электрокалориметрическим способом Пипеткой отмерьте 8 мл разводящего раствора (процентный раствор, перенесите всухую пробирку. Далее добавьте 1 капилляр Сали крови, что составляет 20 мкл. Затем измерьте оптическую плотность на ФЭКе при красном светофильтре в кювете толщиной мм. Предварительно нужно выставить ноль по разводящему раствору. Показания снимайте полевой красной шкале. Полученный результат оптической плотности нужно умножить на 10 7
, в итоге получается количество эритроцитов в 1 мкл (мм) крови. Рекомендации по оформлению протокола работы Полученную величину сопоставьте с нормальными показателями, оцените функциональное значение эритроцитов в переносе газов крови. Работа № 4. Определение содержания гемоглобина Для определения содержания (Н) гемоглобина используется гемоглобинцианидный метод. Принцип метода состоит в том, что к крови добавляется специальный трансформирующий раствор, содержащий сильный окислитель (цианид, при взаимодействии с которым эритроциты разрушаются, гемоглобин выходит в раствори образует окрашенное соединение гемоглобин-цианид. Интенсивность окраски пропорциональна количеству гемоглобина и фиксируется на ФЭКе или спектрофотометре. Ход работы В пробирку пипеткой перенесите 5 мл трансформирующего раствора. Заберите из пальца кровь капилляром Сали до метки 0,02 и выпустите в раствор. Раствор крови в трансформирующем растворе аккуратно, но тщательно перемешайте и оставьте на 10–15 мин при комнатной температуре для полного развития окраски (раствор остается стабильным в
91 течение более 24 ч. Таким же образом подготовьте пробу со стандартным раствором гемоглобина 5 мл трансформирующего раствора и один капилляр стандартного раствора гемоглобина (120 гл. Далее производят измерение оптической плотности опытной и стандартной проб на ФЭКе при длине волны нм (зеленый светофильтр) в кювете толщиной мм. Предварительно выставляется ноль по трансформирующему раствору. Поскольку содержание гемоглобина в стандартном растворе известно, содержание гемоглобина в опытной пробе рассчитывают в соответствии с пропорцией ст – 120 гл оп – Х гл, где ст – оптическая плотность стандартной пробы оп – оптическая плотность опытной пробы. При использовании спектрофотометра определение оптической плотности проводят при длине волны 540 нм в кювете толщиной мм. Содержание гемоглобина рассчитывают по формуле
Hb (гл) = 367,7D, где D– оптическая плотность раствора. Рекомендации по оформлению протокола работы Полученные результаты занесите в тетрадь протоколов опытов, оцените их и сделайте заключение, исходя из того, что нормальное содержание гемоглобина в крови (нормохромемия) человека – 120–140 гл для женщин, 130– 150 гл для мужчин. Повышение содержания гемоглобина – гиперхромемия, снижение – олигохромемия. Снижение содержания гемоглобина обычно наблюдается при эритропении, повышение – при эритроцитозе. Содержание гемоглобина после рождения составляет 210 гл (180–240 гл. Дальнейшая динамика этого показателя соответствует количественному изменению эритроцитов.
92 Работа № 5. Расчет среднего содержания гемоглобина водном эритроците и цветного показателя крови Расчетные показатели среднего содержания гемоглобина водном эритроците и цветного показателя крови – индексы красной крови – используются для выводов о насыщенности эритроцитов гемоглобином. Расчет среднего содержания гемоглобина водном эритроците производится делением количества гемоглобина (гл) на число эритроцитов (кл/л). В норме содержание гемоглобина водном эритроците колеблется между 27 и 33,3 пг (пг = 10
–12
г. Число 33 пг водном эритроците принято за цветной показатель, ЦП, равный 1. Расчет цветного показателя (ЦП) крови производится из соотношения гемоглобина в норме и гемоглобина испытуемого и содержания гемоглобина в норме и гемоглобина испытуемого Число эритроцитов в норме(кл/л) / Число эритроцитов испытуемого кл/л)
ЦП =
--------------------------------------------------------------------------------------------- . Содержание НЬв норме (гл) / Содержание НЬиспытуемого (гл) Рекомендации по оформлению протокола работы Полученные результаты занесите в тетрадь протоколов опытов, сделайте вывод, исходя из того, что в норме цветной показатель крови колеблется от 0,86 до 1,1 (нормохромия). В случае если он ниже 0,86, то
налицо гипо-хромия, а если выше 1,1, то налицо гиперхромия. Сделайте общие выводы о кислородной емкости крови.
