|
|
Учебно-методическое пособие. Учебнометодическое пособие для самоподготовки и самостоятельной работы студентов лечебного факультета по микробиологии, вирусологии
ЗАНЯТИЕ 6 ФИЗИОЛОГИЯ МИКРОБОВ. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ.
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ БАКТЕРИЙ АЭРОБОВ И АНАЭРОБОВ.
МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР БАКТЕРИЙ
На предыдущих занятиях вы познакомились с морфологией и тинкториальными свойствами микроорганизмов. Изучение этих свойств необходимо, но, как правило, недостаточно для идентификации возбудителя, то есть определения вида микроба. Поэтому на практике наряду с микроскопическим методом применяется микробиологический метод – культивирование, выделение чистой культуры возбудителя и изучение его физиологических свойств.
Цель самоподготовки
После самостоятельного изучения темы студент должен знать:
- химический состав бактериальной клетки; типы, механизм питания, питательные среды, их состав и назначение;
- типы биологического окисления у микроорганизмов;
- методы культивирования и выделения чистой культуры аэробов и анаэробов;
Исходный уровень знаний
Для усвоения материала необходимо знать:
- основные группы веществ: белки, жиры, углеводы, нуклеиновые кислоты, минеральные вещества, их функции;
- из курса биохимии вспомнить механизмы биологического окисления, окислительно-восстановительный потенциал;
- приготовление мазка, окраска по Граму в модификации Синёва.
Цель занятия
Уяснить особенности метаболизма микроорганизмов, принципы их культивирования в лабораторных условиях.
Изучить наборы питательных сред. Классифицировать среды по происхождению, консистенции, составу, назначению.
Познакомиться с характером роста бактерий на жидких и плотных питательных средах, с различными типами колоний.
Освоить технику посева для выделения чистых культур бактерий.
План изучения темы
1. Химический состав бактериальной клетки.
2. Механизмы и типы питания бактерий.
3. Питательные среды, требования к ним, классификация.
4. Рост и размножение микробов.
5. Биологическое окисление у бактерий. Биологическое окисление у микроорганизмов обязательно изучить, в основном, по конспекту лекций, выделение чистых культур - по практическому руководству.
6. Методы выделения чистых культур бактерий - аэробов и анаэробов.
После изучения темы студент должен уметь
Владеть техникой посева бактерий на жидкие и плотные среды.
Охарактеризовать предложенные питательные среды, применяемые в микробиологической практике.
Дополнительный материал к занятию
Питательные среды
По происхождению среды подразделяют на естественные, искусственные и синтетические. К естественным питательным средам относятся натуральные продукты животного или растительного происхождения – молоко, яйца, овощи, животные ткани, желчь, сыворотка крови. Искусственные среды готовятся по определённым рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и азотистых веществ. Синтетические среды содержат определённые химические соединения в точно указанных концентрациях.
По составу среды делятся на простые и сложные. К простым средам относятся такие, как мясо-пептонный агар (МПА), мясо-пептонный бульон (МПБ). Сложные среды в своём составе содержат различные дополнительные компоненты, необходимые для роста микроорганизмов.
По консистенции среды подразделяют на жидкие, полужидкие, плотные, сыпучие. Жидкие среды чаще применяют для изучения физико-биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы и продуктов обмена в микробиологической промышленности. Полужидкие среды обычно используют для длительного хранения культур. Они содержат в своём составе 0,5-0,7% агар-агара, который в настоящее время используют в качестве уплотнителей для питательных сред. Агар-агар представляет собой полисахарид, выделенный из морских водорослей. Он способен образовывать в воде гель, плавящийся при 1000С и уплотняющийся при 450С и ниже. Большинство микроорганизмов не используют его в качестве питательного субстрата. Плотные среды, содержащие 1,5-2% агар-агара, применяются для выделения чистых культур микроорганизмов, изучения морфологии колоний, количественного учёта, определения антагонистических свойств и других целей. Сыпучие среды используют для хранения посевного материала, культур-продуцентов в микробиологической и медицинской промышленности. К ним относят разваренное пшено, кварцевый песок, пропитанный питательным раствором.
