Учебное пособие - Иммунология. Учебнометодическое пособие для студентов медицинских вузов Иммунология составлено в соответствии с программой для студентов 2 курса специальности Лечебное дело по иммунологии 2010 г
 Скачать 0.51 Mb.
|
|
Тема № 2: ИММУНИТЕТ: ВИДЫ ИММУНИТЕТА, НЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ ЗАЩИТЫ. Цель: изучить строение иммунной системы организма человека, строение и функции иммунокомпетентных клеток, изучить виды иммунитета и неспецифические факторы защиты организма. Познакомиться с основными этапами филогенеза и онтогенеза иммунной системы Вопросы для самоподготовки:
6. Патофизиологические (стресс, воспалительная реакция) механизмы неспецифической резистентности 8. Иммунная система организма. Центральные и периферические органы иммунной системы. 9. Филогенез и онтогенез иммунной системы. 10. Иммунокомпетентные клетки. Клеточные и гуморальные механизмы иммунитета (Т и В системы). . План: Программа:
7. Иммунная система организма 8.Филогенез и онтогенез иммунной системы 9. Иммунокомпетентные клетки Демонстрация: 1. Схемы и таблицы с механизмами неспецифического иммунитета. 2. Микропрепарат незавершенного фагоцитоза гонококков. Задание студентам: 1. Зарисовать схемы механизмов активации комплемента. 2. Зарисовать схему действия интерферонов. 3.Поставить Опыт действия лизоцима на различные виды микробов 4.Изучить микропрепарат незавершенного фагоцитоза гонококков. Зарисовать. 5.Заполнить таблицу: Особенности строения и функций иммунокомпетентных клеток 6.Заполнить таблицу: Эволюция иммунной системы Информационный материал: Иммунитет (от лат. immunitas — неприкосновенный, находящийся под защитой, освобождение, избавление от болезни) — это система биологической защиты внутренней среды многоклеточного организма (гомеостаза) от генетически чужеродных веществ экзогенной и эндогенной природы. Факторы неспецифической резистентности: • ареактивность клеток макроорганизма к патогенным микроорганизмам и токсинам, обусловленную генотипом и связанную с отсутствием на поверхности таких клеток рецепторов для адгезии патогенного агента; • барьерная функция кожи и слизистых оболочек, которая обеспечивается отторжением клеток эпителия кожи и активными движениями ресничек мерцательного эпителия слизистых оболочек. Кроме того, она обусловлена выделением экзосекретов потовых и сальных желез кожи, специфических ингибиторов, лизоцима, кислой средой желудочного содержимого и другими агентами. Биологические факторы защиты на этом уровне обусловлены губительным воздействием нормальной микрофлоры кожи и слизистых покровов на патогенные микроорганизмы; • температурная реакция, при которой прекращается размножение большинства патогенных бактерий. • клеточные и гуморальные факторы организма. В случае проникновения патогенов в организм включаются гуморальные факторы, к которым относятся белки системы комплемента, пропердин, лизины, фибронектин, система цитокинов (интерлейкины, интерфероны и др.). Развиваются сосудистые реакции в виде быстрого локального отека в очаге повреждения, что задерживает микроорганизмы и не пропускает их во внутреннюю среду. В крови появляются белки острой фазы — С-реактивный протеин и маннансвязывающий лектин, которые обладают способностью взаимодействовать с бактериями и другими возбудителями. В этом случае усиливаются их захват и поглощение фагоцитирующими клетками, т. е. происходит опсонизация патогенов, а эти гуморальные факторы играют роль опсонинов. К клеточным факторам неспецифической защиты относятся тучные клетки, лейкоциты, макрофаги, естественные (натуральные) киллерные клетки (NK-клетки, от англ. «natural killer»). Фагоцитоз Фагоцитозом (от phagein — пожирать, cytos — клетка) называется поглощение клетками каких-либо частиц с последующим их перевариванием (в большинстве случаев). Фагоцитоз микроорганизмов — защитное приспособление организма. Открытие этого явления и создание первой теории иммунитета как защитной реакции организма принадлежат И. И. Мечникову. Дальнейшие работы отечественных исследователей установили подчиненность фагоцитоза, как и других иммунологиче-ских реакций, нервно-гуморальной корреляции, в частности, возможность условнорефлекторного воспроизведения фагоцитарной реакции. Клетками фагоцитами являются лейкоциты (гранулоциты и моноциты), а также фиксированные клетки ретикуло-эндотелиальной ткани. Многих микробов лейкоциты способны фагоцитировать самостоятельно; наиболее же вирулентные микробы фагоцитируются только при участии антител — опсонинов и тропинов. Во всех случаях присутствие иммунной сыворотки способствует усилению фагоцитоза настолько закономерно, что по степени фагоцитоза можно судить о состоянии защитной способности организма (определение опсонического индекса) Лизоцим Одним из факторов видового иммунитета, губительно действующим на сапрофитную флору, а таюке на некоторых представителей патогенных микробов, является ферментоподобная субстанция, находящаяся в различных средах организма (плазма крови, перитонеальная