93 ФИЗИОЛОГИЯ ЛЕЙКОЦИТОВ Повышение защитной функции крови при мышечной работе выражается в увеличении числа лейкоцитов (миогенный лейкоцитоз. При небольших нагрузках это увеличение незначительно и происходит в связи с ростом числа лимфоцитов. При больших нагрузках миогенный лейкоцитоз может быть выраженным, с явным увеличением числа молодых форм – палочкоядерных и юных лейкоцитов (как следствие раздражения костного мозга) Оборудование спирт, йод, вата, стерильный скарификатор, капилляры Сали, раствор цитрата натрия, процентный раствор уксусной кислоты с добавлением метиленового синего, камера Горяева, покровное стекло, пипетка на объем 1 мл, обезжиренные предметные стекла (обезжиривание стекол производят смесью Никифорова), краска
Романовского-Гимза, фосфатный буфер (рН = 7,4), этиловый спирт. Работа № 6. Определение количества лейкоцитов в крови Определение количества лейкоцитов, как и эритроцитов, осуществляется в камере Горяева. Разведение крови производят враз- процентной уксусной кислотой. При этом эритроциты разрушаются и не мешают счету. Ход работы Пипеткой отмерьте 0,4 мл разводящего раствора (процентного раствора уксусной кислоты, подкрашенного метиленовым синими перенесите вчистую пробирку. Забор крови производите в соответствии с правилами, описанными выше (Физиология красной крови, лабораторная работа № 1). Кровь забирайте в капилляр Сали, наполняя его самотеком до метки (0,02).
94 Кончик капилляра вытрите и перенесите кровь в пробирку с разводящим раствором. Получается разведение 1:20. Подсчет количества лейкоцитов производите в пяти больших квадратах камеры Горяева ( Физиология красной крови, лабораторная работа № 1). Расчет количества лейкоцитов Х в 1 мкл крови осуществляется с учетом разведения, объема камеры и числа подсчитанных квадратов
Nх4000х200 Х
80 Полученное количество лейкоцитов обычно выражают в количестве на л крови (результат умножается на 10 6
). Рекомендации по оформлению протокола работы Результаты занесите в тетрадь протоколов опытов. Сделайте выводы, исходя из того, что в норме у взрослого человека содержание лейкоцитов в крови составляет 4-9-10 9
кл/л, при мышечной работе - 18-10 9
кл/л. Увеличение количества лейкоцитов в крови называется лейкоцитозом, а уменьшение - лейкопенией. Снижение количества лейкоцитов в крови всегда имеет патологический характер. Повышение
количества лейкоцитов в крови может быть физиологическим, то есть возникать у здоровых людей лейкоцитоз пищевой, миогенный, при беременности, и патологическим. Число лейкоцитов в периферической крови впервые дней жизни составляет 18-20-10 9
кл/л, в двухнедельном возрасте снижается до 9-12-
10 9
кл/л, а в последующие периоды онтогенеза не отличается от уровня у взрослых. Работа № 7. Изучение морфологии лейкоцитов Исследование морфологии лейкоцитов производят микроскопированием мазков крови, окрашенных по Романовскому. Принцип метода окраски мазков состоит в избирательном поглощении
95 веществами клетки трех красящих веществ – азура, метиленового синего и эозина. Азур имеет амфотерно-основную реакцию, метиленовая синька – щелочную, эозин – кислую. Задание 1. Приготовление мазков крови Ход работы Каплю крови поместите на край чистого обезжиренного предметного стекла и сделайте мазок с помощью другого предметного стекла сошлифованным краем. Вторым предметным стеклом сошлифованным краем прикоснитесь к капле крови и, как только капля, коснувшись подвижного стекла, разойдется по линии соприкосновения стекол, верхним стеклом, держа его под углом 45° (рис. 6), проведите по первому стеклу в направлении от капли, чтобы получился мазок. Мазок должен быть достаточно тонким, чтобы клетки крови расположились в один слой в тоже время следует избегать чрезмерного надавливания (для избежания деформации лейкоцитов. Приготовленные мазки высушивают на воздухе, а затем фиксируют и окрашивают с использованием нескольких способов. Рис. 6. Приготовление мазка крови
