Учебно-методическое пособие. Учебнометодическое пособие для самоподготовки и самостоятельной работы студентов лечебного факультета по микробиологии, вирусологии
 Скачать 1.36 Mb.
|
МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ
МЕТОДЫ ЧАСТИЧНОГО ОБЕСПЛОЖИВАНИЯ
Дайте определение понятий: Стерилизация Асептика Дезинфекция Антисептика Работа студента на практическом занятии1. Изучение культуральных свойств бактерий. Ознакомьтесь с характером роста бактерий на жидких и плотных питательных средах, опишите их в тетради. Изучите характер роста пигментных бактерий по готовым посевам и опишите в тетради. 2. Выделение чистой культуры аэробов (второй день). Изучите и опишите в тетради выросшие на чашке колонии. Отберите изолированные колонии, принадлежащие разным видам бактерий, приготовьте из них мазки, микроскопируйте и зарисуйте. Произведите пересев одной из отобранных колоний на скошенный агар. 3. Выделение чистой культуры анаэробов (третий день). Изучите и опишите колонии в трубке Вейон–Виньяля. Отберите изолированную колонию, извлеките её путём распила трубки, приготовьте мазок, окрасьте по Граму, микроскопируйте, зарисуйте, произведите пересев из этой же колонии на среду Китта–Тароцци. 4. Методы стерилизации. Ознакомьтесь с аппаратурой для стерилизации (демонстрация). 5. Устройство термостата, бокса для проведения посевов (демонстрация). ЗАНЯТИЕ 8ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР БАКТЕРИЙ (ОКОНЧАНИЕ).ИЗУЧЕНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ СВОЙСТВ БАКТЕРИЙ. САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВОДЫ И ВОЗДУХА. НОРМАЛЬНАЯ МИКРОФЛОРА ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА Способность микробов расщеплять углеводы и белки широко используется в микробиологической практике для идентификации (определения вида) микроба. Дело в том, что разные виды бактерий, в том числе и имеющие одинаковую морфологию, могут отличаться по ферментативной активности. Поэтому идентифицировать такие виды только по их морфологии невозможно. После выделения чистой культуры морфологически сходных микробов производят их посев на среды с углеводами и белковые среды. В окружающей нас природе наряду с микробами–сапрофитами могут находиться и патогенные микроорганизмы. Поэтому систематический микробиологический контроль почвы, воды и воздуха имеет большое практическое значение как для предупреждения инфекционных заболеваний, так и в интересах экологии - сохранения постоянства микрофлоры в естественной среде обитания. Цель самоподготовкиПосле самостоятельного изучения темы студент должен знать: - ферменты микробов; методы определения ферментативной активности микробов, применяемые для этого питательные среды; - микрофлору почвы, воды и воздуха; методы санитарно–бактериологического исследования объектов внешней среды. Исходный уровень знанийДля усвоения материала темы необходимо знать: - выделение чистой культуры аэробов и анаэробов; - питательные среды. Цель занятия1. Изучить принципы идентификации чистых культур по морфологическим, культуральным, биохимическим и другим свойствам. 2. Показать разнообразие ферментов у микроорганизмов и возможности их использования для идентификации. 3. Изучить методы и показатели, необходимые для микробиологической оценки объектов окружающей среды. План изучения темы1. Ферменты микробов – по лекции и по учебнику. Обратите внимание на особенности ферментных систем прокариотов. Определение ферментативной активности микробов – по практическому руководству и по дополнительному материалу к данному занятию. 2. Санитарно-бактериологическое исследование почвы, воздуха и воды - по учебнику, по лекции, по практическому руководству. Микрофлору внешней среды следует усвоить по определенному плану: постоянная микрофлора данной среды, санитарно-показательные микроорганизмы, показатели микробного загрязнения; для каких инфекционных заболеваний данная среда может быть фактором передачи. Методы санитарно-бактериологических исследований и предельно-допустимые показатели – усвоить конкретно. 3. Нормальная микрофлора организма человека. После изучения темы студент должен уметь
Дополнительный материал к занятиюДля отличия одних видов бактерий от других изучают их ферментативную активность. Для обнаружения ферментов исследуемую культуру микробов засевают на специальные дифференциально-диагностические питательные среды, которые в зависимости от состава и своего назначения можно разделить на 4 группы.
