Учебное пособие - Иммунология. Учебнометодическое пособие для студентов медицинских вузов Иммунология составлено в соответствии с программой для студентов 2 курса специальности Лечебное дело по иммунологии 2010 г
 Скачать 0.51 Mb.
|
|
ПЕНЗЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ КАФЕДРА «МИКРОБИОЛОГИИ, ЭПИДЕМИОЛОГИИ И ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ» Н. Н. Митрофанова В.Л. Мельников ИММУНОЛОГИЯ Учебно-методическое пособие для студентов медицинских вузов ПЕНЗА 2013 Учебно-методическое пособие для студентов медицинских вузов «Иммунология» составлено в соответствии с программой для студентов 2 курса специальности «Лечебное дело» по иммунологии 2010 г. По каждой теме сформулирована цель занятия. Имеется план и методика выполнения различных экспериментальных работ. Приведены современные методы диагностики различных инфекций. Руководство рекомендовано для самостоятельной подготовки студентов к практическим занятиям. Рецензенты: доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой аллергологии и иммунологии ГБОУ ДПО «Пензенский институт усовершенствования врачей» Б.А. Молотилов; кандидат медицинских наук, доцент, заведующий кафедрой инфекционных болезней УО «Гомельский государственный медицинский университет» Е.Л. Красавцев Тема 1: ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРИЯ. ОСНОВНЫЕ МОДЕЛИ В ИММУНОЛОГИИ. ОСОБЕННОСТИ РАБОТЫ С ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫМИ КЛЕТКАМИ. Цель: Познакомиться с предметом и задачами иммунологии, с историей развития и основными теориями иммунитета. Выучить и научиться выполнять правила противоэпидемического режима и техники безопасности в иммунологической лаборатории. Изучить объекты исследования в иммунологии. Вопросы для самостоятельной подготовки:
План Программа:
Демонстрация:
Задание студентам: 1. Освоить работы с бактериологической петлей. 2. Освоить правила работы с чашкой Петри, бактериологической пробиркой, спиртовкой, шпателем. 3. Научиться фламбировать бактериологическую петлю. 4. Научиться забирать ПБА с поверхности питательной среды. 5. Заполнить таблицу: Теории иммунитета Информационный материал Все иммунологические исследования проводят в специальных лабораториях, структура и оборудование которых зависят от объектов исследования и от целевой направленности. Объекты исследования:
Целевая направленность:
Изучение иммунного ответа и серодиагностика заболеваний человека и животных осуществляют в иммунологических и серологических лабораториях. Иммунологические лаборатории могут входить в состав:
В центрах Роспотребнадзора проводят серологические анализы материалов, полученных от больных и контактных лиц, обследуют бактерионосителей, проводят санитарно-микробиологические исследования объектов внешней среды. В серологических лабораториях больниц и диагностических центров проводят исследования с целью диагностики инфекционных заболеваний. В иммунологических лабораториях НИИ проводят научные исследования. Иммунологические лаборатории размещаются в нескольких помещениях. В лаборатории предусмотрены:
Оборудование: перечислить, указать назначение. Иммунологические методы 1. Методы определения веществ, характеризующихся наличием АТ против них Методы иммуноанализа
2. Методы фракционирования
3.Иммуногистохимические методы 4. Методы молекулярной биологии (ПЦР)
5. Методы биотехнологии – клонирование молекул, ПЦР, получение рекомбинантных белков, создание инбридных генов 6. Методы изучения свойств нативных клеток иммунной системы в культурах in vitro 7. Методы исследования функции и взаимодействия клеток in vivo По определению экспертов ВОЗ Клиническая иммунология – это клиническая и лабораторная дисциплина, занимающаяся изучением вопросов диагностики и лечения больных с различными патологическими состояниями, в основе которых лежат иммунологические состояния (механизмы) и состояния, в терапии и профилактике которых иммунопрепараты играют ведущую роль. Клиническая иммунология и иммунологическая служба должны состоять из клинической и лабораторной составляющих. Лабораторная иммунологическая диагностика – одно из направлений клинической лабораторной диагностики должна развиваться в соответствии с нормативной базой, принятой для подразделений лабораторной службы. В РФ создана сеть лабораторной клинической иммунологии, разработана методология оценки иммунного статуса населения. В соответствии с решением Комиссии МЗ СССР (№16-1 от 22.08.1990 г.) «О развитии клинической иммунологии» в стране в некоторых городах (Москва, Владивосток, Омск, Тюмень, Екатеринбург) созданы региональные центры клинической иммунологии. Для того, чтобы иммунологическая диагностика могла эффективно использоваться клиницистами, необходимо сформулировать основные принципы организации иммунологической лаборатории.
