|
Учебно-методическое пособие. Учебнометодическое пособие для самоподготовки и самостоятельной работы студентов лечебного факультета по микробиологии, вирусологии
ЗАНЯТИЕ 32 МОРФОЛОГИЯ И ФИЗИОЛОГИЯ ВИРУСОВ. МЕТОДЫ
КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСОВ.
ВОЗБУДИТЕЛИ ГРИППА
Вирусные заболевания занимают доминирующее положение в ин-
фекционной патологии человека и, по-видимому, являются одной из причин возникновения опухолей. В последние годы описано несколько новых, ранее неизвестных нозологических форм вирусных инфекций, в том числе и такое грозное заболевание, как ВИЧ-инфекция. Поэтому вирусология в настоящее время является одним из наиболее развивающихся и имеющих практическое значение разделов медицинской микробиологии и медицины. Отсюда, для современного врача любой специальности необходимо знать биологические особенности вирусов, методы их культивирования, механизмы взаимодействия с клетками, а также методы микробиологической диагностики вирусных инфекций, которые имеют существенные особенности. Отличительной особенностью вирусов является их абсолютный паразитизм и убиквитарность: они способны поражать животные, растительные организмы и микроорганизмы.
Наиболее распространёнными вирусными инфекциями являются острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) - грипп и острые рес-
пираторные заболевания (ОРЗ), которые могут за короткое время поражать большие контингенты людей. Среди них на первом месте по масштабу вызываемых вспышек и по тому ущербу, который наносится здоровью человека и экономике, стоят вирусы гриппа.
Цель самоподготовки
После самостоятельного изучения темы студенты должны знать: положение вирусов в системе живых организмов; особенности вирусов, присущие только им; строение вириона (схемы строения, типы симметрии); современную классификацию вирусов и её принципы; этапы взаимодействия вирусов с чувствительными клетками; методы культивирования вирусов, признаки репликации вирусов в клетке.
Исходный уровень знаний
Для усвоения материала темы необходимо знать структуру и функции нуклеиновых кислот, биосинтез белков (биохимия), строение клеток культуры тканей, строение куриного эмбриона (гистология), структуру, свойства и взаимодействие с клетками бактериофагов (микробиология).
Цель занятия
1. Изучить строение и культивирование вирусов.
2. Изучить принципы обнаружения и идентификации вирусов.
3. Показать разнообразие возбудителей острых респираторных вирусных инфекций.
4. Изучить строение, антигенные свойства вируса гриппа.
5. Освоить принципы лабораторной диагностики гриппа.
6. Научить классифицировать препараты для диагностики, лечения и профилактики гриппа.
План изучения темы
1. Морфология, физиология и классификация вирусов.
2. Методы культивирования вирусов.
3. Методы обнаружения и идентификации вирусов.
4. Характеристика возбудителей гриппа.
5. Методы диагностики гриппа; лечение и специфическая профилактика гриппа.
После изучения темы студент должен уметь
1. Исследовать в реакции гемагглютинации (РГА) полученную из заражённых куриных эмбрионов аллантоисную жидкость на присутствие вируса гриппа.
2. Учесть результаты идентификации выделенного вируса гриппа в реакции торможения гемагглютинации (РТГА).
Дополнительный материал к занятию
Методы культивирования вирусов
Для культивирования вирусов используют следующие методы:
1) заражение животных (внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, интраназально, заражение в мозг и другие);
2) на куриных эмбрионах после заражения их на хорион-аллантоисную оболочку, в аллантоисную полость, в амниотическую полость, в желточный мешок;
3) на культуре клеток различных тканей.