жидкость, хрящ), а также в секретах различных желез (слезных, слюнных). При действии лизоцима на различные микроорганизмы наблюдается их лизис. Лизоцим был впервые открыт П. Н. Лащенковым в белке куриного яйца, который и является одним из источников его получения. Лизоцим получил некоторое применение в качестве биологического антисептика как в медицине (особенно в глазной клинике), так и в народном хозяйстве (как консервант некоторых продуктов). Сила лизоцима определяется его титром — наибольшим его разведением, вызывающим лизис культуры Micrococcus lysodeicticus. Для выявления силы действия лизоцима на различные виды микроорганизмов можно поставить следующий опыт. ОРГАНЫ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ЦЕНТРАЛЬНЫЕ ОРГАНЫ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ Костный мозг является одновременно органом кроветворения и органом иммунной системы. Общая масса костного мозга равна 2,5 – 3 кг. Структурной основой (стромой) костного мозга является ретикулярная ткань, представленная ретикулярными клетками и образуемыми ими ретикулярными волокнами. К стромальным элементам кроме ретикулярных клеток (фибробластов костного мозга)относят остеогенные, адвентициальные, жировые, эндотелиальные клетки и макрофаги. Выделяют красный и желтый костный мозг. По функциональному назначению в красном костном мозге различают миелоидную (гемоцитопоэтическую) и лимфоидную ткани, из которых идет образование клеток крови, моноцитов и В – лимфоцитов. Желтый костный мозг представлен в основном жировой тканью, которая заместила ретикулярную. Кровеобразующие элементы в желтом мозге отсутствуют. Но при больших кровопотерях на месте желтого костного мозга могут вновь появиться очаги кроветворения за счет стволовых клеток, поступивших с кровью. Тимус (вилочковая железа) расположен в грудной полости, позади верхней части грудины. Состоит из двух неодинаковых по форме и размеру долей, которые плотно прижаты друг к другу. Снаружи он покрыт капсулой из соединительной ткани. Вглубь органа от нее отходят тяжи – перегородки. Они делят всю ткань железы на маленькие дольки. В вилочковой железе различают наружное более темное корковое вещество, где господствуют лимфоциты, и центральное, светлое мозговое вещество, где располагаются железистые клетки. Под капсулой находится базальная мембрана, на которой в один слой лежат плоские эпителиоретикулоциты. Две главные артерии входят в тимус из капсулы, разветвляясь, идут по междольковым перегородкам и входят в мозговое вещество, окруженные тонким слоем рыхлой волокнистой соединительной ткани и эпителиоретикулоцитами с базальной мембраной. По мере продвижения сосудов к корковому веществу и ветвления на капилляры количество сопровождающей соединительной ткани уменьшается. Среди клеток периваскулярной соединительной ткани встречаются фибробласты, лейкоциты, тучные клетки и макрофаги. В результате этого просвет капилляра в корковом веществе оказывается отделенным от лимфоэпителиальной основы эндотелиоцитами на непрерывной базальной мембране, периваскулярным пространством, базальной мембраной эпителиоретикулоцита и его цитоплазмой – своеобразным гематотимусным барьером. Полагают, что этот барьер не пропускает антигены кровотока к развивающимся Т-лимфоцитам. В мозговом веществе гематотимусный барьер менее плотен. Венозная система складывается из сосудов, повторяющих ход артерий, и добавочных сосудов, обеспечивающих отток из коркового вещества, минуя мозговое. Лимфатические капилляры коркового и мозгового вещества образуют во внутреннем мозговом веществе выносящие лимфатические сосуды, направляющиеся в соединительнотканные перегородки и далее в региональные (медиастинальные) лимфоузлы. Основная масса лимфоцитов покидает тимус через стенку венозных отделов капилляров и посткапиллярных венул на границе коркового и мозгового вещества и лишь небольшая их часть – по лимфатическим путям. Бурса (сумка Фабрициуса) является центральным органом иммунной системы у птиц. У млекопитающих и человека этой сумки нет. Бурса представляет нечто подобное человеческому аппендиксу, слепому отростку кишечника. Только аппендикс располагается в середине кишечника, а Фабрициева сумка вблизи анального отверстия у птиц. Основным структурным элементом сумки служит лимфоидный узелок с корковой и мозговой зонами. Корковая зона содержит несколько плотных слоев лимфоцитов. Под ними расположен базальный эпителиальный слой. В центральной части среди ретикулоцитов находятся преимущественно малые лимфоциты. По периферии мозговой зоны расположены менее зрелые базофильные клетки лимфоидного ряда. Клеточный состав тимуса полностью обновляется за 4 –6 дней. Из тимуса в периферические лимфоидные ткани мигрирует около 5 % новообразующихся лимфоцитов. Для большинства других клеток, образующихся в тимусе, он же становится «могилой»: клетки погибают в течение 3 – 4 дней. Причина гибели не расшифрована. ПЕРИФЕРИЧЕСКИЕ ОРГАНЫ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ Селезенка - кроветворный орган, а