Первый официальный документ, регламентирующий деятельность иммунологической лаборатории – Приказ МЗ СССР (№539 от 18.04.1986 г.) «Об организации лабораторий клинической иммунологии» обязывал определять 6 показателей периферической крови:
Успехи фундаментальной иммунологии, основанные на достижениях молекулярной биологии и генной инженерии, обусловили новый этап в развитии иммунологических лабораторий. В конце прошлого века стало очевидно, что большинство областей клинической медицины нуждаются в помощи иммунологических лабораторий. Инфекционисты, кардиологи, дерматологи, эндокринологи, ревматологи и другие врачи нуждаются в обнаружении и количественном определении специфических антител или аутоантител в сыворотке крови, на мембранах циркулирующих клеток и в тканях. С заболеваниями, в патогенезе которых ведущую роль играют аллергические реакции, сталкиваются представители других клинических специальностей. Таблица 1.Участие аллергических реакций разных типов в патогенезе патологических состояний, встречающихся в различных клинических дисциплинах
Врачи разных специальностей ставят перед иммунологической лабораторией задачу выявления иммунодефицитных состояний. Диагноз «иммунодефицит» является лабораторным диагнозом. При многих заболеваниях иммунологическая лаборатория необходима при оценке прогноза заболевания, стойкости ремиссии, вероятности рецидива, полноты выздоровления, при назначении иммунокорректирующей терапии. Современная иммунологическая лаборатория имеет возможность провести:
Необходимо построение системы медицинских стандартов иммунологического обследования больного. Составляющие стандартизации иммунологического обследования:
Цель и задачи обследования Диагностика Мониторинг Назначение иммунокорректирующей терапии Выбор показателя с позиций доказательной медицины Определение объема иммунологического обследования. 2. Стандартизация определения лабораторных иммунологических показателей включает: А) Стандартизация доаналитического этапа Подготовка больного Взятие биологического материала Режим хранения и доставки материала в лабораторию Регистрация и маркировка образцов Первичная обработка биоматериала Банкирование биоматериала Б) Стандартизация аналитического этапа Протоколы методов Стандарты внутреннего контроля качества Программы внешнего контроля качества В) Стандартизация постаналитического этапа Форма представления окончательного результата Унификация значения нормы 3. Стандартизация интерпретации результатов включает: Сопоставление результатов с клиническими данными Сравнение диагностической информативности отдельных показателей Алгоритмы диагностики Заключение Подтверждение диагноза Определение фазы заболевания Описание иммунной системы Рекомендации Проведение дополнительного обследования Назначение иммунокорректирующей терапии Специализированные программы внешней оценки качества Объекты исследования Для проведения фундаментальных исследований в иммунологии лучший объект – инбредные мыши. Инбредные животные – животные, полученные путём инбридинга, т.е. последовательных близкородственных скрещиваний с целью получения гомозиготного и генетически идентичного потомства. Среди потомков для дальнейших скрещиваний сначала отбирают особей по признакам внешнего сходства, в последних поколениях тестируют на совпадение групп крови и приживления кожных лоскутов. Через 20 поколений и более получают мышей с высокой степенью гомозиготности, обозначенных как чистая линия. Главная цель выделения чистых линий – получение возможности много кратного повторения экспериментов на генетически одинаковых организмах, т.е. обеспечение воспроизводимости результатов исследования. Мыши стали основными экспериментальными животными в иммунологии, так как:
Созданы линии мышей с заданными характеристиками, что позволяет выбирать особей для достижения конкретных целей. Характеристики животных разных линий документированы. Наиболее известные питомники: Джексоновская лаборатория в США ежегодно поставляет 2 млн. животных 2500 различных линий. 97% этих животных можно приобрести только у них. В каждом питомнике линии мышей имеют паспорт – систематизированы в базах данных. Известен гаплотип (Н-2) мышей разных линий, окрас, поведенческие реакции, особенности функционирования иммунной системы и др. Кроме чистых линий выводят конгенных мышей. Это линии, отличающиеся небольшой частью генома. В основе выведения конгенных мышей лежит возвратное скрещивание – получение потомства в ряду поколений от скрещивания гетерозиготы (потомков гомозиготных родителей, генетически отличающихся между собой) с одним из исходных гомозиготных родителей. Это скрещивание проводится для внедрения комплекса Н2 донорской линии А в генотип основной линии В. Например, при скрещивании маркирующей линии А и основной линии В получают гибриды первого поколения F1 (а/b, генерация I). При дальнейшем скрещивании гибридов F1 с особями основной линии В, получают потомство, состоящее из гомозигот (b/b) и гетерозигот (а/b) по комплексу Н2. В последующих скрещиваниях отбираются только гетерозиготные особи, имеющие признак А (Н2а), которые определяются по приживлению кожного трансплантанта от маркирующей линии А и положительной серологической реакции клеток крови с анти-А-сывороткой. По мере продолжения скрещиваний α-положительных особей с особями основной линии В доля генома линии А постоянно снижается, но при этом для дальнейшего размножения из потомства отбирают только тех особей, которые сохраняют признак А (Н2а). К 12 поколению (генерация №12) практически весь геном отбираемых после гибридизации мышей представлен основной линией В, за исключением признака А, по которому шёл отбор. Дальнейшая задача состоит в переводе признака в гомозиготное состояние. Для этой цели гетерозигот (а/b) скрещивают между собой и отбирают для дальнейшего размножения только тех особей из потомства, которые отторгают кожный трансплантат, взятый от особи линии В и не дают реакции с анти-В-сывороткой. Этот отбор выявляет особей с присутствием признака В (Н2b) и гомозиготность по признаку А (Н2а). Таким образом, в результате применения данной схемы скрещивания, в геном основной линии В внедряется комплекс Н2 маркирующей линии А. С момента перевода комплекса Н2а в гомозиготное состояние констатируется получение новой конгентной (по отношению к основной) линии В. Основные линии инбрендных мышей
В 1959 году Расселом описаны определенные частично инбредные мыши – спонтанные мутанты – самцы, которые вскоре после рождения покрывались чешуйчатой перхотью, отставали в росте, страдали диареей, умирали в возрасте 3 недель. У них наблюдалась массивная лимфоаденопатия, спленомегалия, аномальная инфильтрация лимфоцитами кожи, печени, лёгких. Мутантных самцов назвали «скурфи». В 2001 году было выявлено, что мутация «скурфи» затронула ген фактора транскрипции, локализованного в Х-хромосоме. Nude (лишенные волосяного покрова) – выведенные в 1960 году мыши со спонтанной мутацией, в результате которой у мышей-гомозигот по данной мутации отсутствуют тимус и волосяной покров. Мутантный ген поддерживают при размножении мышей в гетерозиготном состоянии. AKR – белые мыши. У 90% мышей к 6-8 месяцу развиваются «спонтанные» тимомы и лейкоз.