Питательные среды по целевому назначению могут быть разделены на основные, специальные, элективные и дифференциально-диагностические. Основные питательные среды: мясо-пептонный бульон и мясо-пептонный агар. Специальные питательные среды применяются для выращивания тех микробов, которые не могут расти на основных средах. Например, кровяной агар и сахарный бульон для стрептококка, сывороточный агар для менингококка и гонококка. Элективные питательные среды применяются для выделения одного какого-либо вида микроорганизма из смеси различных бактерий. Данный вид бактерий растёт на этой среде быстрее и лучше других, опережая их в своем росте; а рост других бактерий задерживается. Например, свёрнутая сыворотка для палочки дифтерии, щелочная пептонная вода для холерного вибриона, желчный бульон для палочек брюшного тифа, солевые среды для стафилококка. Дифференциально-диагностические питательные среды применяются для отличия одних видов бактерий от других на основании их биохимических свойств. В этих средах в качестве основы применяют разнообразные органические и неорганические соединения: питательный бульон или 1% пептонную воду. К ним добавляют углеводы, спирты, мочевину и другие вещества; при расщеплении которых происходит сдвиг рН в кислую (углеводы, спирты, липиды) или щелочную (белки) сторону, что изменяет цвет индикатора, также входящего в состав среды.
Дифференциально-диагностические среды делят на 4 основные группы:
Среды, содержащие белки, дающие характерные изменения под действием бактериальных ферментов и токсинов (кровь, желатин, молоко и др.); их применяют для определения гемолитических или протеолитических свойств: кровяной агар (КА), среда с желатином, молоко, желточно-солевой агар (ЖСА).
Среды, содержащие углеводы или многоатомные спирты и индикаторы: ферментативное расщепление субстрата приводит к сдвигу рН и изменению окраски индикатора. Например, среда Эндо, среда Левина, среда Плоскирева, среды Гисса, среда Олькеницкого.
Среды для дифференциации микробов по редуцирующей способности. В эту группу входят среды с красителями, обесцвечивающимися при восстановлении, а также среды с нитратами для определения денитрифицирующей активности бактерий.
Среды, включающие вещества, ассимилируемые только определённой группой бактерий. Наиболее распространёнными средами данной группы являются цитратный агар Симмонса и цитратная среда Козера.
Подробнее эти среды описаны в дополнительном материале к занятию 9 (тема: «Ферменты бактерий»).
Методы выделения чистых культур бактерий
Используют бактериологический, биологический (заражение лабораторного животного), био-бактериологический методы.
Сущность бактериологического (культурального) метода состоит в посеве исследуемого материала с использованием методов механического разобщения микробов, чтобы получить рост в виде изолированных колоний.
Методы разобщения микроорганизмов основаны на:
1) механическом разобщении бактериальных клеток на поверхности плотных питательных сред шпателем (по Дригальскому), или рассеву штрихами калиброванной петлей (по Гольду), или тампоном, после забора им исследуемого материала;
2) фильтрации исследуемого материала перед посевом (материал пропускают через специальные фильтры с определённым диаметром пор и разделяют содержащиеся в нем микроорганизмы по величине). Этот метод применяют, например, для очистки вирусов от бактерий, а также при получении бактериофагов и токсинов (в фильтрате остается фаг, или очищенный токсин, тогда как на фильтре остаются бактериальные клетки);
3) предварительном разведении в жидкой среде посевного материала с последующим высевом определённой посевной дозы на чашки с агаризованной питательной средой (метод пластинчатых разводок по Коху);
4) биологических свойствах микроорганизма, культуру которого необходимо выделить из исследуемого материала:
а) для получения культур психрофильных бактерий посевы инкубируют при низких температурах для избирательного подавления размножения сопутствующей микрофлоры;
б) метод Шукевича, используемый для выделения культуры бактерий, характеризующихся «ползучим» ростом (протеи);
в) для выделения спорообразующих бактерий прогревают посевной материал на водяной бане при 800С 10-15 мин, перед высевом. При этом погибают вегетативные формы, а споры в таких условиях сохраняются и при посеве на соответствующую питательную среду прорастают;
г) метод ингибирования основан на различном действии некоторых химических веществ и антибиотиков, которые добавляют в питательную среду с целью задержки роста сопутствующих микроорганизмов. Эффект ингибирования учитывается при создании элективных питательных сред. С этой же целью может быть использована предварительная обработка исследуемого материала химическими веществами перед посевом. Например, обработка материала перед посевом серной кислотой (5% раствор) быстро убивает большинство микроорганизмов, кроме кислотоустойчивых, которые выживают в этих условиях.
