений функций органов и систем
|
применять основные антибактериальные, противовирусные и биологические препараты; анализировать вопросы общей патологии и современные теоретические концепции и направления в медицине
|
принципы патогенетической терапии больных инфекционными заболеваниями
|
4.
|
ПК–31
|
Способность и готовность изучать научно-медицинскую информацию, отечественный и зарубежный опыт по тематике исследования
|
методы сбора, хранения и обработки научно-медицинской информации
|
производить расчёты по результатам эксперимента, проводить элементарную статистическую обработку экспериментальных данных, анализировать отчёты
|
базовыми технологиями преобразования информации: текстовые, табличные редакторы, поиск в сети Интернет
| |
|
|
Скачать 1.36 Mb.