диагностика сифилиса. Диагн_сиф. Учебное пособие для врачей Екатеринбург 2013
 Скачать 1.29 Mb.
|
|
Министерство здравоохранения Российской Федерации ГБОУ ВПО Уральский государственный медицинский университет ФГБУ Уральский научно-исследовательский институт дерматовенерологии и иммунопатологии ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА СИФИЛИСА Учебное пособие для врачей Екатеринбург 2013 УДК: Лабораторная диагностика сифилиса Учебное пособие для врачей. – Екатеринбург УГМА, 2013. – 82 с Учебное пособие составлено в соответствии с Федеральными государственными требованиями к структурам основных профессиональных образовательных программ послевузовского профессионального образования (интернатура, ординатура, утвержденных приказами Минздрав- соцразвития России от 5.12.2011 г. № н, № н, включает новые регламентирующие документы по обследованию на сифилис, материалы собственных клинических наблюдений, направлено на совершенствование профессиональных навыков врачей по интерпретации результатов лабораторных исследований у пациентов данным заболеванием. Учебное пособие предназначено для интернов, ординаторов и врачей, обучающихся в системе дополнительного профессионального образования, по специальностям дерматовенерология, клиническая лабораторная диагностика. Рекомендовано УМО по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России в качестве учебного пособия для системы послеву- зовского профессионального образования врачей. Cоставители: д.м.н. Н.В. Кунгуров, д.м.н. МА. Уфимцева, к.м.н. И.Ф. Вишневская, к.м.н. Ю.М. Бочкарев, д.м.н. Н.П. Евстигнеева, д.м.н. Л.К. Глазкова, Е.П. Гурковская, к.м.н. В.И. Сурганова, Е.В. Ютяева, Н.В. Полякова Ответственный редактор д.м.н., доц. МА. Уфимцева Рецензенты: д.м.н. З.Р. Хисматуллина, д.м.н. ЮС. Шишкова ISBN 978-5-89895-627-1 © УГМА, УрНИИДВиИ, 2013 г Содержание Введение Термины и определения Тема 1. Идентификация Treponema pallidum Методы прямого выявления Treponema Вопросы для самоконтроля Тестовые задания для самоконтроля Эталоны ответов к тестовым заданиям Тема 2. Серологические методы диагностики сифилиса Серологические методы диагностики, рекомендуемые для исследования сыворотки крови Алгоритм серологической диагностики сифилиса ......................................25 Ложноположительные серологические реакции на сифилис Лабораторные тесты для подтверждения или исключения нейросифилиса Лабораторная диагностика врожденного сифилиса Вопросы для самоконтроля Тестовые задания для самоконтроля Эталоны ответов к тестовым заданиям Клинические задачи для самоконтроля Эталоны ответов к клиническим задачам Приложение 1. Классификация сифилиса по МКБ-10 Приложение 2. Клиническая классификация сифилиса..............................53 Приложение 3. Перечень работ, при выполнении которых проводятся обязательные предварительные и периодические медицинские осмотры (обследования) работников Приложение 4. Роль серологических тестов в различных клинических ситуациях Приложение 5. Требования к предварительной подготовке пациента к обследованию Список сокращений ........................................................................................79 4 Введение Согласно приказу Минздравсоцразвития России от 23.07.2010 г. № н Об утверждении Единого квалификационного справочника должностей руководителей, специалистов и служащих, раздел Квалификационные характеристики должностей работников в сфере здравоохранения, подготовка дерматовенерологов должна включать освоение вопросов клиники, диагностики, лечения и профилактики инфекций, передаваемых половым путем. При этом большое внимание должно уделяться изучению сифилиса, как социально значимой инфекции. Особенностью современной эпидемиологической ситуации по заболеваемости сифилисом является замедление темпов снижения заболеваемости, высокий удельный вес скрытых форм, увеличение числа лиц с ней- росифилисом, что повышает актуальность серологической диагностики инфекции. В последние годы разработаны и внедрены в практику новые диагностические тест-системы, появились новые регламентирующие документы по обследованию, лечению, клинико-серологическому контролю над эффективностью терапии больных сифилисом. Эти материалы не нашли достаточного отражения в учебной литературе. В пособии представлены тематические планы семинарских занятий по разделу Лабораторная диагностика сифилиса, основные положения темы, вопросы для самоконтроля, тестовых заданий и клинические