иипи. Lavrinenko,Babina_fiziol krovi-КРИ. Учебнометодическое пособие В. А. Лавриненко А. В. Бабина Новосибирск, 2015 2 Учебнометодическое пособие физиология крови для студентов кри предназначено для студентов го курса биологического отделения совместного Китайскороссийского института
 Скачать 1.91 Mb.
|
|
КОАГУЛЯЦИОННЫЙ ГЕМОСТАЗ Белки плазмы крови. Большинство белков, участвующих в свертывании крови, называются плазменными факторами свертывания и обозначаются римскими цифрами. Порядок обозначения обусловлен исторической последовательностью их открытия. Буквой а обозначают активные формы факторов свертывания, в большинстве своем представляющие сериновые протеолитическме ферменты. Включение системы свертывания представляет серию последовательно протекающих событий — каскад биохимических реакций, в котором каждое последующее звено зависит от предыдущего. Активные формы факторов способны активировать неактивную форму следующего вцепи реакций фактора, вызывая ограниченный протеолиз двух — четырех пептидных связей (рис. 3). Биологический смысл каскада ферментативных реакций cостоит в том, что события в нем развиваются с самоускорением. Каждая следующая стадия происходит значительно быстрее, чем предыдущая. Иными словами, в каскадных реакциях достигается значительное усиление первичного сигнала При нарушении целостности кровеносных сосудов отрицательно заряженная поверхность коллагена субэндотелия также, как поверхность активированных тромбоцитов, является высокоаффинной для ряда белков свертывания крови, ив первую очередь для фактора XII и высокомолекулярного кининогена (ВМК), находящегося в комплексе с прекалликреином и фактором XI. Спонтанно активированный на поверхности фактор Ха стимулирует образование фермента калликреина, который по принципу положительной обратной связи усиливает активацию фактора XII. Аналогичное действие оказывает плазмин. Фактор Ха активирует фактор XI. Образованием фактора Ха завершается контактная стадия свертывания крови. Фактор Ха стимулирует активацию фактора IX, который превращает X в фактор Ха внутренний механизм свертывания крови. При глубоком повреждении сосудистой стенки и окружающих тканей, а также под действием адреналина и при некоторых патологических состояниях в кровоток поступают тромбопластические вещества, представляющие комплекс белка — тканевого фактора с фосфолипидами. Они активируют фактор, который превращает фактор X в фактор Ха внешний механизм свертывания крови. Фактор Ха представляет собой физиологический активатор протромбина. Превращение протромбина в тромбин и далее фибриногена в фибрин является общим путем для внешнего и внутреннего механизмов свертывания. Только 10% протромбина превращается в тромбин за счет активации внутреннего 78 механизма. Более полная активация фактора Х происходит под действием внешних активаторов. Из рис. 3 видно, что необходимым компонентом гемостатического процесса является отрицательно наряженная поверхность фосфолипидов. Связывание с этой поверхностью — важный способ концентрирования белков свертывания крови. В этом процессе участвуют концевые области белков-факторов XII, XI, Х, VII, X, II. При активации их в ферменты концевая и С-концевая области (в последней локализован остаток серина активного центра) остаются соединенными дисульфидными мостиками (рис. 4), то есть ферменты оказываются связанными с поверхностью вблизи соответствующих субстратов. Только тромбин, для которого концентрация субстрата, фибриногена, в крови исключительно высокая лишается специфических участков связывания с каталитической поверхностью. Важная роль принадлежит регуляторным белкам, ускоряющим реакции, которые приводят к образованию тромбина (ВМК, тканевой фактор, факторы V и VIII) или замедляют их (белок S). Реакции каскада свертывания контролируются ингибиторами. Среди них исключительное значение имеет гепарин, ускоряющий действие антитромбинов. Ингибиторы не проявляют высокой избирательности в отношении протеаз плазмы крови, с которыми они образуют стехиометрические (1:1) довольно прочные комплексы. Исключение составляет «a 2 -макроглобулин, образующий с протеазами комплекс, включающий две молекулы фермента. РЕГУЛЯЦИЯ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ Регуляция свертывания крови осуществляется различными путями на биохимическом и клеточном уровне и при участии нейрогормональных механизмов. 