Свойство расщеплять углеводы и высокоатомные спирты, которые принято объединять в одну группу, именуемую сахарами, присуще многим микробам. Под действием сахаролитических ферментов бактерий «сахарá» расщепляются либо до кислоты, либо до кислоты и газа. Сахаролитические свойства изучают на средах Гисса (или «пёстрого ряда»). Среды Гисса готовятся на основе жидкой среды (пептонной воды) или полужидкого мясо-пептонного агара. Содержат какой-либо углевод или многоатомный спирт (лактозу, глюкозу, маннит, сахарозу и т.д.) и индикатор, который меняет свой цвет в кислой среде. В пробирку с жидкой средой Гисса помещают стеклянный поплавок. Если на среду Гисса посеять микроб, который сбраживает данный углевод с образованием кислоты и газа, то есть до конечных продуктов, то среда изменит свой цвет, в полужидкой среде появятся пузырьки и разрывы в толще агара, в жидкой среде - пузырёк газа в поплавке. При сбраживании углевода только до промежуточных продуктов (до кислоты) происходит только изменение цвета среды. Кроме того, сахаролитическую активность изучают на средах: Эндо, Левина, Плоскирева, Клиглера, Олькеницкого и других. Среды Эндо, Левина, Плоскирева в чашках Петри применяются для дифференцировки бактерий кишечной группы по их способности сбраживать лактозу. Эти среды содержат питательный агар, лактозу и индикатор, изменяющий свой цвет в кислой среде (индикатор рН). Если посеять на такую среду бактерии, которые сбраживают лактозу, например, кишечную палочку, то в результате сбраживания лактозы образуется кислота и индикатор изменит свой цвет в кислой среде. Поэтому колонии кишечной палочки на таких средах будут окрашены соответственно цвету индикатора: на среде Эндо и среде Плоскирева – в красный цвет, на среде Левина – в чёрно-синий. Если же на эти среды посеять бактерии, которые не сбраживают лактозу, например, палочки брюшного тифа или палочки дизентерии, то кислота не образуется, реакция среды останется слабощелочной и цвет индикатора не изменится. Поэтому колонии бактерий, не сбраживающих лактозу, на этих средах будут бесцветными. Среду Плоскирева можно отнести также и к элективным средам, для выделения палочек дизентерии, так как эта среда содержит соли желчных кислот, задерживающих рост кишечной палочки, и краситель бриллиантовый зеленый, задерживающий рост воздушной кокковой микрофлоры. Висмут–сульфит агар – это дифференциально-диагностическая среда, применяемая главным образом при диагностике сальмонеллёзов. При росте сальмонелл происходит восстановление висмута из его солей и колонии сальмонелл, в отличие от других видов микробов, окрашиваются в чёрный цвет. Применяются также комбинированные среды, содержащие не один углевод, а два или три, например, среда Олькеницкого – трёхсахарный агар с мочевиной. Одна пробирка среды Олькеницкого заменяет скошенный агар и среды Гисса с лактозой, сахарозой и глюкозой. Среда готовится на основе не очень плотного МПА. Содержит лактозу (1%), сахарозу (1%), глюкозу (0,1%), мочевину, соль Мора (сульфат железа), гипосульфит натрия и индикатор. Среду после стерилизации в расправленном виде оставляют застывать в таком положении, чтобы получился столбик и скошенная часть. Посев производится штрихом по скошенной части и уколом в столбик. При сбраживании углеводов, которые содержатся в большем количестве (лактозы, сахарозы или обоих сахаров) изменяется цвет всей среды; при сбраживании только глюкозы изменяется цвет столбика, а скошенная часть остается без изменений. Образование газа определяется по наличию пузырьков в столбике агара. Культуры, расщепляющие мочевину с образованием аммиака, дают щелочную реакцию. При этом происходит нейтрализация кислоты, образующейся при сбраживании углеводов, и цвет всей среды не изменяется. Расщепление мочевины свойственно протеям и некоторым кишечным палочкам. Патогенные энтеробактерии не разлагают мочевину. Добавление соли Мора и гипосульфита позволяет также изучить способность бактерий расщеплять белки с образованием сероводорода, что определяется по почернению в столбике агара в результате превращения сульфата железа в сульфид чёрного цвета. При росте микроорганизмов, образующих амилазу, на средах с растворимым крахмалом происходит его расщепление. Об этом узнают, прибавив к культуре несколько капель раствора Люголя, – цвет среды не изменяется. Нерасщеплённый