задачи. Пособие окажет помощь в освоении интернами и ординаторами данного раздела учебной программы. Учебное пособие разработано на основе следующих законодательных и регламентирующих документов в сфере здравоохранения и образования федерального закона РФ от 21.11.2011 г. № 323-ФЗ Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации федерального закона РФ от 29 декабря 2012 г. N 273-ФЗ Об образовании в Российской Федерации Распоряжение Правительства РФ № рот. Стратегии развития медицинской науки в Российской Федерации на период до 2025 года приказа Минздравсоцразвития России от 07.07.2009 г. № н Об утверждении квалификационных требований к специалистам с высшими послевузовским медицинскими фармацевтическим образованием в сфере здравоохранения приказа Минздрава России от 15 ноября 2012 г. N н Об утверждении порядка оказания медицинской помощи населению по профилю «дерматовенерология»»; приказа Минздравсоцраз- вития от 23.04.2010 г. № н О номенклатуре специальностей специалистов с высшими послевузовским медицинскими фармацевтическим образованием в сфере здравоохранения Российской Федерации приказа Минздравсоцразвития России от 23.07.2010 г. № н Об утверждении Единого квалификационного справочника должностей руководителей, специалистов и служащих, раздел Квалификационные характеристики должностей работников в сфере здравоохранения Приказ Министерства здравоохранения РФ № 87 от 26.03.2001 года О совершенствовании серологической диагностики сифилиса приказ МЗ РФ № 291 от 30.07.2001 года О мерах по предупреждению распространения инфекций, передаваемых половым путем Приказ Минздравсоцразвития РФ от 12.04.2011 N н Об утверждении перечней вредных и (или) опасных производственных факторов и работ, при выполнении которых проводятся обязательные предварительные и периодические медицинские осмотры (обследования, и Порядка проведения обязательных предварительных и периодических медицинских осмотров (обследований) работников, занятых на тяжелых работах и на работах с вредными и (или) опасными условиями труда стандартов оказания медицинской помощи больным сифилисом (стационарной и амбулаторно-поликлинической), утвержденные приказами Минз- драва России клинических рекомендаций Российского общества дермато- венерологов и косметологов России (2012 г.). Амплификация'>Термины и определения Амплификация (от лат. amplificatio – усиление, увеличение, в молекулярной биологии – процесс образования дополнительных копий участков хромосомной ДНК, как правило, содержащих определённые гены либо сегменты структурного гетерохроматина. Антигены (от греч. génos – рождение, происхождение, высокомолекулярные вещества, которые при введении в организм животных и человека вызывают образование специфических реагирующих сними антител. Амплификация (от лат. amplificatio – усиление, увеличение) – процесс образования дополнительных копий участков хромосомной ДНК. Вируле́нтность от лат. virulentus – ядовитый) – степень способности инфекционного агента (штамма микроорганизма или вируса) заражать организм. Иммуноблоттинг (от англ. blot пятно) высокочувствительный метод выявления специфических антител в сыворотке крови, основанный на электрофорезе исследуемого материала в жидком геле. Иммуноферментный анализ (от англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) – лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов, в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала Комменсализм (от лат. com – с, вместе и mensa – стол, трапеза буквально у стола, за одним столом) – способ совместного существования (симбиоза) двух разных видов живых организмов, при котором один из партнёров этой системы (комменсал) возлагает на другого (хозяина) регуляцию своих отношений с внешней средой, ноне вступает с ним в тесные взаимоотношения. Ложноотрицательный результат – отрицательный результат, полученный в тест-системе или серологическом тесте для образца, который в самом деле является положительным. Ложноположительный результат – положительный результат, полученный в тест-системе или серологическом тесте для образца, который в самом деле является отрицательным. Люминесценция (от лат. lumen, род. падеж luminis – свети суффикс, означающий слабое действие) – нетепловое свечение вещества, происходящее после поглощения им энергии возбуждения. Молекулярно – биологические методы – методы обнаружения, основанные на определении нуклеиновых кислот возбудителя(ей) в биопробах пациентов, условно