также периферический орган иммунной системы, располагается слева от желудка, в левом подреберье, на пути тока крови по главным магистральным сосудам. Ежедневно через нее проходит около 800 мл крови. Это мощный фильтр для чужеродных белков, погибших форменных элементов и микроорганизмов, попавших непосредственно в кровоток. Селезенка является главным источником антител при внутривенном введении антигена. Именно в селезенке раньше, чем в каком-либо ином органе, в ответ на введение антигенных частиц начинается синтез JgM. Селезенка способна продуцировать факторы, стимулирующие фагоцитоз лейкоцитами и макрофагами. Лимфатические узлы – выполняют роль биологических фильтров. Они расположены на пути следования лимфы по лимфатическим сосудам от органов и тканей к лимфатическим протокам. Они находятся в хорошо защищенных местах и в области суставов. СИСТЕМА ЛИМФОЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ ОБРАЗОВАНИЙ Лимфоидные образования глотки – это 6 миндалин лимфоидного глоточного кольца. Каждая миндалина – это довольно крупное скопление лимфоидной ткани. Поверхность миндалин неровная, как будто изрыта оврагами. Эти складки называют криптами. Они задерживают частички пищи, пыли и т.д. Микроорганизмы попадая сюда, могут размножаться, что служит сигналом для запуска иммунологических реакций. Лимфоидные образования пищевода. В толще складок слизистой оболочки пищевода, а также между ними, в глубине его борозд расположены лимфоидные узелки. Находясь на пути пищевых масс, а, следовательно, и антигенного воздействия, лимфоидные узелки осуществляют контроль и защиту стенок органа от генетически чужеродного материала. Лимфоидные узелки формируют цепочки на всем протяжении органа, повторяя извилистый ход складок. Кроме того, в стенках пищевода присутствуют так называемые диффузно рассеянные клетки лимфоидного ряда, залегающие между цепочками. Лимфоидные образования желудка. В слизистой оболочке желудка обнаруживаются лимфоциты, относящиеся к В- и Т- популяциям, плазматические клетки и макрофаги. На разных этапах онтогенеза скопления лимфоидных узелков в различных частях желудка колеблется. Лимфоидные образования кишечника. Лимфоидные образования в стенках толстой и тонкой кишок имеют анатомические особенности. Строение и имммунологическая функция этих органов соответствуют физиологическому назначению тонкой и толстой кишок. Лимфоидный аппарат включает в себя: лимфоидные (пейеровы бляшки) одиночные лимфоидные узелки, диффузно расположенные лимфоциты. У начала толстой кишки, располагается червеобразный отросток с его лимфоидными узелками. Лимфоидные образования органов дыхания. В стенках органов дыхания, в которые вместе с воздухом попадают чужеродные частицы, имеется хорошо развитый аппарат иммунной защиты. Это скопления лимфоидной ткани расположенные в слизистой оболочке гортани, трахеи и бронхов под покровным эпителием, а также рассеянные в слизистой оболочке довольно многочисленные клетки лимфоидного ряда, получившие название лимфоидной ткани, ассоциированной с бронхами. Скопления лимфоидной ткани (лимфоидные узелки) зависит от возраста, а также функционального состояния организма Лимфоидные образования мочевыводящих путей. Лимфоидные скопления (узелки) в стенках мочевыводящих путей выполняют «сторожевые» функции по отношению к тем чужеродным веществам, которые попадают в них извне восходящим путем или образуются в верхних их отделах. Таблица 1.Особенности строения и функций иммунокомпетентных клеток
Таблица 2. Эволюция иммунной системы
Методические указания Опыт действия лизоцима на различные виды микробов В 5 пробирок наливают по 0,9 мл 0,5% раствора поваренной соли, после чего в первую пробирку добавляют 0,1 мл лизоцима и готовят десятикратные разведения путем переноса из предыдущей пробирки в последующую по 0,1 мл до разведения 1 : 10000 (четвертая пробирка). Пятая пробирка, контрольная, она не содержит лизоцима. Во все пробирки вносят по 0,5 мл стандартизованной одномиллиардной взвеси Е. coli , содержимое пробирок перемешивают и помещают в термостат при 37° на 3 часа, после чего учитывают результаты и отмечают наибольшее разведение лизоцима, вызвавшее лизис микроорганизмов. Для приготовления одномиллиардной взвеси бактерий необходимо взять односуточную культуру бактерий на скошенном МПА и смыть 0,5% раствором поваренной соли. Для смыва в пробирку с культурой микробов стерильно добавляют пипеткой 1—1,5 мл 0,5% раствора поваренной соли, вращая пробирку между ладонями. Полученную суспензию стерильной пипеткой перемещают в пустую пробирку и стандартизуют по оптическому стандарту, разводя имеющуюся суспензию микробов до 1 млрд. микробных тел в 1 мл 0,5% раствором хлористого натрия. Морфология бактерий – размер, форма и взаимное расположение бактериальных клеток Схема описания морфологии бактерий в мазке:
Контрольные вопросы:
Обязательная: 1.Хаитов P.M., Игнатьева Г.А.,Сидорович И.Г. Иммунология:Учебник.—М.:Медицина,2000.— 432 с : ил.(Учеб. лит. для студ. медвузов). 2.Ковальчук Л.В и др. Иммунология: практикум: учеб. пособие – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. – 176 с. 3.Поздеев О.К. Медицинская микробиология / под ред. акад. РАМН В.И. Покровского - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2001. – 768 с. 4.Борисов Л.Б. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. М. 1997 г. Дополнительная: 1.Генкель П.А., Микробиология с основами вирусологии. М.,1974 г. 2.Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: учебник для мед. вузов.- 3-е издание, испр. и доп. – СПб, СпецЛит. 2002. – 591 с. 3.Борисов Л.Б., Смирнова А.М., Медицинская микробиология, вирусология, иммунология, М., Медицина. 1994 г. 4.Тимаков В.Д., Левашов В.С., Борисов Л.Б. Микробиология. М. 1983 г. Тема № 3: ИММУНИТЕТ: АНТИГЕНЫ И АНТИТЕЛООБРАЗОВАНИЕ, ИММУННЫЕ РЕАКЦИИ. Цель: Познакомиться со строением и свойствами антигенов и антител, познакомиться с основными формами иммунного реагирования. Познакомиться с особенностями протекания реакций Аг+Ат. Научиться осуществлять постановку ориентировочной и развернутой реакции агглютинации Вопросы для самоподготовки:
5. Механизм реакций АГ+АТ. Стадии и компоненты 6. Реакция агглютинации. 7. Получение диагностических препаратов (агглютинирующая сыворотка, диагностикум. План: Программа:
Демонстрация: 1. Наборы ингредиентов для реакции агглютинации. 2. Постановка ориентировочной реакции агглютинации 3.Результаты постановки развернутой реакции агглютинации Задание студентам: 1.Зарисовать схемы первичного и вторичного иммунного ответа, отметить сходства и различия. 2.Поставить ориентировочную реакцию агглютинации на стекле с целью идентификации выделенной чистой культуры бактерий. Сделать заключение по результатам реакции. 3. Поставить развернутую реакцию агглютинации для определения серотипа бактерий. 4.Протоколировать и оценить результаты развернутой реакции агглютинации. Информационный материал ОСНОВНАЯ СХЕМА ИММУННОГО ОТВЕТА 1. Антиген, попадая в организм, в первую очередь сталкивается с естественными барьерами – кожей, слизистыми оболочками и т.д. Многим микроорганизмам не удается преодолеть их. 2. Если вторжение все же произошло, антиген встречается с фагоцитирующими клетками. 3. Макрофаг (фагоцит) пожирает и переваривает антиген. 4. Если он не справляется с ним самостоятельно, то представляет на поверхности своей мембраны информацию о проникшем враге. Это сигнал Т- или В- лимфоцитов. 5. В ответ на полученный сигнал о вторжении в периферических органах иммунной системы начинается отбор клеток, необходимых для борьбы именно с этим антигеном. Образуется клон соответствующих клеток. Одновременно формируется небольшое количество клеток памяти. 6. «Солдаты» вступают в бой. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ОТВЕТ ПО КЛЕТОЧНОМУ ТИПУ Иммунный ответ на различные антигены может происходить по-разному. Если в борьбу вступают Т-клетки, это называется иммунный ответ по клеточному типу. 1. Антиген встречает первые препятствия – кожу и т.д. 2. Макрофаг поглощает антиген и представляет его на мембране. 3. Информация о противнике передается Т-хелперу. 4. Т-хелпер способствует формированию клона Т-киллеров. Образуются клетки памяти. 5. Т- киллеры способны разрушать вторгшиеся «чужие» клетки и клетки, зараженные вирусом. 6. Реакция завершается при участии Т- подавляющих клеток. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ОТВЕТ ПО ГУМОРАЛЬНОМУ ТИПУ С ПОМОЩЬЮ Т- ХЕЛПЕРОВ При проникновении бактерий и некоторых вирусов может понадобиться гуморальный ответ. Возможны два его варианта: с участием Т- хелперов и без их вмешательства. 1. Проникновение антигена. 2. Поглощение антигена и появление информации о нем на макрофаге. 3. Передача информации Т- хелперу. 4. Т – хелпер способствует активации В-клеток. Образуются клетки памяти. 5. В - клетки превращаются в плазматические клетки, способные к синтезу антител. 6. Плазматическая клетка вырабатывает именно те антитела, которые нужны для борьбы с поступившим антигеном. Они связывают его, образуя иммунный комплекс. 7. Комплекс антиген – антитело захватывается макрофагом и разрушается. 8. Завершение иммунологической реакции происходит при участии Т- подавляющих клеток. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ОТВЕТ ПО ГУМОРАЛЬНОМУ ТИПУ БЕЗ ПОМОЩИ Т- КЛЕТОК 1. Проникновение антигена. 2. Поглощение антигена и представление его на макрофаге. 3. Информация с макрофага передается на В – клетку. 4. В – клетки превращаются в плазматические клетки, вырабатывающие антитела. 5. Антитела связывают антигены. 