79 Биохимическая регуляция Этот вид регуляции проявляется прежде всего в виде системы положительных и отрицательных обратных связей каскада биохимических реакций, направленных на образование тромбина. Определяющим моментом такой регуляции является порог концентраций реагирующих соединений. Тромбин, возникающий в результате активации протромбина, способен повышать кофакторные свойства регуляторных белков, факторов V и VIII путем ограниченного протеолиза их молекул, усиливая активацию фактора X и протромбина. При достаточно высоком уровне тромбина в крови, превышающем ингибиторный потенциал антитромбинов, тромбин сам ограничивает собственную активацию тем, что вызывает дальнейший протеолиз фактора аи а, снижая их кофакторную способность, и активирует фактор XIV. Фактор Ха гидролизует белки факторов V, аи (рис. 3) и стимулирует фибринолиз. Тромбин, инактивируется эндотелиальными клетками путем иммобилизации на их поверхности через посредство белка тромбомодулина. При этом он лишается свертывающей активности, но резко увеличивает способность активировать фактор VIV плазмы крови. Проявлением биохимической регуляции на клеточном уровне является регуляция тромбоцитарно-сосудистого гемостаза. Тромбоксан А 2 индуцирует агрегацию тромбоцитов, а простациклин эндотелия ингибирует их агрегацию. Регуляция агрегации тромбоцитов опосредуется этими двумя соединениями через их действие на аденилатциклазу тромбоцитов. Простациклин стимулирует аденилатциклазу и повышает уровень циклического АМФ (ц-АМФ), в то время как тромбоксан А 2 подавляет повышение ц-АМФ. Вместе повреждения сосудистой стенки, лишенном слоя эндотелиальных клеток, резко снижен биосинтез и секреция 80 простациклина, и тромбоциты беспрепятственно контактируют с компонентами субэндотелия. Это приводит к активации фосфолипазы мембран тромбоцитов, образованию тромбоксанаА 2 и, следовательно, усилению агрегации на поверхности сосудистой стенки. Нейрогуморальная регуляция Свертывание крови, как любой физиологический процесс, находится под контролем нейрогуморальной регуляции. Этот контроль осуществляется при непосредственном участии ферментов, гормонов, медиаторов и других физиологически активных веществ, модулирующих ключевые реакции, которые определяют состояние тромбоцитов, сосудистой стенки и превращения плазменных белков, компонентов свертывающей и противосвертывающей систем крови. Изменения химического состава крови воспринимаются рецепторами сосудистой стенки и по афферентным путям передаются в ретикулярную формацию, оттуда нисходящие импульсы направляются к эффекторным органам. Именно в ретикулярной формации происходит интеграция вегетативных функций и процесса свертывания крови. Процесс свертывания крови регулируется также условно-рефлекторным путем. Рефлекторно-гуморальная регуляция как свертывания крови, таки поддержания ее жидкого состояния осуществляется парасимпатическими симпатическим отделами вегетативной нервной системы, а также системой гипоталамус-гипофиз-кора надпочечников. Конечный результат действия симпатической нервной системы обеспечивает преимущественно свертывающий эффект, парасимпатической — противосвертывающий. На начальных этапах гемостаза симпатическая нервная система участвует в защитной реакции организма от кровопотери, обеспечивая повышение свертывания крови. В период ограничения тромбообразования и начала лизиса тромба парасимпатическая нервная система осуществляет противосвертывающий эффект. 81 Эффекторным органом, обеспечивающим процесс свертывания крови, в первую очередь является печень, где происходит синтез большинства свертывающих факторов и их ингибиторов. За счет изменения проницаемости сосудистой стенки в кровь поступают тромбопластические вещества, стимулирующие активацию внешнего механизма свертывания крови, а также активатор плазминогена. Из тучных клеток, расположенных в соединительной ткани походу нервов и сосудов, выделяются содержащиеся в их гранулах гепарин, гистамин и серотонин. Важным моментом рефлекторно-гуморальной регуляции свертывания крови является порог чувствительности рецепторов. Раздражение рецепторов рефлексогенных зон кровеносных сосудов физиологически активными соединениями, непосредственно не участвующими в биохимической регуляции каскада свертывания (адреналин, серотонин, ацетилхолин и др, вызывают наряду с другими вегетативными реакциями изменения системы свертывания крови. Впервые в 1958 г. Б.