крахмал даёт с этим раствором синее окрашивание. Протеолитические ферменты у бактерий изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном и на некоторых полиуглеводных средах (например, на среде Клиглера). Показателями глубокого расщепления белка является образование индола, аммиака, сероводорода. Сероводород обнаруживают с помощью полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором ацетата свинца, которую закрепляют между стенкой засеянной пробирки и пробкой (при взаимодействии сероводорода и ацетата свинца бумага чернеет в результате образования сульфида свинца), или на средах, в состав которых входят соли железа или свинца, которые при взаимодействии с сероводородом дают чёрное окрашивание самой среды или выросших колоний (среды Вильсона-Блера, Клиглера и т.д.) Для обнаружения индола по способу Мореля узкие полоски фильтровальной бумаги, смоченные горячим насыщенным раствором щавелевой кислоты и высушенные, помещают между стенкой пробирки с питательным агаром и пробкой. При выделении индола на 2-3-й день нижняя часть полоски бумаги приобретает розовый цвет. Другой, более чувствительный, метод обнаружения индола позволяет концентрировать индол на поверхности среды ксилолом или эфиром, а добавление раствора Ковача (парадиметиламинобензальдегида) приводит к образованию красного кольца. Индол образуется при наличии у бактерий фермента триптофаназы. Наличие аммиака определяют по посинению розовой лакмусовой бумажки, помещённой между стенкой и пробкой засеянной пробирки. Желатиназа. При посеве уколом в желатин некоторые микробы (холерный вибрион, стафилококк, сибиреязвенная палочка и др.) при комнатной температуре (20-22°С) разжижают его, причём различные виды микробов дают характерную для них форму разжижения (послойно, в виде гвоздя, ёлочки и т.д.). Другие протеолитические ферменты: – при посеве на свёрнутую сыворотку вокруг колоний появляются углубления (разжижение); – в молоке происходит расщепление сгустка казеина с образованием пептона, в результате чего оно приобретает желтоватый цвет (пептонизация молока). Наличие уреазы у бактерий определяют на среде с мочевиной и индикатором фенол-рот (начальный цвет среды – жёлтый). При расщеплении мочевины на аммиак и углекислый газ накапливается аммоний, что сдвигает рН в щелочную сторону и изменяет цвет индикатора на красный. Образования ацетоина (ацетил-метил-карбинола) при ферментации глюкозы проводится с помощью реакции Фогес-Проскауэра. Добавление к культуре 40% КОН и 5% альфа-нафтола даёт красное окрашивание, т.е. в щелочных условиях ацетоин образует с альфа-нафтолом соединение красного цвета – ацетилметилкарбинол. Утилизацию цитрата с целью выявления способности бактерий использовать его как источник углерода проверяют на среде Симмонса. Среда содержит набор солей, агар, неорганический источник азота, цитрат натрия, индикатор бромтимоловый синий. При наличии фермента цитрат-пермеазы среда подщелачивается и окрашивается в синий цвет. При отсутствии роста бактерий среда остается зеленой. Каталаза – это фермент, катализирующий реакцию разложения перекиси водорода с образованием воды и кислорода. Каталазу содержат аэробы и факультативные анаэробы, но она отсутствует у облигатных анаэробов. Обнаружить каталазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться сразу же после смешивания микробных клеток с 1% раствором перекиси водорода. На предметное стекло помещают каплю перекиси водорода и суспендируют в ней небольшое количество культуры микроорганизмов, выращенной на плотной среде. Обнаружение цитохромоксидазы у аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов проводится путём нанесения и растирания петли культуры на индикаторную бумажку, пропитанную спиртовым раствором альфа-нафтола и 1% водным раствором ментола. При положительном результате бумажка синеет. Выявление нитратредуктазы характерно в основном для факультативных анаэробов. Фермент восстанавливает нитраты в нитриты. Нитрат является конечным акцептором электронов. В кислой среде нитраты окисляют йодид калия. Выделившийся йод, реагируя с крахмалом, даёт синее окрашивание среды. Тест окисления/ферментации глюкозы (в аэробных/анаэробных условиях) устанавливается на среде Хью-Лейфсона. В среде содержится агар, соли, пептон, глюкоза и индикатор бромтимоловый синий. Посев осуществляют уколом