подразделяются на методы амплификации нуклеиновых кислот (ДНК, РНК, а также разнообразные методы гибридизации. Пла́зма кро́ви от греч. plásma – оформленное) – жидкая часть крови, в которой взвешены форменные элементы. Макроскопически представляет собой однородную несколько мутную (иногда почти прозрачную) желтоватую жидкость, собирающуюся в верхней части сосуда с кровью после осаждения форменных элементов. Гистологически плазма является межклеточным веществом жидкой ткани крови. Плеоцитоз – это повышенное содержание клеточных элементов в цереброспинальной жидко сти. Полимера́зная цепна́я реакция – экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе). Праймер (англ. primer) – это короткий фрагмент нуклеиновой кислоты (олигонуклеотид), комплементарный ДНК- или РНК-мишени, служит затравкой для синтеза комплементарной цепи с помощью ДНК-полимеразы, а также при репликации ДНК. Реакции агглютинации – это реакции, где принимают участие антигены в виде частиц (микробные клетки, эритроциты и другие корпускулярные антигены, которые склеиваются антителами и выпадают в осадок. Реакция иммобилизации бледных трепонем (синоним TPI – Treponema pallidum immobilization test, реакция Нельсона – Мейера) – серологическая реакция, предложенная Нельсоном и Мейером (R.A. Nelson, ММ в 1949 г. для диагностики сифилиса, в основе которой лежит способность сыворотки больного сифилисом обездвиживать бледные трепонемы. Реакция непрямой, или пассивной, агглютинации – метод выявления антигенов и антител, основанный на способности эритроцитов, на поверхности которых предварительно адсорбированы антигены или антитела, агглютинироваться в присутствии гомологичных сывороток или соответствующих антигенов. Реакции преципитации основаны на фенoмене образования видимого осадка (преципитата) или общего помутнения среды после взаимодействия растворимых либо находящихся в коллоидном дисперсном состоянии антиген с антителами. Реакция связывания комплемента (реакция Борде – Жангу по имени бактериологов Ж. Борде (J. Bordet) и О. Жангу (О. Gengou), 1901), серологическая реакция, основанная на свойстве комплекса антиген – антитело фиксировать свободный комплемент. Серологические методы – (от лат. serum – сыворотка, logos – наука) методы, с помощью которых изучают реакцию (антиген – антитело) организма на внедрение чужеродных микроорганизмов, регистрируемые на основе одного из феноменов, сопровождающих формирование иммунного комплекса (преципитация, агглютинация, связывание комплемента). Скрининг (от англ. screening – отбор, сортировка) – стратегия в организации здравоохранения, направленная на выявление заболеваний у кли- нически бессимптомных лиц в популяции. Спирохеты (от греч. speira – виток и chaite – волосы) – порядок бактерий. Специфичность метода – доля здоровых, для которых получен отрицательный результат в данной тест-системе от общего количества обследованных здоровых людей. Сы́воротка крови – плазма крови, лишённая фибриногена. Сыворотки получают либо путём естественного свёртывания плазмы (нативные сыворотки, либо осаждением фибриногена ионами кальция. В сыворотках сохранена большая часть антитела за счёт отсутствия фибриногена резко увеличивается стабильность. Флуоресценция – (от названия минерала флюориту которого впервые была обнаружена флуоресценция, и лат. – escent – суффикс, означающий слабое действие) – кратковременная люминисценция. Флюорохромы – это вещества, которые поглощают падающий свет определенной длины волны и излучают поглощенную энергию в виде света большей длины волны. Чувствительность метода – доля больных, для которых получен положительный результат в данной тест-системе, от общего количества обследованных больных 8 Treponema pallidum – от греч. trepo – вращаться, и nema – нить от лат. pallidum – бледная. Тема 1. Идентификация Treponema В результате изучения темы обучающийся должен знать следующие разделы основные принципы лабораторных методов выявления возбудителя сифилиса показания к использованию методов дифференциально-диагностические признаки патогенных и непато- генных трепонем. Обучающийся должен уметь осуществлять забор материала для исследования на Treponema pallidum; • подготовить препарат для микроскопического исследования проводить микроскопию в темном поле зрения, идентифицировать Treponema pallidum; • интерпретировать полученные результаты лабораторных исследований. При изучении темы необходимо обратить внимание наследующие разделы. История развития лабораторной диагностики возбудителя сифилиса, в том числе • открытие возбудителя сифилиса Ф. Шаудином и Э. Гоффманом (F. Schaudinn, E. Hoffmann) в 1905 г внедрение в практику метода темного поля австрийским иммунологом и патологом К. Ландштейнером (K. Landsteiner) в 1906 г • использование метода для выявления Treponema pallidum (A. Coles, 1909 г • развитие экспериментального сифилиса (работы И.