6. Комплекс антиген – антитело удаляется макрофагом. Для развития эффективного иммунного ответа необходимо участие целого ряда эффекторных и регуляторных клеток иммунной системы, клеток, участвующих в реакциях воспаления, гемопоэтических и других типов клеток. Взаимодействие между этими клетками осуществляется с помощью цитокинов. Цитокины – эндогенные низкомолекулярные белковые регуляторы, принимающие участие в наиболее эффективном проявлении иммунного ответа. Цитокины в основном играют регулирующую роль в межклеточных взаимодействиях, активируя или, ингибируя активность определенных клеток. Некоторым цитокинам свойственна прямая эффекторная функция. Цитокины секретируются разными типами клеток, в основном разными популяциями лейкоцитов, и действуют локально от клетки к клетки, соединяясь со специфическими высокоаффинными рецепторами. Термином «цитокины» объединяют разнообразные факторы роста, интерфероны, хемокины и интерлейкины. В настоящее время идентифицировано около 80 цитокинов. Однако предполагают, что их количество приближается к 1000. Реакция агглютинации Агглютинацией называется склеивание микробов или других клеток при воздействии на них иммунной сыворотки, содержащей антитела-агглютинины. Реакция агглютинации проявляется в том, что в равномерной взвеси клеток, например, бактерий, при добавлении иммунной сыворотки происходит скучивание клеток, образование зернышек или хлопьев, которые постепенно оседают на дно, жидкость же над осадком совершенно просветляется . Однако зернышки или хлопья образуются только в том случае, если реакция происходит в присутствии электролитов. Таким образом, для проявления реакции агглютинации нужно иметь: 1) антиген (агглютиноген) в виде взвеси клеток, 2) антитела (агглютинины в виде иммунной сыворотки) и 3) электролиты — обычно физиологический раствор. Внешнее проявление положительной реакции агглютинации бактерий имеет двоякий характер в зависимости от свойств антигена: у безжгутиковых бактерий, имеющих только один соматический или 0-антиген, происходит склеивание непосредственно самих микробных клеток, и образующиеся кучки имеют вид мелких компактных зернышек. Такая агглютинация называется тонкозернистой; она происходит медленно — в течение 18—22 часов. У бактерий со жгутиками имеется два антигена — соматический, О-антиген, в самой клетке и жгутиковый, Н-антиген, находящийся в жгутиках. Клетки склеиваются друг с другом жгутиками и образуют рыхлые крупные хлопья. Такая агглютинация называется крупнохлопчатой; она наступает быстро — в течение 2—4 часов. Реакция агглютинации, благодаря своей специфичности, простоте постановки и демонстративности, получила широкое распространение в микробиологической практике для диагноза многих инфекционных заболеваний: брюшного тифа, паратифов, дизентерии, холеры, сыпного тифа, бруцеллеза и т. д. Ею пользуются с диагностической целью в двух направлениях. 1. Для определения выделенного из какого-либо субстрата неизвестного микроба. В этом случае агглютинацию ставят с определенной, заранее приготовленной агглютинирующей сывороткой, полученной путем иммунизации кроликов определенным видом бактерий и, следовательно, содержащей агглютицины в отношении этих бактерий. В качестве антигана берут культуру неизвестного исследуемого микроба; положительный (результат (реакции указывает, что неизвестный микроб идентичен тому, который был взят в качестве антигена для приготовления агглютинирующей сыворотки. 2. Для обнаружения агглютининов к тому или другому определенному виду бактерий в сыворотке больного. В этом случае для агглютинации берут определенную лабораторную культуру бактерий (или несколько культур разных видов) в качестве антигена и сыворотку больного; положительный результат агглютинации указывает на то, что в сыворотке больного имеются агглютинины к определенному, известному виду микроба, т. е. что данный микроб является возбудителем заболевания, в процессе которого в сыворотке больного накопились защитные антитела. В качестве примера можно привести использование реакции агглютинации для диагноза брюшного тифа. На первой неделе болезни в посеве из крови больного обнаруживают бактерий и для того, чтобы установить, что эти бактерии являются брюшнотифозными палочками, ставят реакцию с лабораторной брюшнотифозной агглютинирующей сывороткой: если наступит агглютинация выделенных из крови больного неизвестных бактерий, это значит, что они являются брюшнотифозными бактериями. Начиная со второй недели болезни, диагноз брюшного тифа устанавливают путем обнаружения в сыворотке больного антител-агглютининов. Для этого ставят реакцию агглютинации с сывороткой больного и с лабораторной культурой брюшнотифозных бактерий (обычно в опыт вводят еще культуры паратифа А и паратифа В): наступившая агглютинация покажет наличие агглютининов к брюшнотифозной палочке (или одной из паратифозных) в сыворотке больного, которые появились у него в процессе заболевания брюшным тифом. Эта реакция носит наименование реакции Видаля и широко применяется для диагноза брюшного тифа. Аналогичная реакция агглютинации для постановки диагноза сыпного тифа называется реакцией Вейль-Феликса, для диагноза бруцеллеза — реакцией Райта. Получение иммунных сывороток Иммунные сыворотки, применяемые в медицинской практике, содержат антитела к микробам или их токсинам: они готовятся для лечебных и диагностических целей. Лечебные сыворотки применяются для лечения инфекционного заболевания так как введение больному большого количества готовых антител