А. Кудряшовым и сотрудниками были сформулированы представления о возбуждении противосвертывающей системы в ответ на раздражение хеморецепторов сосудов ферментом тромбином. Позднее в опытах с перфузией изолированных органов было показано, что не только тромбин, но и другие компоненты системы свертывания крови, такие, как претромбины 1 и 2, трипсин, гепарин, фракция белков контактной стадии свертывания крови, антиплазмин активируют противосвертывающую систему, в то время как плазмин (фибринолитический фермент) оказывает действие, подобное адреналину и серотонину, вызывая активацию свертывающей системы. Противосвертывающая система контролируется преимущественно парасимпатической нервной системой, однако в отдельных ситуациях например, при венозном стазе) участвует симпатический отдел вегетативной нервной системы. 82 В поддержании жидкого состояния крови и ее свертывания важная роль принадлежит системе гипоталамус-гипофиз-кора надпочечников. Во всех адаптивных реакциях организма, при стрессе, в поддержании постоянства внутренней среды эта система является важным звеном нейрогуморальной регуляции. Усиленная секреция адреналина, АКТГ и глюкокортикоидов изменяют гормональный статус организма. Адреналин стимулирует повышенное свертывание крови, индуцируя агрегацию тромбоцитов и повышая уровень тромбопластических агентов. Однако он обеспечивает и выброс в кровь из сосудов и тканей активатора плазминогена. Кроме того, стимулированное адреналином появление тромбина в достаточной концентрации активирует противосвертывающую систему, что приводит к повышению в крови уровня гепарина, образующего комплексные соединения с белками крови и аминами. АКТГ обеспечивает поддержание высокого уровня гепарина, стимулируя его выброс из тканевых депо и уменьшение интенсивности выведения из кровотока. Реактивность свертывающей и противосвертывающей систем крови зависит от исходного состояния организма и определяется не столько спецификой раздражителя, сколько общим нейрогуморальным ответом на него. 83 ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ ФИЗИОЛОГИЯ КРАСНОЙ КРОВИ Цель ознакомиться с методиками подсчета эритроцитов и гемоглобина у человека. Задачи 1) определить гематокрит 2) определить количество эритроцитов 3) определить концентрацию гемоглобина 4) рассчитать цветной показатель. Оборудование спирт, йод, вата, стерильный скарификатор, камера Горяева, покровное стекло, процентный раствор NaCl, пипетки на объем не менее 5 мл, капилляры Сали, раствор цитрата натрия, центрифуга для определения гематокрита, линейка, трансформирующий раствор, стандартный раствор гемоглобина с известной концентрацией гемоглобина (120 гл, фотоэлектрокалориметр (ФЭК), кюветы толщиной 10 мм и 3 мм. Анализ функций системы крови у человека широко применяется в процессе физиологических исследований в спортивно-медицинской практике (для изучения здоровья спортсменов. При мышечной работе кровь в соответствии с повышением интенсивности обмена веществ обеспечивает значительное усиление дыхательной функции. Это проявляется в увеличении кислородной емкости крови. О ней судят по числу эритроцитов и количеству гемоглобина. Большие нагрузки, вызывающие выраженные изменения кислотно-щелочного равновесия в плазме крови, могут быть причиной временного уменьшения числа эритроцитов в связи с разрушением их оболочек, что стимулирует восстановительные процессы. 