в столбик питательной среды в две пробирки. Для создания анаэробных условий после посева среда в одной из пробирок заливается слоем стерильного вазелинового масла. Посев выращивают 3-4 суток. Образование кислоты из глюкозы изменяет зеленый цвет среды в жёлтый. При окислении глюкозы изменение цвета происходит в верхней части пробирки без вазелинового масла. При ферментации меняется цвет среды под слоем вазелинового масла (в анаэробных условиях). Тест используется для дифференциации аэробных бактерий от анаэробов и факультативных анаэробов. Аэробы (например, Pseudomonas aeruginosa) расщепляют глюкозу в аэробных условиях, то есть только окисляют глюкозу, но не ферментируют её; анаэробы (например, Clostridium perfringens) утилизируют глюкозу только в анаэробных (т.е. ферментируют). Факультативные анаэробы (например, Escherichia coli, Staphylococcus aureus) утилизируют глюкозу в аэробных и анаэробных условиях. Гемолитические свойства микроорганизмов (способность микроорганизмов разрушать эритроциты) изучают при посеве их на среды с кровью. Жидкие среды при разрушении эритроцитов становятся прозрачными, а на плотных средах вокруг колоний появляется прозрачная зона (гемолиз). Кровяной агар Цейсслера (для культивирования анаэробов) состоит из мясо-пептонного агара с 1% глюкозы на 20% свежей дефибринированной крови. Возбудитель газовой гангрены образует зону гемолиза вокруг колоний. Гемолитические штаммы стафилококков и стрептококков дифференцируют на кровяном агаре по наличию альфа- (неполного) или бета- (полного) гемолиза вокруг колонии. В последние годы для изучения биохимической активности выпускаются наборы систем индикаторных бумажных, микротест-системы и другие подобные системы одноразового использования, которые позволяют изучить ферментный профиль микробов. Системы индикаторные бумажные (СИБ) представляют собой наборы бумажных дисков для выявления самых разнообразных ферментов бактерий. Диски пропитаны субстратом (углеводами, аминокислотами, цитратом, ацетатом, малонатом и другими веществами), а также содержат индикатор. Полную петлю исследуемой культуры или каплю густой микробной взвеси вносят в стерильный физиологический раствор (в некоторых случаях в забуференный: рН 5,4-5,6) либо в 1% пептонную воду и помещают в эту пробирку соответствующий диск. В контрольные пробирки культуру бактерий не вносят. Для определения сероводорода диск помещают в пробирку на поверхность МПА, засеянного уколом, что позволяет одновременно определить подвижность. После инкубации в термостате оценивают результаты тестов по изменению цвета среды и диска. Утилизация вещества приводит к изменению цвета индикатора. Во всех пробирках учитывают предварительный результат в тот же день и окончательный – через восемнадцать–двадцать четыре часа. Имеются наборы, которые содержат от десяти до тридцати тест-бумажек. Диагностические микротест-системы (МТС), типа API-20-Е (для энтеробактерий), API-32-Gr+, ID32 GN, Enterotube и другие. Они представляют собой полистироловые пластины с лунками, или планшеты, в которых содержатся стерильные дифференциально-диагностические среды или только субстраты и индикаторы. Стерилизацию МТС проводят ультрафиолетовым облучением. Существует два основных типа таких систем. Это индивидуальные системы, рассчитанные на идентификацию одной культуры. К ним относятся тест-системы ПБДЭ, ПБДС (Россия), системы API (Франция) и многие другие. Второй тип систем основан на использовании многорядных планшетов, позволяющих одновременно проводить идентификацию нескольких культур. К системам этого типа относятся тест-системы фирмы Lachema (Чехия), ММТ Е (Россия), Enterotube II (США) и др. В каждую ячейку засевают взвесь культуры бактерий определённой густоты. В контрольные ячейки наливают физиологический раствор. Инкубация тест-систем проводится в обычных термостатах или в специальных термостатируемых устройствах, входящих в комплект автоматизированных систем, где учёт результатов и их интерпретация осуществляется автоматически с помощью компьютера (Vitek, BioMerieux, Франция). Результат учитывают после 3–4-часовой инкубации в термостате визуально или при использовании автоматизированной компьютерной системы по изменению цвета индикатора. Микротест-системы особенно удобны при массовых бактериологических исследованиях в практических лабораториях.