приводит к гибели микробов — возбудителей болезни или к обезвреживанию их ядов. Эти сыворотки реже применяются с профилактической целью, так как они сообщают лишь пассивный иммунитет, длящийся короткое время (2—3 неделя). Диагностические сыворотки используются для установления лабораторным путем диагноза инфекционного заболевания: при помощи специфических антител распознается выделенный из организма микроб — возбудитель данного заболевания. Лечебные и диагностические сыворотки готовятся путем иммунизации животных соответствующими антигенами. Для получения больших количеств лечебной сыворотки иммунизируют крупных животных (лошадей); диагностические сыворотки получаются чаще всего путем иммунизации кроликов. Иммунизация проводится путем подкожных или внутривенных инъекций антигена в возрастающих количествах обычно с интервалами между инъекциями в 5—8 дней; число инъекций зависит от цели иммунизации и характера антигена. Первым этапом в технике получения иммунных сывороток является приготовление антигенов. Антигенами называются чужеродные для организма вещества, которые вызывают в организме образование антител. Последние различным образом воздействуют на микробы или их продукты. Антигеном может быть любое вещество белковой природы — микробы или другие клетки, продукты микробов (например, токсины) и, наконец, другие белковые вещества (например, сыворотка). По окончании курса иммунизации у животных стерильно берут кровь (у лошадей — путем кровопускания из яремной вены, у кроликов—непосредственно шприцем из сердца) и получают из нее после свертывания сыворотку. С этой целью кровь, собранную в стерильную посуду, сначала помещают в термостат при 37° на 4—6 часов, для ускорения свертывания, затем в ледник на сутки. Полученную прозрачную сыворотку осторожно отсасывают в стерильную посуду, прибавляют к ней для консервирования 0,5% хлороформа или других веществ. Лечебные сыворотки выдерживают на леднике в течение 4—6 месяцев. За это время происходит просветление сыворотки вследствие выпадения нестойких белков, снижаются ее токсические для человека свойства и устанавливается более или менее устойчивый титр антител. Затем сыворотки титруются на содержание антител, проверяются на стерильность и на безвредность для животных и расфасовываются по ампулам. Сыворотки сохраняются на холоду и в темноте; срок годности их считается 1 год; сыворотки помутневшие не допускаются к употреблению. Наибольшее распространение приобрели антитоксические лечебные сыворотки (противодифтерийная, противостолбнячная, противогангренозные и др.), дающие быстрый терапевтический эффект благодаря нейтрализации микробного токсина в организме больного. Антибактериальные сыворотки (противоменингококковая, противострептококковая) оказывают более медленный эффект. При практическом применении лечебных сывороток больному всегда вводят строго определенные дозы этих сывороток. Для антитоксических сывороток лечебную силу определяют в так называемых антитоксических единицах, обозначаемых АЕ. Единица антитоксина является условной величиной. Так, для дифтерийного антитоксина I АЕ считается то наименьшее количество иммунной сыворотки, которое нейтрализует 100 Dim дифтерийного токсина для морской свинки весом 250 г. Диагностические сыворотки (агглютинирующие, преципитирующие и гемолитические) широко применяются в лабораторной практике. Иммунизация кролика. Наиболее распространенным способом иммунизации животных является подкожное или внутривенное введение антигена (техника введения та же, что при заражении животных, см. стр. 107—109). Антиген вводят в вену при помощи стерильного шприца с тонкой иглой. Наполнив шприц соответствующим антигеном, необходимо удалить пузырьки воздуха во избежание воздушной эмболии в случае попадания .воздуха в вену; для этого берут шприц вертикально, вверх иглой, (насаживают на конец иглы кусок стерильной (ваты и осторожно проталкивают поршнем поднявшиеся кверху пузырьки воздуха вместе с некоторым количеством жидкости. Техника внутривенного введения описана на стр. 109. Объем вводимой в вену жидкости обычно равен 0,5—1— 1,5 мл. Если антигеном являются бактерии, то делают суспензию по стандарту из суточной культуры бактерий, убивают бактерий нагреванием при 60° в течение часа и вводят в вену 1 мл суспензии. При иммунизации эритроцитами отмывают их физиологическим раствором путем троекратного центрифугирования и отсасывания жидкости над осадком, затем приготовляют 50% взвесь эритроцитов в физиологическом растворе и вводят в вену 0,5 мл этой взвеси. При повторной иммунизации доза антигена увеличивается. Взятие крови у кролика. Небольшие количества крови у кролика берут из краевой ушной вены. Техника взятия крови из вены подобна технике внутривенных инъекций, отличаясь тем, что здесь берут пустой шприц, в который медленно набирают, вытягивая поршень, свободно поступающую из вены кровь. Если нет необходимости в сохранении стерильности крови, то можно получать ее путем прокола вены иглой шприца, через которую кровь обильно вытекает в подставленную пробирку. Большие количества крови извлекают непосредственно из сердца стерильным шприцем (см. стр. 110), после чего кролику вводят подкожно равный объем подогретого до 38° физиологического раствора.  