Биологический метод основан на способности некоторых бактерий быстро размножаться в организме чувствительных к ним лабораторных животных (биопроба) или растений. Для заражения подбирают наиболее восприимчивые к предполагаемому возбудителю инфекции виды животных или виды растений. После появления у заражённых организмов признаков болезни их убивают. Органы исследуют гистологически, микроскопически для обнаружения в них возбудителя. В некоторых случаях производят посев органов и тканей на питательные среды с целью выделения чистой культуры возбудителя (био-бактериологический метод).
Техника посева микроорганизмов на питательные среды
Посев уколом осуществляется уколом микробиологической петлёй или иглой в столбик плотной или полужидкой питательной среды. Применяется для выращивания анаэробов, для выявления характера роста по ходу укола и для определения газообразования. У подвижных и неподвижных микроорганизмов характер роста будет различным. Посев уколом практикуют также для длительного хранения культур.
Посев петлей (посев штрихами) по методу Гольда. На внешней стороне дна чашки Петри с питательным агаром проводят разграничительные линии, разделяющие её на 4 сектора. Исследуемый материал вносят петлёй в первый сектор и проводят ею параллельные линии по всему сектору на расстоянии одна от другой около 5 мм. Этой же петлёй, не изменяя её положения по отношению к агару, проводят такие же линии на других секторах чашки. В том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост микроорганизмов будет в виде сплошного штриха. На секторах с небольшим количеством клеток микроорганизмы вырастают в виде отдельных колоний.
Посев шпателем по методу Дригальского. Используют 3 чашки Петри с питательной средой. На 1-ю чашку петлёй или пипеткой наносят каплю исследуемого материала и растирают стерильным шпателем по всей поверхности питательного агара. Затем шпатель, не обеззараживая, переносят во 2-ю чашку и втирают оставшиеся на нём микроорганизмы в поверхность питательной среды. Далее шпатель переносят в 3-ю чашку и аналогичным образом производят посев. На 1-й чашке вырастает максимальное количество колоний, на 3-й – минимальное. В зависимости от содержания микробных клеток в исследуемом материале на третьей или на второй и третьей чашках вырастают отдельные колонии, пригодные для выделения чистой культуры.
Посев по методу Шукевича. Исследуемый материал засевают в конденсационную воду свежескошенного агара. При размножении подвижные формы микробов из конденсационной воды распространяются по агару, как бы «вползают» на его поверхность. Отсевая материал из верхнего края роста культуры в конденсационную воду свежескошенного агара и повторяя это несколько раз, можно выделить чистую культуру.
Приборы, методы и среды для культивирования анаэробов
Микроанаэростат – используется для создания вакуума с дозированным содержанием кислорода. Прибор представляет собой герметически закрывающийся сосуд, снабжённый манометром, в который помещают посевы и откачивают воздух. Микроанаэростат помещают в термостат.
Эксикатор – стеклянный лабораторный сосуд с притёртой крышкой. В его донной части имеется дополнительная емкость, куда наливается смесь пирогаллола и едкого натра или гидросульфита натрия и двууглекислой соды. На сетку-подставку помещают посевы и притирают крышку с помощью вазелина. Эксикатор помещают в термостат.