Санитарная микробиология – раздел медицинской микробиологии, изучающей микрофлору окружающей среды и ее влияние на здоровье человека. Санитарная микробиология разрабатывает методы контроля за состоянием воды, почвы, воздуха, пищевых продуктов и различных предметов обихода. Одновременно санитарная микробиология разрабатывает микробиологические нормативы и мероприятия по оздоровлению окружающей среды. Практическая санитарная микробиология использует 2 основных метода оценки санитарно-эпидемиологического состояния внешней среды: прямое обнаружение патогенных микроорганизмов и выявление косвенных признаков пребывания патогенов во внешней среде. Непосредственное обнаружение патогенных микроорганизмов, как правило, затруднено из-за их малого количества и проводится по эпидпоказаниям. Косвенные методы – это определение общей микробной обсеменённости или общего микробного числа (ОМЧ), а также определение и титрование санитарно-показательных микроорганизмов (СПМ), которые регулярно проводятся контролирующими органами с целью определения безопасности объектов для здоровья населения. ОМЧ расценивается как показатель интенсивности загрязнения окружающей среды органическими веществами. Санитарно-показательными называют микроорганизмы, по которым можно косвенно судить о возможном присутствии патогенов в окружающей среде. Санитарно-показательные микроорганизмы должны удовлетворять следующим характеристикам
Содержание санитарно-показательных микроорганизмов в исследуемых объектах оценивается по их титру и индексу. Методы проведения санитарно-микробиологических исследований (предусматривают определение общей микробной обсеменённости (ОМЧ), определение и титрование санитарно-показательных микроорганизмов). Санитарно-микробиологическое состояние почвы оценивается на основании сопоставления количества термофильных бактерий и бакте- рий – показателей фекального загрязнения. Почвы с преобладанием санитарно-показательных бактерий расцениваются как санитарно-неблагополучные, загрязнённые фекалиями человека или животных. Присутствие в почве E. coli и Enterococcus faecalis указывает на свежее (до 2 недель), бактерий родов Citrobacter и Enterobacter – на несвежее (до 2 месяцев), а Clostridium perfringens – на давнее (более 2 месяцев) фекальное загрязнение. Более точная оценка проводится с помощью определения коли-индекса – количество бактерий группы кишечной палочки (БГКП), обнаруженных в 1 г почвы, перфрингенс-титра – масса почвы (в граммах), в которой обнаружена 1 особь Clostridium perfringens, общего числа сапрофитных, термофильных и нитрифицирующих бактерий в 1 г почвы. Микробиологические нормативы для оценки санитарного состояния почвы: – чистая почва: коли-титр – 1 и выше; перфрингенс-титр – 0,01 и выше; ОМЧ – 100-1000; – загрязнённая почва: коли-титр – 0,9-0,01; перфрингенс-титр – 0,009-0,0001; ОМЧ – 1000-100000; – сильно загрязнённая почва: коли-титр – 0,009 и ниже; перфрингенс-титр – 0,00009 и ниже; ОМЧ – 10000-4000000. Для определения ОМЧ почву берут на глубине 10-15 см стерильным ножом (из разных мест не менее 10 проб) в стерильную банку. Из проб готовят навеску 30 г, которую вносят в колбу с водой (270 мл) и тщательно встряхивают. Готовят разведения 10-3, 10-4, 10-5. Из 2-х последних разведений 0,1 мл смешивают с 40 мл 0,7% расплавленного и остуженного до 450С МПА, после чего выливают двойным слоем в чашки с 2% агаром. Инкубируют в термостате. Подсчитывают количество выросших колоний. Для определения коли-титра, перфрингенс-титра различные разведения почвенной суспензии засевают по 1 мл в пробирки со средой Кесслера. Инкубируют при 430С 48 часов. При получении в средах газообразования и помутнения производят высев петлей на среду Эндо. Отбирают типичные для кишечной палочки колонии, делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют. При выявлении в мазках грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазу. Если проба отрицательная, проверяют ферментативные свойства выделенной культуры посевом на полужидкую среду с глюкозой. Появление в среде кислоты и газа подтверждает наличие