Получение адсорбированной агглютинирующей сыворотки методом истощения (адсорбции) по Кастеллани.Метод адсорбции агглютининов по Кастеллани При постановке реакции агглютинации иногда наблюдается явление групповой агглютинации, когда сыворотка больного (а иногда и агглютипирующая диагностическая сыворотка) агглютинирует не один вид микроба, а несколько видов, родственных один другому. Так, например, сыворотка больного брюшным тифом может агглютинировать не только брюшнотифозных бактерий, но и паратифозных А и В; диагностическая дизентерийная сыворотка агглютинирует несколько видов дизентерийных бактерий. То же явление может встретиться и при определении вида исследуемого микроба путем агглютинации, когда обнаруживается, что он агглютинируется не одной специфической сывороткой, но и другими сыворотками близких типов. В этих случаях, благодаря наличию идентичных компонентов в сложных бактериальных антигенах, в иммунной сыворотке могут оказаться не только антитела к специфическому микробу, но и групповые антитела к родственным видам микробов. Это явление, затрудняющее точную серодиагностику и идентификацию микроба, может быть устранено методом адсорбции агглютининов, предложенным Кастеллани. Метод основан на том, что при добавлении к иммунной сыворотке специфического антигена он адсорбирует полностью все антитела — и специфические, и групповые, в то время как неспецифический антиген способен связать только побочные (групповые) антитела, оставляя свободными антитела к специфическому антигену. Так, в приведенном выше примере после прибавления брюшнотифозных бактерий к сыворотке больного брюшным тифом они адсорбируют все антитела, и в дальнейшем эта сыворотка больше не будет способной к агглютинации. Если же к другой порции этой сыворотки прибавить микробов паратифа, то в наступившей групповой реакции паратифозные бактерии свяжут только групповые антитела, но не специфические, после чего сыворотка окажется вполне способной агглютинировать специфических микробов — брюшнотифозные палочки. Титрование агглютинирующей сыворотки: Тип реакции: реакция агглютинации. Исследуемый материал: сыворотка животного, гипериммунизированного бактериальной взвесью. Диагоностический препарат: взвесь убитых бактерий, применявшихся для гипериммунизации. Принцип метода: к серийным разведениям агглютинирующей сыворотки добавляют равные количества взвеси убитых бактерий, применявшихся для получения этой сыворотки. Положительный результат реакции: образование хлопьев, просветление жидкости. Отрицательный результат: равномерная муть. Применение: для определения титра агглютинирующей сыворотки. Титр агглютинирующей сыворотки -наибольшее разведение сыворотки, в которой еще наблюдается агглютинация. В данном случае титр агглютинирующей сыворотки равен Серотипирование – изучение антигенного состава микроорганизмов М е т о д и ч е с к и е у к а з а н и я Постановка реакции агглютинации Существует несколько методов постановки реакции агглютинации: 1) макроскопическая (развернутая) агглютинация в пробирках, которая учитывается через 2 часа выдерживания при 37° и на следующий день стояния при комнатной температуре; 2) ориентировочная агглютинация на предметном стекле в капле концентрированной агглютинирующей сыворотки, наступающая в течение нескольких минут; 3) ускоренный метод Нобля с применением концентрированных сывороток н встряхиванием, для чего требуется 8—10 минут. Агглютинирующая диагностическая сыворотка готовится путем иммунизации кроликов; полученную иммунную сыворотку, определив ее титр (максимальное разведение), разливают по ампулам с добавлением консерванта; следует иметь в виду, что обозначенный на ампуле титр сыворотки со временем снижается. Иногда употребляют высушенную сыворотку; при пользовании сухими сыворотками разводят их дестиллированной водой 1 : 9 из расчета, что сыворотка потеряла при высушивании 9 частей веса. Сыворотка от больного для постановки реакции агглютинации получается из его крови, взятой стерильно из локтевой вены в количестве 5—10 .мл. Одновременно часть крови употребляют для посева. Если же кровь берут только для постановки реакции, то вполне достаточно 1—2 мл; тогда берут кровь из пальца путем прокола иглой Франка. Антигеном для реакции агглютинации являются соответствующие культуры бактерий в живом или убитом состоянии. Живыми культурами пользуются тогда, когда агглютинация ставится с целью определения вида бактерий, выделенных из Какого-либо субстрата; в таком случае суточную агаровую культуру бактерий смывают 1— 2 мл физиологического раствора и полученной взвесью бактерий пользуются для реакции. При постановке же реакции с сывороткой больного принято пользоваться заранее заготовленными диагностикумами — взвесью убитых бактерий. Приготовление О- и Н-антигенов Соматический 