Культура ткани - это клетки ткани, выращенные вне организма на специальной питательной среде. Клетки ткани в искусственных условиях сохраняют присущий им обмен веществ и восприимчивость к определённым вирусам. Наиболее пригодными для культивирования вирусов являются клетки с быстрым ростом и высоким уровнем обмена веществ. По этой причине широко применяют эмбриональные ткани (фибробласты куриных эмбрионов, клетки амниона человека и др.), а также культуры тканей опухолей. Выращивание клеток культур тканей производят в специальных флаконах (колбы-матрацы, флаконы Карреля и др.) и в пробирках. Культура клеток для роста должна иметь какую-либо опору, например, пластинки стекла, стенку пробирки. В выросшую культуру ткани, которая покрывает стенку сосуда или пластинку стекла в виде однослойного клеточного пласта, засевают материал, содержащий вирус. Работу производят в стерильных условиях. Для подавления роста другой микрофлоры (кроме вирусов) вируссодержащий материал предварительно обрабатывают антибиотиками, чаще пенициллином и стрептомицином. Размножение вируса в клетках определяют по цитопатическому действию (ЦПД): в результате размножения вируса в клетках при микроскопии обнаруживаются включения, дегенеративные изменения и в конечном итоге клетки гибнут. Так как рост клеток прекращается, рН среды мало изменяется по сравнению с контролем (клетки без вируса). В связи с этим не изменяется и цвет среды. Питательной средой для культуры тканей могут быть различные растворы, состав которых приближается к составу жидкостей организма (синтетическая среда 199, солевой раствор Хенкса с сывороткой, гидролизат лактальбумина с сывороткой и другие). В настоящее время в вирусологической практике чаще всего применяют свежие культуры клеток (первичные или первично-трипсинизированные) и перевиваемые культуры (линии) клеток.
Первично-трипсинизированные культуры клеток готовят из органов взрослых животных (чаще из почек обезьян и других животных) и эмбрионов человека, куриных фибробластов путём трипсинизации кусочков тканей с последующим культивированием клеток в питательной среде. С этой целью кусочки тканей измельчают ножницами (или другим способом), а затем промывают буферным раствором Хенкса для удаления клеток крови и обрабатывают 0,25-0,3% раствором трипсина. Трипсин разрушает межклеточные мостики и разъединяет клетки. С помощью камеры Горяева подсчитывают количество клеток, разводят до концентрации 400000 клеток в 1 мл. Полученную взвесь клеток разливают в пробирки, плотно закрывают стерильными резиновыми пробками и помещают в термостат при 370С в почти горизонтальном положении (под углом 50) в специальных штативах. Через 3-4 дня на стенке пробирки образуется сплошной слой размножившихся клеток. Пробирки с хорошим ростом ткани отбирают для заражения вирусом.
Перевиваемые культуры клеток (растущие) – это стабильные линии клеток, пассируемые вне организма в течение многих лет. Их получают из злокачественных опухолей и из нормальных (эмбриональных) тканей человека и животных. К ним относятся: 1) линия Неlа - клетки карциномы шейки матки человека; 2) линия Нер-2 – клетки злокачественной опухоли гортани человека; 3) линия Детройт-6 – клетки, выделенные из костного мозга человека, больного раком лёгких; 4) линии А-0 и А-1 – клетки амниона человека; 5) линия СОЦ – клетки сердца обезьяны циномольгус и другие.
Полуперевиваемые или диплоидные культуры клеток – это клетки тканей человека, сохраняющие в процессе пассажей - до года - диплоидный набор хромосом. Диплоидные клетки человека не подвергаются злокачественному перерождению и этим выгодно отличаются от опухолевых.
Методы обнаружения вирусов в культуре ткани
Цитопатическое действие (ЦПД).
Реакция гемадсорбции.
Метод «цветных» проб.
Метод бляшек.
Иммунофлюоресцентный метод.
Реакция связывания комплемента.
Реакция гемагглютинации.
Реакция преципитации в агаре.
Заражение животных, восприимчивых к данному вирусу.
Методы определения вида и типа вирусов
Определение вида и типа вирусов в вируссодержащем материале производится путём нейтрализации вирусов специфическими сыворотками. Результат нейтрализации может быть установлен на основании следующих признаков:
1) нейтрализация ЦПД;
2) нейтрализация гемадсорбции;
3) задержка (торможение) гемагглютинации;
4) цветная проба;
5) свечение клеток, содержащих вирус, под влиянием специфических флюоресцирующих сывороток;
6) нейтрализация в опыте на животных (у опытных животных инфекция не развивается).