E. coli. Определяют коли-титр по наименьшему объёму, в котором обнаруживают БГКП. Для определения перфрингенс-титра различные разведения почвенной суспензии засевают в пробирки со стерильной железосульфитной средой Вильсон-Блера. После 48 часов инкубации при 430С учитывают результаты по образованию черных колоний C. perfringens в агаровом столбике среды. Мазки окрашивают по Граму, микроскопируют (крупные грамположительные палочки со спорами овальной формы, центрального или субтерминального расположения), вычисляют перфрингенс-титр (наибольшее разведение посевного материала, посев которого приводит к почернению и разрыву среды в первые 12 часов роста при 430С). Санитарно-микробиологическое состояние питьевой воды оценивается по общему микробному числу (ОМЧ) – количеству мезофильных факультативно-анаэробных микроорганизмов (МЕФАМ) в 1 мл воды; присутствию общих и термотолерантных колиформных бактерий. По эпидемиологическим показаниям, в воде дополнительно определяют наличие энтерококков, сальмонелл, шигелл, вибрионов, энтеровирусов. Определение общего числа микроорганизмов Общее микробное число (ОМЧ) - общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов, способных образовывать колонии на питательном агаре при t=370С в течение 24 часов, видимые с увеличением в 2 раза. Из каждой пробы воды делают посев не менее двух объёмов по 1 мл. Для этого 1 мл воды вносят в стерильную чашку Петри, заливают 6-8 мл расплавленного и остуженного до 45-460С питательного агара, тщательно перемешивают. После застывания агара чашки помещают вверх дном и инкубируют при 370С в течение 24 часов. Затем подсчитывают все выросшие на чашке колонии, наблюдаемые при увеличении в 2 раза. Подсчитанное количество колоний на каждой чашке суммируют и делят на 2. Результат выражают в КОЕ (колониеобразующих единиц) в 1 мл исследованной пробы воды. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий К общим колиформным бактериям относятся грамотрицательные, не образующие споры палочки, не обладающие оксидазной активностью ферментирующие лактозу или маннит с образованием альдегида, кислоты и газа при 370С в течение 24 часов. Термотолерантные колиформные бактерии обладают всеми признаками общих колиформных бактерий, но, кроме того, способны ферментировать лактозу до кислоты и газа при 440С в течение 24 часов. Микробиологические и паразитологические показатели питьевой воды (согласно СанПиНу 2.1.4.559–96)
Примечания: 1 – при определении проводится 2-кратное исследование по 100 мл отобранной пробы воды; 2 – превышение норматива не допускается в 95% проб, отбираемых в точках водоразбора наружной и внутренней водопроводной сети в течение 12 месяцев, при количестве исследуемых проб не менее 100 за год; 3 – определение проводится только в системах водоснабжения из поверхностных источников перед подачей воды в распределительную сеть; 4 – определение проводится только при оценке эффективности технологии обработки воды. Метод мембранных фильтров Мембранный фильтр помещают в воронку Зейтца, вмонтированную в колбу Бунзена, которая присоединяется к вакуумному насосу. Воду фильтруют в объёме 333 мл. Затем фильтры Зейтца помещают на поверхность среды Эндо в чашки Петри и после инкубации при 370С в течение суток подсчитывают количество выросших колоний, типичных для БГКП. Из 2-3 колоний красного цвета готовят мазки, окрашивают по Граму и ставят оксидазный тест, позволяющий дифференцировать бактерии родов Escherichia, Citrobacter и Enterobacter от грамотрицательных бактерий семейства Pseudomonadaceae и других оксидазоположительных бактерий, обитающих в воде. Для этого фильтр с выросшими на нём колониями бактерий переносят пинцетом, не переворачивая, на кружок фильтровальной бумаги, смоченной диметил-n-фенилендиамином. При наличии оксидазы индикатор окрашивает колонию в синий цвет. 2-3 колонии, не изменившие первоначальную окраску, засевают в полужидкую среду с 0,5% раствором глюкозы. Посевы инкубируют в течение суток при 370С. При наличии газообразования подсчитывают число красных колоний на фильтре. Бродильный метод Засевают 3 объёма