96 Задание 2. Фиксация и окраска мазков Ход работы Есть два способа фиксации и окраски мазка. Способ 1. Свежеприготовленный, высушенный на воздухе мазок зафиксируйте метиловым или этиловым спиртом. Для этого мазок поместите горизонтально в ванночку на подставки и капайте спирт так, чтобы он полностью покрывал мазок крови. Подождите несколько минут до испарения спирта. Окраску фиксированных мазков производите свежеприготовленным водным раствором краски Романовского-Гимза. Для этого на 1 мл воды добавьте одну каплю краски (мкл. Для получения хорошей окраски значение рН воды должно составлять 6,8–6,9. Поэтому желательно использовать вместо воды фосфатный буфер с рН – 6,8–6,9. На один мазок потребуется 2–3 мл водного раствора краски. Окрашивание производите нанесением водного раствора краски каплями на горизонтально расположенный на подставках в ванночке мазок до полного покрытия мазка. Красьте в течение 15–20 мин, после чего смойте краску холодной водопроводной водой и высушите мазок на воздухе. Способ 2 (ускоренный. При окраске мазка ускоренным способом мазок не фиксируется предварительно. Свежеприготовленный, высушенный на воздухе мазок поместите горизонтально в ванночку на подставки и наносите неразведенную краску Романовского – Гимза каплями,
чтобы она полностью покрывала мазок крови, при этом капли считайте. Подождите 2 мини после этого нанесите столько же капель дистиллированной воды. Смешайте воду с краской аккуратным покачиванием мазка и красьте 10 минут. После этого краску смойте холодной водопроводной водой и высушите мазок на воздухе.
97 Окрашенный и высушенный мазок исследуйте под микроскопом сим- мерсией. На мазок нанесите каплю иммерсионного масла, осторожно опустите объектив (х) до соприкосновения с маслом, затем объектив приподнимите на 1 мм. При этом силы поверхностного натяжения удерживают масло в контакте с линзой. После этого настройте поле зрения, медленно опуская объектив до появления контуров клеток. Для окончательной фокусировки используйте микровинт. В поле зрения (рис. 7) основную площадь занимают безъядерные эритроциты и от одного до нескольких лейкоцитов с ядрами. Лейкоциты крупнее эритроцитов по размерам ядра окрашены в фиолетовый цвет. Нейтрофилы имеют бледно-розовую цитоплазму с нейтрофильными гранулами, окрашивающимися в розово-фиолетовый цвет. Форма ядра нейтрофилов зависит от их зрелости. Палочкоядерные нейтрофилы, являющиеся более молодыми клетками, имеют ядро в виде изогнутой палочки. У зрелых нейтрофилов ядро вследствие перекручивания разделено наряд сегментов, связанных очень тонкими, иногда почти незаметными нитями. Это полиморфноядерные, или сегментоядерные, нейтрофилы. Рис. Морфологические особенности лейкоцитов крови 1 – базофил;
2, 12 – эритроциты 3 – эозинофил; 4, 7 – моноциты 8, 9, 10 – лимфоциты
98 5 – палочкоядерный нейтрофил; 6 – сегментоядерный нейтрофил; 11 – тромбоциты У эозинофилов и базофилов цитоплазма окрашена очень слабо. Эозинофилы имеют ярко окрашенные красные гранулы, окрашивающиеся эозином. Ядро эозинофилов по структуре близко к ядру нейтрофилов более молодые клетки имеют палочковидное ядро, более зрелые – сегментированное. Однако сегментация ядра выражена меньше. Ввиду относительной малочисленности эозинофилов учет палочкоядерных и сегментоядерных форм в отдельности не производится. Базофилы в цитоплазме содержат крупные темные фиолетовые или ультрамариновые гранулы, часто закрывающие отдельные участки ядра.