Метод Фортнера. В чашку Петри наливают питательный агар с
1-2% глюкозы. Посредине чашки стерильным скальпелем вырезают канавку шириной приблизительно 1 см. Одну половину чашки засевают культурой аэробов (сарцина, кишечная палочка), вторую – культурой анаэробов или исследуемым на их наличие материалом. Засеянную чашку закрывают, герметизируют и помещают вверх дном в термостат. Быстрорастущие аэробы, поглощая кислород, создают тем самым благоприятные условия для роста анаэробных микроорганизмов.
Метод Перетца. В стерильную чашку Петри помещают стеклянные палочки, на которые кладут стеклянные пластинки или предметные стекла. В пробирку с 20 мл расплавленного и охлажденного до 500С МПА с 10% глюкозы (pH 7,0-7,2) вносят исследуемый материал и добавляют 2-4 капли 10% гидросульфита натрия на 10% растворе углекислой соды. Содержимое пробирки быстро перемешивают и выливают в чашку с таким расчётом, чтобы агар заполнил пространство между стеклянной пластинкой и дном чашки. Чашки инкубируют при 370С 24-48 часов. Колонии анаэробов вырастают под стеклянной пластинкой.
Метод Вейон-Виньяля. В пробирку с 0,5% расплавленным и охлажденным до 40-450С сахарным агаром вносят исследуемый материал и перемешивают. При необходимости материал разводят путём переноса в последующие 2-3 пробирки с расплавленным агаром. Содержимое пробирок набирают в пастеровские пипетки. После заполнения пипетки вытянутый конец запаивают, а противоположный конец закрывают стерильной ваткой и заливают парафином. Трубки помещают в термостат; через 2-3 суток в агаре вырастают глубинные колонии, видимые в проходящем свете, которые можно изолировать. Для этого трубку надрезают напильником выше уровня намеченной колонии, надламывают, а колонию извлекают петлёй и пересевают для накопления чистой культуры в соответствующую питательную среду.
Метод Биттнера. К крышке чашки Петри с посевом исследуемого материала или выделенной культуры анаэробов прикрепляют пакет из фильтровальной бумаги, содержащей пирогаллол, К2СО3 и тальк. Чашку герметизируют при помощи парафина или скотча. Содержимое пакета увлажняется за счёт образующегося конденсата, и ингредиенты вступают в реакцию, которая сопровождается поглощением О2 и выделением СО2.
Газ-пак (Generbag anaer). Система Generbag anaer состоит из воздухонепроницаемых пакетов, изготовленных из прозрачной пластмассы и генераторов, содержащих смесь веществ, поглощающих кислород. Последовательность работы: вынуть генератор из пакета, поместить в нижнюю часть воздухонепроницаемого пакета, затем поместить чашки (или пробирки) с посевами и с помощью специальной скрепки закрыть пакет. Инкубация при 370С.
Среда Китта-Тароцци. Содержит мясо-пептонный бульон, 0,5% глюкозы и 0,15% агара. На дно пробирки для адсорбции О2 помещают кусочки варёной печени или фарша слоем 1-1,5 см и заливают 6-7 мл среды. Среду перед посевом регенерируют (прогревают 15-20 мин. на водяной бане для удаления воздуха, а затем быстро охлаждают). После посева среду заливают вазелиновым маслом и помещают в термостат.
Полужидкий сахарный агар (высокий столбик). В пробирку с
6-7 мл расплавленного и охлаждённого до 40-450С полужидкого питательного агара, содержащего 0,5-1% глюкозы, вносят исследуемый материал и перемешивают. Посевы помещают в термостат.
Среда для контроля стерильности (СКС). Рост многих анаэробных микроорганизмов возможен только на средах с низким окислительно-восстановительным потенциалом. Поэтому в среды добавляют восстановители, например, тиогликолевую кислоту или её натриевую соль, цистеин, аскорбиновую кислоту. Функции восстановителей выполняют и другие компоненты среды: глюкоза, пептон. СКС содержит питательный бульон, витаминный препарат ЭКД, NaCl, Na2CO3, глюкозу, тиогликолят натрия, цистеин, агар (0,75%). Среду разливают в пробирки по 6-7 мл.