воды по 100 мл (для качественного анализа) или при исследовании воды с целью количественного определения общих колиформных бактерий делают посев 3 объёмов по 100 мл, 3 – по 10 мл и 3 – по 1 мл. Посев 100 мл и 10 мл воды производят в 10 и 1 мл концентрированной лактозо-пептонной среды, посев 1 мл воды – в 10 мл среды обычной концентрации. Посевы инкубируют при 370C в течение 24-48 часов. Через 24 часа из питательной среды, где отмечено наличие роста и образование газа, делают высев по секторам на среду Эндо, приготовленную с добавлением фуксина. Положительный результат на присутствие общих колиформных бактерий в данном объёме воды дают по помутнению и образованию газа на среде накопления (глюкозо-пептонная среда или лактозо-пептонная среда) и наличию красных колоний на среде Эндо. В сомнительных случаях выполняют оксидазный тест и подтверждают способность к газообразованию на среде с лактозой или маннитом (глюкозой). Результат отрицательный, если – в среде накопления нет признаков роста, – на секторах среды Эндо нет роста лактозоположительных колоний, – на секторах среды Эндо выросли нехарактерные для колиформных бактерий колонии, – все колонии оказались оксидазоположительными, – если в подтверждающем тесте на среде с лактозой или маннитом (глюкозой) не отмечено газообразования. Наиболее вероятное число (НВЧ) бактерий (общих и термотолерантных колиформных бактерий) – вычисляют по специальным таблицам. Санитарно-микробиологическое состояние воздуха закрытых помещений оценивают по общему микробному числу (ОМЧ) – количеству особей, обнаруживаемых в 1 м3 воздуха, наличию санитарно-показательных бактерий: гемолитических стрептококков, золотистых стафилококков, а также дрожжевых и плесневых грибов. Согласно СанПиН 2.1.3.1375-03, воздушная среда помещений лечебных учреждений и аптек по уровню бактериальной обсемененности разделена на 4 класса. Микробиологические показатели для оценки воздушной среды аптечных учреждений можно определить путем посева воздуха седиментационным (по Коху) или аспирационным методом (в аппарате Кротова). Допустимые уровни бактериальной обсеменённости воздушной среды помещений лечебных учреждений в зависимости от их функционального назначения и класса чистоты
Седиментационный метод (по Коху) – оседание микробов под действием силы тяжести - является простым способом изучения микрофлоры воздуха. Он заключается в том, что чашки Петри со средой оставляют открытыми на определённое время (5-10 минут на общую обсеменённость и не менее 40 минут на кокковую микрофлору), затем их закрывают, маркируют и выдерживают 24 часа в термостате и 24 часа при комнатной температуре. Количество выросших колоний соответствует степени загрязнённости воздуха: по приблизительному подсчёту на площадь 100 см2 в течение 5 минут оседает столько микробов, сколько их содержится в 10 л воздуха. Аспирационный метод – более точный количественный метод определения микробного числа воздуха. Посев воздуха осуществляется с помощью приборов. Аппарат Кротова устроен таким образом, что воздух с заданной скоростью просасывается через узкую щель плексигласовой пластины, закрывающей чашку Петри с питательным агаром. При этом частицы аэрозоля с содержащимися на них микроорганизмами равномерно фиксируются на всей поверхности среды благодаря постоянному вращению чашки под входной щелью. После инкубации посева в термостате проводят расчет микробного числа по формуле:
где N – количество выросших на чашке колоний; V – объём пропущенного через прибор воздуха, дм3; 1000 - искомый объём воздуха, дм3. Наличие санитарно-показательных для воздуха микроорганизмов – золотистого стафилококка, гемолитического стрептококка, плесневых грибов, кандид – определяют по характеру выросших колоний на специальных средах (желточно-солевом агаре, кровяном агаре, среде Сабуро) и при микроскопическом изучении бактерий из этих колоний. Контрольные вопросыКаковы особенности ферментных систем бактерий? Как регулируется продукция ферментов у бактерий? Какие группы ферментов различают в зависимости от механизма, которым регулируется продукция