(NZB×NZW) F1 – гибриды первого поколения чёрных и белых новозеландских мышей. У них спонтанно развивается синдром, напоминающий красную волчанку человека с гломерулонефритом. В крови содержатся Ат к ДНК. ЕАЕ – мыши с аутоиммунным энцефалитом. Биологические материалы для исследований в иммунологической лаборатории: Цельная и периферическая кровь Сыворотка крови Плазма крови Клетки крови, отделенные от жидкой фракции Цереброспинальная жидкость Синовиальная жидкость Бронхоальвеолярный лаваж Выделения слизистых секретов половых органов Выделения из носа Моча Супернатанты, полученные от культивирования in vitro клеток Гомогенаты тканей Цитоплазматические и ядерные компоненты клеток Биологический материал отличается по биохимическому составу, рН, ионной силе, вязкости. Каждая тест-система разработана строго для конкретного вида биоматериала и в 99% случаев – для сыворотки крови. Тест-системы для анализа сыворотки крови не могут использоваться для работы с другими биоматериалами из-за высокой вероятности получения ложных результатов. Тест-системы для человека не могут применяться для работы с животными. Исключение – перекрестнореагирующие агенты (цитокин – трансформирующий фактор роста человека и свиньи). Таблица 2.Теории иммунитета
Методические указания 1. Приготовление препаратов для микроскопического и серологического исследования. Для приготовления препарата исследуемый материал берут из пробирки или чашки Петри бактериологической петлей или стерильной пипеткой. В своей научной и практической деятельности микробиолог работает обычно с “чистыми” культурами микробов (рост микробов только одного определенного вида), добиваясь их получения из исследуемого материала, а затем поддерживая рост чистых культур в течение необходимого (иногда длительного) срока. При пересеве их с одной среды на другую или при извлечении части культуры для приготовления мазка необходимо соблюдать условия, обеспечивающие предохранение чистой культуры от загрязнения посторонними микробами. Сохранение чистоты культуры является основой бактериологической работы, так как только при этом условии возможно точное выявление всех свойств изучаемого микроба (морфологических, биохимических, серологических и др.). Извлекают микробов из пробирки с помощью металлической (предпочтительно платиновой) проволоки в виде петли или иглы . Последняя может быть погружена в пробирку только после стерилизации ее в пламени спиртовки-фламбирования. При этом петля быстро накаливается и так же быстро остывает без повреждения металла. При прокаливании петлю или иглу следует держать в пламени вертикально для того, чтобы проволока на всем протяжении была накалена докрасна. Затем, проведя несколько раз через пламя спиртовки, стерилизуют и ближайший к проволоке отрезок стеклянной или металлической палочки, в которую вмонтирована петля. Лишь после такой тщательной стерилизации петля может быть внесена в пробирку с культурой микроорганизмов. Прикосновение к культуре слишком горячей петли может повредить микробам. Поэтому рекомендуется остудить петлю, предварительно прикоснувшись ею к внутренней поверхности пробирки или же к питательной среде, свободной от бактериального налета (если имеют дело с твердой средой); если проволока недостаточно остыла, то среда при прикосновении петли с треском расплавляется или “кипит”. 2.Забор биологического материала с поверхности питательной среды в бактериологичесой пробирке. 1. Для извлечения культуры с целью приготовления мазка пробирку берут в левую руку между большим и указательным пальцем в почти горизонтальном положении; при этом должна быть хорошо видна вся поверхность питательной среды с культурой бактерий. 2.Простерилизовав петлю, безымянным пальцем и мизинцем правой руки (остальные пальцы правой руки заняты петлей) вынимают из пробирки ватную пробку и так держат ее во время последующих манипуляций; 3. Вынув пробку, стерилизуют края пробирки, обжигая их на пламени горелки, 4. Затем погружают петлю в пробирку, слегка касаясь внутренней поверхности стекла, для того, чтобы остудить петлю. 5.Остудив петлю, берут ею небольшое количество культуры (избыток культуры излишен) для приготовления мазка, стараясь не захватить при этом питательной среды; 6.Вынув петлю, опять обжигают край пробирки, а также слегка обжигают и пробку, 7. Пробкой закрывают пробирку. 8.Не выпуская петли из рук, ставят пробирку в штатив и приступают к приготовлению мазка . 3. Забор биологического материала с поверхности питательной среды в чашке Петри: 1. Для извлечения культуры с целью приготовления мазка чашку Петри берут в левую руку в горизонтальном положении; большим и указательным пальцами приоткрывают крышку чашки Петри, при этом должна быть хорошо видна вся поверхность питательной среды с культурой бактерий. 2.Простерилизовав петлю, вносят ее в чашку, слегка касаясь внутренней поверхности крышки чашки Петри, чтобы остудить петлю 3. .Остудив петлю, берут ею небольшое количество культуры для приготовления мазка, стараясь не захватить при этом питательной среды; 4.Вынув петлю, закрывают чашку и переворачивают ее вверх дном. Контрольные вопросы 1. Какие методы иммунологических исследований Вам известны? 2.Что изучает клиническая иммунология? 3.Сформулируйте основные принципы организации иммунологических лабораторий? 4.Какие показатели периферической крови определяют в иммунологических лабораториях? 5. Что такое инбредные животные? 6. Почему в качестве инбредных животных в основном используют лабораторных мышей? Список литературы: Обязательная:
Дополнительная:
|