Ядро базофилов неправильной формы, окрашивается в фиолетово-розовый цвет. Лимфоциты и моноциты, составляющие группу агранулоцитов, не содержат зернистости в цитоплазме. Клетки лимфоцитов округлые, с круглым или овальным ядром, которое окружено или очень узким (малые лимфоциты, или более широким (средние и большие лимфоциты) пояском цитоплазмы. Цитоплазма лимфоцитов голубая. Часто она видна лишь с одной стороны от ядра (в виде серпа. В некоторых клетках и этот серп незаметен, и тогда малый лимфоцит имеет вид голого ядра. Моноциты крупнее лимфоцитов, большей частью круглой, иногда неправильной формы, с хорошо выраженной цитоплазмой. Цитоплазма моноцитов серо-голубая. Ядро сравнительно велико и имеет выступы и углубления. Обычно оно бобовидной формы. Интенсивность окраски ядра моноцитов слабее, чем лимфоцитов. Двигаясь помазку, исследуйте лейкоциты в каждом поле зрения. При этом рекомендуется пересекать мазок по схеме, представленной на рис. 8.
99 Рис. Схема движения помазку крови при исследовании морфологии лейкоцитов Произведите исследование 100 лейкоцитов, идентифицируя каждый лейкоцит подсчитайте количество лейкоцитов в каждом классе. Поскольку исследуется 100 клеток, результаты выражаются в процентном количестве лейкоцитов каждого типа среди всех лейкоцитов крови. Рекомендации по оформлению протокола работы Результаты внесите в таблицу и сопоставьте полученные результаты с нормой. В случае отклонения количества определенных типов лейкоцитов от нормы сделайте вывод об относительном нейтрофилезе или нейтропении, эозинофилезе или эозинопении и т. д. (таблица. Таблица. Морфологический состав лейкоцитов крови в % лейкоцитарная формула) Количество, % Палочкоядер ные нейтрофилы
Сегментоядерны е нейтрофилы Эозинофилы Базофилы Лимфоциты Моноциты Норма
2-5 55-68 1-4 0,25-0,75 25-30 6-8 Таблица. Изменения морфологического состава лейкоцитов крови Содержание, % Нейтрофилы Эозинофилы Базофилы Лимфоциты Моноциты Увеличение Нейтрофилез Эозинофилез
Базофилез Лимфоцитоз Моноцитоз Снижение
Нейтропения Эозинопения Базофилопения Лимфопения Моноцитопения Для вывода о морфологическом составе лейкоцитов крови процентного выражения часто оказывается недостаточно и используется
100 пересчет на абсолютное содержание клеток крови, исходя из подсчитанного количества всех лейкоцитов в крови. При отклонениях морфологического состава в абсолютных единицах от нормы (таблица) делается вывод об абсолютном нейтрофилезе или нейтропении и т. д. Таблица. Морфологический состав лейкоцитов крови в абсолютных единицах (лейкоцитарный профиль) Количество, кл/л
Палочкоядерн ые нейтрофилы
Сегментоядер ные нейтрофилы Эозинофилы Базофилы Лимфоциты Моноциты Норма
180-400 3065-5600 100-250 1-75 1200-2800 200-600 Сделайте общее заключение о защитной роли лейкоцитов. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОЭ, ГРУППЫ КРОВИ ПО СИСТЕМЕ АВО, РЕЗУС-
ФАКТОРА Цель ознакомиться с методиками определения скорости оседания эритроцитов, групп крови и резус-фактора. Задачи
1) определить скорость оседания эритроцитов (СОЭ);
2) определить группу крови по системе АВО;
3) определить резус-фактор. Оборудование спирт, йод, вата, стерильный скарификатор, прибор
Панченкова, эмалированные пластинки с лунками, стеклянные палочки, стандартные сыворотки для определения групп крови и резус- фактора, процентный раствор цитрата натрия. Работа № 8. Определение СОЭ Метод основан на определении высоты столба плазмы крови, стабилизированной цитратом натрия, над осевшими зач форменными