0-антиген бактерий является по своему составу сложным химическим комплексом, специфичность которого определяется глюцидолштоидополипептидпым компонентом. Этот антиген устойчив к воздействию температуры, спирта в противоположность жгутиковому Н-антигену. Эта различная устойчивость О- и Н-антигенов к нагреванию и спирту положена в основу приготовления 0-антигена. Наиболее простым способом приготовления 0-антигена является прогревание пробирки со смывом агаровой культуры соответствующего микроорганизма в кипящей водяной бане в течение 1,5—2 часов (по Кауфману достаточно 30 минут). Для приготовления спиртового 0-антигена берут возможно более густую взвесь микробов в физиологическом растворе (смыв агаровой культуры). К определенному объему взвеси маленькими порциями медленно добавляют равный объем абсолютного этилового спирта, причем после добавления каждой его порции пробирку с антигеном встряхивают. После добавления всего объема спирта пробирку помещают в термостат на 12—24 часа, после чего в нее добавляют физиологический раствор в количестве половины объема жидкости, содержащейся в данной пробирке (концентрация спирта—33%). Перед употреблением полученный антиген разводят еще в 6 раз. Приготовление жгутикового Н-антигена основано на том, что обработка подвижных микробов формалином приводит к понижению активности соматического антигена. Для приготовления жгутикового антигена к взвеси агаровой культуры микробов в физиологическом растворе добавляют 0,2% формалина, после чего взвесь выдерживают в термостате при 37° в течение 24 часов. Агглютинирующая диагностическая сыворотка содержит антитела, полученные из сыворотки крови гипериммунизироанных животных, предназначена для постановки реакций агглютинации Определение антигенного состава Х-культуры с помощью неадсорбированных и адсорбированных агглютинирующих сывороток. 1. Ориентировочная реакция агглютинации Ориентировочную реакцию агглютинации ставят на предметном стекле. Наносят пастеровской пипеткой каплю физиологического раствора, затем в ней тщательно размешивают небольшое количество культуры до получения гомогенной взвеси бактерий. Если отсутствует реакция самооглютинации, продолжают исследование. Рядом с первой каплей наносят каплю сыворотки в разведении 1 : 10, 1 : 20 и смешивают обе капли. Через несколько минут в случае положительного результата наблюдается образование агглютината , которое еще ускорится, если слегка покачивать стекло 2. Реакция развернутой агглютинации с целью серотипирования E. сoli Применяется для подтверждения результатов ориентировочной реакции агглютинации с моновалентными сыворотками. Сначала готовят основное разведение взвеси микроорганизмов (1:50). из которого делают серию разведений путем последовательного переноса 0,5 мл из предыдущей пробирки в следующую пробирку ряда (0,5 + 0,5 физраствора). Из последней пробирки 0,5 мл разведенной взвеси удаляют для сохранения одинакового объема. В контрольную пробирку (контроль антигена) вносят 1 мл изотонического раствора хлорида натрия. В каждую пробирку с разведениями и в контрольную пробирку вносят пастеровской пипеткой по 2 капли моновалентной сыворотки. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37°С на 2 ч, затем сутки выдерживают при комнатной температуре. Учет реакции развернутой агглютинации производят, оценивая последовательно каждую пробирку, начиная с контрольных, при осторожном встряхивании. В контрольных пробирках агглютинации не должно быть. Интенсивность реакции агглютинации отмечают следующими знаками: "++++" — полная агглютинация (хлопья агтлютината в абсолютной прозрачной жидкости), "+++" — неполная агглютинация (хлопья в слабоопалесцирующей жидкости), "++" — частичная агглютинация (хлопья четко различимы, жидкость слегка мутная), "+" — слабая , сомнительная агглютинация (жидкость очень мутная, хлопья в ней плохо различимы), "—" — отсутствие агглютинации (жидкость равномерно мутная). Контрольные вопросы: 1.Какими свойствами обладают антигены? 2.Какие виды антител Вы знаете? 3.Назовите стадии антителообразования 4.Каков механизм реакций иммунитета. 5.Перечислите виды реакций аглютинации. 6.Охарактеризуйте основные способы получения иммунных сывороток. Список литературы: Обязательная:
Дополнительная:
Тема № 4: ИММУНИТЕТ: ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ПАМЯТЬ И ТОЛЕРАНТНОСТЬ.ТРАНСПЛАНТАЦИОННЫЙ ИММУНИТЕТ.ИММУННЫЕ РЕАКЦИИ. Цель: Познакомиться с механизмами иммунологической памяти и толерантности. Изучить особенности трансплантационного иммунитета. Научиться ставить реакцию Видаля, РНГА. Уметь интерпретировать результаты реакций. Вопросы для самоподготовки:
План: Программа:
3. Реакции агглютинации (РА) для серодиагностики брюшного тифа 4. Нагрузочные реакции. РНГА Демонстрация: 1. Диагностические препараты для выявления антител (диагностикумы). 2. Результаты постановки реакции агглютинации по Видалю. 3. Результаты постановки РНГА. Задание студентам:
Информационный материал | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||