фермента? Какое практическое значение имеет изучение ферментативной активности бактерий? Методы изучения сахаролитической и протеолитической активности бактерий. Дифференциально-диагностические среды: перечислите, назовите основные составные части и применение. На какое изменение среды реагирует индикатор в этих средах? По какому признаку дифференцируются бактерии на средах Эндо, Левина, Плоскирева? Каким свойством должны обладать бактерии, чтобы образовать на этих средах окрашенные колонии? Если бактерии образуют бесцветные колонии, что это означает? Среды Гисса их состав и применение. Что такое «пёстрый» или «цветной» ряд? Среда Олькеницкого, её состав; как производится посев и как отмечают на этой среде ферментацию разных углеводов, образование сероводорода? Что представляют собой микротест-системы для определения ферментативной активности микробов; как производят посев и как учитывают результаты? Что такое СИБ; как используется эта система, как производится посев и учёт результатов? Укажите основные объекты внешней среды, которые подвергаются санитарно-бактериологическому исследованию. Микробиоценоз, определение понятия. Перечислите и дайте характеристику межвидовых взаимоотношений в микробиоценозах. Какие показатели определяются при бактериологической оценке объектов внешней среды? Санитарно-показательные микроорганизмы: определение понятия. Какими свойствами должны обладать санитарно-показательные микроорганизмы? Перечислите санитарно-показательные микроорганизмы для воздуха, воды, почвы. Микрофлора воды: постоянная микрофлора, источники загрязнения. Показатели для санитарно-бактериологической оценки воды. Методика определения общего микробного числа воды. Показатели фекального загрязнения воды, методы их определения. Укажите предельно допустимые показатели для питьевой воды. Микрофлора воздуха: постоянная микрофлора, источники загрязнения. Показатели для санитарно-бактериологической оценки воздуха, методы их определения. Микрофлора почвы: постоянная микрофлора, её значение для круговорота веществ в природе. Источники загрязнения почвы патогенными микроорганизмами. Показатели для санитарно-бактериологической оценки. Для каких заболеваний факторами передачи могут быть вода, воздух, почва? Некультивируемые формы бактерий: определение понятия, практическое значение. Задания для выполнения в процессе самоподготовкиВыпишите названия (по-латыни) видов санитарно-показательных микроорганизмов для воды, воздуха и почвы. Работа студента на практическом занятии1. Выделение чистой культуры бактерий–аэробов (3-й день). Изучите культуру на скошенном агаре макроскопически, приготовьте мазок, окрасьте по Граму, микроскопируйте, зарисуйте, сделайте вывод о чистоте культуры. Для дальнейшей идентификации выделенной культуры произведите посев на среды «пёстрого» ряда и на среду Олькеницкого. Изучите готовые посевы аэробных бактерий на средах «пёстрого» ряда и на среде Олькеницкого, составьте таблицу «Биохимическая активность микроорганизмов». Ознакомьтесь с методикой изучения ферментативной активности бактерий с помощью микротест-систем и СИБ. 2. Выделение чистой культуры анаэробов (4–й день). Изучите характер роста культуры на среде Китта–Тароцци, приготовьте мазок, окрасьте по Граму, микроскопируйте, зарисуйте. 3. Исследование микрофлоры воды и воздуха. Произведите посев водопроводной воды для определения общего микробного числа (ОМЧ). Определите показатели фекального загрязнения воды (наличие колиформных бактерий) по демонстрационным посевам и по таблице. Произведите посев воздуха лаборатории седиментационным методом и с помощью аппарата Кротова. 4. Методы изучения нормальной микрофлоры организма человека (подготовка к следующему занятию). Возьмите стерильным тампоном слизь из зева друг у друга и сделайте посев в пробирку с сахарным мясо-пептонным бульоном. Сделайте посев с кожи рук на чашку с МПА: возьмите маленький стерильный ватный тампон, смочите его в стерильном физиологическом растворе, протрите кожу, сделайте посев этим тампоном. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||