84 Работа 1. Забор крови из пальца Правильное получение капиллярной крови является одним из решающих условий, обеспечивающих точность и воспроизводимость результатов. Общее время, затрачиваемое на взятие крови, не должно превышать 2–3 минут. Во взятой крови должны отсутствовать признаки свертывания. Ход работы Вымойте руки с мылом в проточной воде, высушите их. Забор крови производите из большого или безымянного пальца левой руки (допустимо получать кровь из любого другого пальца. Берущий кровь должен пользоваться резиновыми перчатками. Кожу подушечки пальца протрите ватным тампоном, смоченным процентным раствором спирта, и дождитесь ее высыхания. Левой рукой слегка сдавите палец в области предполагаемого укола. В правую руку возьмите стерильный скарификатор, ориентируя его строго перпендикулярно поверхности кожи вместе укола. Наиболее удобным местом прокола кожи является точка слева от срединной линии на некотором расстоянии от ногтя. Укол производите на всю глубину острия иглы, рассекая при этом кожу поперек дактилоскопических линий. Первую каплю крови удалите, потому что она содержит случайные примеси, лимфу и поврежденные форменные элементы. Далее забирайте кровь на необходимые анализы. После окончания забора крови к месту прокола приложите ватный тампон, смоченный спиртом или раствором йода. Забор крови осуществляйте каждый разв специальные стеклянные капилляры (для стандартизации процесса взятия крови. При этом капилляры предварительно обработайте антикоагулянтом – веществом, препятствующим свертыванию крови. Антикоагулянтами являются гепарин или раствор лимоннокислого натрия (цитрата натрия. 85 Работа № 2. Определение гематокрита Гематокрит – это показатель, характеризующий соотношение форменных элементов и плазмы крови. Гематокрит – доля объема крови, которую занимают форменные элементы. Он определяется входе центрифугирования цельной крови в капилляре в специальной центрифуге. Ход работы Для определения гематокрита произведите забор крови из пальца работа) в специальный капилляр. Капилляр обязательно обработайте антикоагулянтом – гепарином или раствором цитрата натрия. Капилляр заполните кровью на 7 / 8 его длины (при этом в капилляр не должны попадать пузырьки воздуха. Закупорьте его специальной замазкой с того конца, через который брали кровь. Поместите капилляры с кровью в ротор центрифуги таким образом, чтобы закупоренные концы были направлены кнаружи от оси вращения и упирались в резиновую прокладку. Центрифугируйте в течение 5 минут. Определите гематокрит (Г) по специальной шкале или с помощью линейки. В последнем случае измерьте высоту столбика эритроцитов (В э ) и высоту столбика плазмы (В п ). Рассчитайте гематокрит (как процент форменных элементов от всего объема крови) по формуле В э Г = –––––––– × 100. В э + В п Рекомендации по оформлению протокола работы Полученные результаты определения гематокрита занесите в протокол опытов, оцените их, исходя из того, что показатели нормы гематокрита для здорового человека таковы 43 % для женщин, 45 % – для мужчин. Такое состояние носит название нормоцитемии. Если относительный объем форменных элементов составляет менее 43%, то это 86 признаки олигоцитемии, если более 45 %, то полицитемии. Увеличение гематокрита наблюдается при эритроцитозе, уменьшение – при эритропении или микроцитозе (уменьшение размера эритроцитов) на фоне неизменной концентрации эритроцитов. Теоретически гематокрит должен увеличиваться при макроцитозе (увеличение размера эритроцитов, но последний наблюдается только на фоне выраженнойэритропении. Новорожденные имеют высокий гематокрит, составляющий в среднем 57 %. Дальнейшая динамика этого показателя соответствует изменениям количества эритроцитов в периферической крови. Знакомство с устройством камеры Горяева Камера Горяева представляет собой специальное устройство для подсчета форменных элементов крови. На ее поверхность нанесена сетка, разделяющая пространство на квадраты большие и маленькие. Рис. 5. Камера Горяева: а – вид сверху б – вид сбоку в сетка 87 Камера Горяева представляет собой толстое прямоугольное стекло с двумя сетками, выгравированными на его поверхности (рис. 5). Сетки отделены одна от другой поперечной канавкой во избежание затекания жидкости. Двумя глубокими продольными канавками сетки отделены от стеклянных прямоугольных пластинок, к которым притирают шлифованное покровное стекло. Плоскость поверхности этих пластинок находится на расстоянии 0,1 мм выше плоскости, в которой нанесены сетки. Камера состоит из 225 больших квадратов. Сто квадратов не разлинованы каждый 25-ти больших квадратов разделен каждый на 16 малых объемом 1/4000 мкл. Во избежание двукратного подсчета