101 элементами, среди которых преобладают эритроциты. Для этого используется капилляр Панченкова. Ход работы Капилляром из прибора Панченкова (рис. 9) наберите раствор цитрата натрия до метки Р (50) и выпустите в лунку эмалированной пластинки. Затем последовательно заберите 2 капилляра крови до метки К (0). Кровь быстро смешайте с цитратом натрия в лунке и наберите снова в капилляр до метки 0 (К. Верхний конец капилляра закройте пальцем, чтобы раствор крови не вытек перенесите капилляр в прибор Панченкова. Сначала нужно установить нижний конец капилляра в нижнее резиновое кольцо прибора, а затем – в верхний. Рис. 9. Прибор Панченкова: а – штатив с капиллярами б – капилляр КР метки на шкале капилляра. Кровь в капилляре прибора оставьте нач при комнатной температуре. По истечении часа измерьте высоту столба плазмы над эритроцитами в мм. Эта величина и составляет показатель СОЭ. Рекомендации по оформлению протокола работы Полученные результаты занесите в тетрадь протоколов опытов, оцените их и сделайте заключение, исходя из того, что в норме СОЭ составляет для мужчин 1–10 мм/ч, для женщин 2–15мм/ч.
102
СОЭ зависит от концентрации эритроцитов (увеличивается при эритропении, уменьшается при эритроцитозе), вязкости крови (понижается при сгущении крови, соотношения различных фракций белков крови увеличивается при повышении концентрации глобулинов и фибриногена.
СОЭ увеличивается при беременности (в связи с повышением концентрации фибриногена. У новорожденных наблюдается замедление
СОЭ, обусловленное эритро-цитозом и низкой концентрацией фибриногена. В дальнейшем значение СОЭ соответствует уровню у взрослых. Работа № 9. Определение группы крови по системе АВО Подгруппами крови АВО понимают различные сочетания антигенов
(агглютиногенов), находящихся в эритроцитах, и антител по отношению к ним (агглютининов), находящихся в плазме крови. Существует два групповых агглютиногена (Аи В) и два агглютинина
(α и β). Разные сочетания этих свойств образуют четыре группы крови О
(I), А (II), В (III) и АВ (IV). Для установления группы крови используются стандартные сыворотки, содержащие определенный титр агглютининов или цоликлоны. Метод определения группы крови по системе АВ0 основан насмеши- вании капли крови с раствором, содержащим агглютинины – антитела против антигенов Аи В (агглютиногенов). В качестве таких растворов служат моноклональные анти-А и анти-В антитела, поликлональные иммунные сыворотки или сыворотки крови лиц сои группами крови. Ход работы Исследование группы крови производите в цельной крови, забранной из пальца. На планшет в разные лунки индивидуальными пипетками
103 нанесите растворы анти-А и анти-В по одной большой капле (0,1 мл. Рядом с каплями антител нанесите по одной маленькой капле исследуемой крови (мл. Стеклянной палочной (разными концами в каждой лунке) смешайте кровь с реагентами. Заходом реакции наблюдайте визуально при легком покачивании пластины в течение 3 минут. Результат реакции в лунках может быть либо положительным, либо отрицательным. Положительный результат выражается в агглютинации (склеивании) эритроцитов. Агглютинаты наблюдаются в виде мелких красных агрегатов, быстро склеивающихся в крупные хлопья. При отрицательной реакции капля остается равномерно окрашенной в красный цвет, агглютинаты в ней не обнаруживаются. Таблица. Интерпретация результатов реакции агглютинации Результат реакции с раствором агглютинина Принадлежность исследуемой крови анти-А анти-В к группе крови
Скачать 1.91 Mb.