Возбудителями ОРВИ являются следующие вирусы:
РНК–содержащие вирусы.
1. Ортомиксовирусы (вирусы гриппа А, В, С).
2. Парамиксовирусы (парагриппозные вирусы, вирус эпидемического паротита, вирус Ньюкастла, вирус кори, респираторно-синцитиальный вирус).
3. Пикорнавирусы (более 110 серотипов риновирусов, некоторые серотипы вирусов Коксаки (А и В) и ЕСНО).
4. Реовирусы (3-й серотип).
5. Коронавирусы.
ДНК–содержащие вирусы.
6. Аденовирусы (из 41 серотипа 8 являются возбудителями ОРВИ).
Для диагностики ОРВИ применяются следующие методы:
1. Вирусологические – заражение культур клеток и куриных эмбрионов.
2. Иммунофлюоресцентный (метод ускоренной диагностики).
3. Серологические реакции – РТГА, РСК, ИФА.
4. Использование РНК–зондов.
Контрольные вопросы
Положение вирусов среди живых организмов, к какому царству они относятся? Основные особенности вирусов, присущие только им. Размеры вирусов (мелкие, средние, крупные), способы определения размеров вирусов. Как называется зрелая вирусная частица? Строение простых и сложных вирусов: типы симметрии, составные части вирусной частицы, внешняя оболочка; примеры простых и сложных вирусов. Принципы классификации вирусов. Назовите основные семейства, роды и виды РНК- и ДНК–содержащих патогенных вирусов. Методы культивирования вирусов. Виды культур тканей, их характеристика и способы получения. Питательные среды для выращивания культур тканей. Куриные эмбрионы: строение, методы и условия заражения куриных эмбрионов. Основные этапы репродукции вирусов в клетке. Методы обнаружения вирусов в культуре ткани. Что такое внутриклеточные включения? Что такое цитопатическое действие вирусов? Методы определения вида и типа вирусов. Как определить ЦПД вируса? Способы обнаружения вирусов в заражённом курином эмбрионе.
Перечислите основных возбудителей острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ). Вирус гриппа: к какому семейству вирусов относится; форма, тип симметрии, схема строения, особенности генома, антигены и серологическая реакция. По каким антигенам определяют тип и подтип вирусов гриппа? Антигенная изменчивость вируса гриппа. Методы диагностики, применяемые в первые дни заболевания и для ретроспективной диагностики. Реакция гемагглютинации, способ постановки. Реакция торможения гемагглютинации, что можно определить с помощью этой реакции (два варианта)? Какие диагностические препараты нужны для этого? Составьте схему реакции торможения гемагглютинации для определения типа и подтипа вируса гриппа. Специфическая профилактика и лечение гриппа, препараты и их характеристика.
Работа студента на практическом занятии
1. Изучение морфологии вирусов по таблицам, электронограммам и слайдам. Усвойте строение различных вирусов, особенности и биологическую роль отдельных структур вирионов.
2. Изучение морфологии элементарных телец Пашена. При микроскопии готового препарата найдите тельца Пашена, зарисуйте их, объясните, почему в данном случае вирусы видны в световом микроскопе.
3. Микроскопия и зарисовка нормальных и заражённых вирусом культур клеток. Изучите морфологию клеток культуры ткани, убедитесь в наличии одного слоя клеток, объясните преимущества однослойных культур. Сравните нормальную культуру клеток с культурой клеток, заражённых вирусом с наличием ЦПД. Изучите препарат гемадсорбции. Зарисуйте препараты.
4. Вирусологическая диагностика гриппа:
а) зарегистрируйте данные из сопроводительной записки в журнал;
б) поставьте реакцию гемагглютинации со смывом с носоглотки больного;
в) учтите результаты серологической диагностики гриппа (демонстрация): РТГА с парными сыворотками для обнаружения противогриппозных антител; РТГА для определения типа и подтипа вируса гриппа;
г) ускоренный метод диагностики гриппа с помощью иммунофлюоресценции (разбор и демонстрация).
5. Изучение препаратов, применяемых для диагностики лечения и специфической профилактики гриппа.
|
|
|
Скачать 1.36 Mb.