клеток, находящихся на линиях сетки, пользуются правилом буквы Г считаются клетки, относящиеся к данному квадрату и лежащие внутри него и на левой и верхней границе клетки, пересекающие правую и нижнюю границу, не подсчитываются. Работа № 3. Определение количества эритроцитов в крови Задание 1. Подсчет количества эритроцитов в камере Горяева Принцип метода состоит в подсчете эритроцитов в камере Горяева. Для уменьшения концентрации форменных элементов и создания удобной для подсчета их концентрации кровь предварительно разводится стандартным образом. Ход работы Пипеткой отмерьте 4 мл разводящего раствора (процентный раствори вылейте всухую пробирку. Капилляр Сали обработайте раствором цитрата натрия. Из прокола пальца (работа № 1) выпустите свежую каплю крови, приставьте к ней кончик капилляра Сали и наполните его до отметки 0,02. Это соответствует объему 0, 02 мл, или 20 мкл. Вытрите кончик капилляра и 88 выпустите кровь в пробирку с разводящим раствором. Полученное таким образом разведение крови – 1:200. После тщательного перемешивания раствора крови небольшой каплей заполните подготовленную с притертым стеклом камеру Горяева. Предварительно камеру промойте водой и насухо вытрите. На участок камеры, где нанесены сетки, уложите обезжиренное покровное стекло, при этом нижняя поверхность камеры должна находиться на третьих пальцах обеих рук, двумя вторыми пальцами придерживайте ее спереди. Двумя пальцами притрите покровное стекло, плавно продвигая его по поверхности прямоугольных пластинок до появления цветных колец Ньютона в местах соприкосновения покровного стекла с поверхностью пластинок камеры. Каплю исследуемой жидкости пипеткой поместите перед щелью, образованной покровным стеклом и пластинкой камеры Горяева с нанесенной сеткой. Капля должна заполнить камеру самотеком (под действием капиллярных сил. Следите, чтобы в пространстве над сеткой не было пузырьков воздуха и избытка жидкости. До начала подсчета оставьте счетную камеру на 1-2 мин для осаждения форменных элементов. Камеру положите на столик микроскопа и настройте его на малое увеличение (объектив враз, окуляр - вили раз. Подсчет производите при несколько опущенном конденсоре. Хорошую контрастность обеспечивает фазово-контрастное устройство. Эритроциты считайте в пяти больших квадратах, состоящих из 16-ти малых (5x16 = 80), расположенных по диагонали. Для записи результатов рекомендуется предварительно начертить на листе 5 больших квадратов, разлинованных на 16 клеток, записывать найденное число эритроцитов в каждую из них. При подсчете необходимо помнить правило буквы Г. Подсчитав число эритроцитов в 80-ти маленьких квадратах (N), рассчитывают число клеток в 1 мкл (мм) крови (X). Для этого учитываются разведение враз, объем камеры над одним маленьким квадратиком в 89 1/4000 мкл и то, что клетки подсчитывались в 80-ти таких квадратах. Таким образом, формула для вычисления количества эритроцитов следующая Nх4000х200 80 Полученное количество эритроцитов можно также выразить в количестве на л крови (умножением полученного количества на 10 6 ), что является стандартной размерностью этого показателя. Рекомендации по оформлению протокола работы Выводы делаются исходя из того, что в норме количество эритроцитов должно быть таким 3,6-4,5-10 12 кл/л - для женщин 4,5-5- 10 12 кл/л - для мужчин. После небольшой нагрузки - 5-5,5-10 12 кл/л. Сразу после рождения количество эритроцитов составляет около 6,0- 10 12 кл/л (допускаются колебания в пределах 5,4-7,2-10 12 кл/л). С конца первых - начала вторых суток жизни обычно происходит снижение числа эритроцитов в крови, наиболее выраженное на й день. Минимального значения этот показатель достигает к 2-3 мес, а затем несколько увеличивается ив дальнейшем (с го мес) поддерживается на уровне взрослых. Если количество эритроцитов выше нормы, то это явление называется эритроцитозом, если оно меньше, то налицо эритропения, или анемия. Увеличение количества эритроцитов в крови (эритроцитоз) встречается при ложном эритроцитозе), а также при усилении эритропоэза на фоне неизменной интенсивности гемолиза (истинный эритроцитоз).Уменьшение количества эритроцитов в крови может наблюдаться при гемодилюции ложная эритропения). |