Контрольные вопросы
Химический состав бактериальной клетки: содержание, локализация в клеточных структурах и биологическая роль воды, белков, нуклеиновых кислот, липидов, углеводов и минеральных веществ. Источники азота, углерода. Факторы роста. Что такое энергетический и конструктивный метаболизм? Особенности обмена веществ бактерий. Ферменты бактерий. Механизм расщепления веществ. Способы поступления их в клетку. Типы питания микробов. Могут ли микроорганизмы изменить тип питания? Каковы типы питания патогенных микробов? Каким требованиям должны соответствовать питательные среды? Классификация питательных сред по консистенции, по целевому назначению. Основные питательные среды. Специальные питательные среды, их названия; для каких бактерий предназначены? Элективные питательные среды, состав, применение. Приведите примеры. Дифференциально-диагностические среды, их названия; для чего применяются? Что такое рост микробов, размножение микробов? Как размножаются бактерии? Фазы роста бактериальной культуры в жидкой питательной среде (начертить кривую). Размножение бактерий в непрерывно–проточной среде. Условия культивирования бактерий. Что такое культура бактерий, чистая культура, штамм? Особенности биологического окисления у микробов. Группы микробов по типу биологического окисления. Каковы различия между аэробным и анаэробным типом (основные этапы, ферменты, участие свободного кислорода, конечный акцептор водорода, продукты окисления). Перечислите патогенные анаэробы. Что такое окислительно-восстановительный потенциал среды, какие микробы лучше растут при низких его значениях, какие - при более высоких? Типы брожения. Что такое аэрация питательной среды, как она осуществляется? Особенности культивирования анаэробных бактерий. Среды, методы и приборы, используемые для их культивирования. Среда Китта-Тароцци: на чём основано её действие, что входит в её состав, что делают со средой перед посевом и для чего? Рассказать поэтапно выделение чистой культуры микробов-аэробов. Рассказать поэтапно выделение чистой культуры микробов–анаэробов. Что такое психрофилы, мезофилы, термофилы? Оптимальная температура для роста патогенных микробов.
В тетради перепишите схемы выделения чистых культур аэробов и анаэробов и впишите цель посева на каждом этапе.
Заполните таблицу «Культивирование анаэробов».
№
|
Способ
культивирования
|
Сущность
способа
|
Используемые
|
приборы
|
методы
|
среды
|
1.
|
Физический
|
|
|
|
|
2.
|
Химический
|
|
|
|
|
3.
|
Биологический
|
|
|
|
|
4.
|
Комбинированный
|
|
|
|
| Работа студента на практическом занятии
1. Ознакомление с питательными средами. Изучите питательные среды и распределите их по назначению: основные, специальные, элективные, дифференциально-диагностические.
2. Методы посева бактериальных культур с соблюдением правил асептики. Ознакомьтесь с особенностями техники пересева бактериальных культур на плотные и на жидкие питательные среды.
3. Выделение чистой культуры бактерий–аэробов. Ознакомьтесь с методом получения изолированных колоний путем посева на чашке с питательной средой (демонстрация преподавателем). Из смеси бактерий приготовьте мазок, окрасьте по Граму, микроскопируйте, зарисуйте. Произведите посев смеси бактерий на чашку с питательной средой, укажите цель посева.
4. Методы культивирования и выделения чистых культур анаэробов. Ознакомьтесь с аппаратурой для культивирования анаэробов. Из посева на среде Китта–Тароцци приготовьте мазок, окрасьте по Граму, микроскопируйте, зарисуйте. Внимательно проследите за демонстрацией преподавателем посева по методу Вейнберга в трубки Вейон-Виньяля.
|
|
|
Скачать 1.36 Mb.