И. Мечникова и Э. Ру (E. Roux), Е. Бертарелли (E. Bertarelli); • использование биологического метода (в 1906 г. Е.Бертарелли (E. Bartarelli) установил возможность заражения сифилисом кроликов вперед- нюю камеру глаза, в 1907 г. У. Пароди (U. Parodi) – в яичко. Свойства Treponema pallidum, определяющие особенности лабораторных методов её выявления, и, имеющие дифференциально-диагности- ческое значение бактерия спиралевидной формы 8-14 (6-18) завитков, отличающиеся равномерностью, упругостью, сохраняют свою форму при давлении характерны многообразные плавные движения поступательное, вращательное, волнообразное, особенно характерны сгибательное и маятникообразное размножается поперечным делением, цикл развития составляет 30-33 часа слабо воспринимает красители культивирование на искусственных питательных средах сопровождается утратой их вирулентности и характерных диагностических морфологических признаков оптимальные условия существования низкое содержание кислорода факультативный анаэроб, при температуре 37 о С; • в лабораторных условиях тканевые патогенные Treponema pallidum можно сохранить путем пассажей на кроликах хорошо размножаются в лимфоидной, нервной, соединительной ткани Treponema pallidum высокочувствительна к дезинфицирующим веществам, к высушиванию Treponema pallidum чувствительна ко многим антибиотикам формы выживания, персистенции в организме человека формы, зернистые формы. Дифференциальная диагностика с непатогенными трепонемами – комменсалами (Treponema refringers, Treponema phagedenis (reiteri) обитатели урогенитального тракта Treponema denticola – ротовой полости, для которых характерна большая толщина, меньшее число завитков, малая подвижность, потеря формы при давлении. Дифференциальная диагностика с патогенными трепонемами – возбудителями тропических эндемических трепонематозов: возбудитель бед- желя (Treponema endemicum), фрамбезин (Treponema perteneum), пинты (Treponema carateum). 5. Возбудители тропических трепонематозов идентичны Treponema pallidum по морфологическим, генетическим, антигенным свойствам, различия в географической распространенности, эпидемиологии, клиническим проявлениям вызываемых заболеваний. Методы прямого выявления Treponema pallidum 1. Микроскопия нативного препарата в темном поле зрения является основным методом детекции Treponema pallidum. Принципы метода при микроскопии лучи, освещающие объект, не попадают в объектив микроскопа, поле зрения остается темным, плотные частицы (трепонемы) попадая в луч света, отражают свети становятся хорошо видны на темном поле (рис. Метод позволяет выявлять только типичные спиралевидные формы возбудителя, позволяет определять характер, количество завитков, виды движений трепонем. Чувствительность метода варьирует от 79% до 97%. Метод наиболее эффективен при первичном, вторичном сифилисе, раннем врожденном сифилисе – при наличии очагов поражения, содержащих не менее 10 6 трепонем. Рис. 1. Исследование Treponema pallidum в темном поле Материалом для исследования является серозная жидкость с поверхности эрозивных или язвенных твердых шанкров, эрозированных или скарифицированных папул. Выявление возбудителя во многом зависит от качества забора материала. При наличии в материале для исследования посторонней микрофлоры, лейкоцитов, эритроцитов обнаружить Treponema pallidum среди светящихся плотных частиц не представляется возможным. Техника забора материала для исследования поверхность эрозии язвы) очищается физиологическим раствором при помощи марлевого тампона, свежую каплю серозного отделяемого получают путем механического раздражения сифилида стеклянной лопаточкой или путем сдавливания двумя пальцами основания эрозии. Полученное серозное отделяемое переносят на предметное стекло, смешивают с равным количеством физиологического раствора, накрывают покровным стеклом. Препарат исследуют при увеличении Метод микроскопии нативного препарата в темном поле зрения позволяет быстро диагностировать заболевание у острозаразного больного Причины отрицательных результатов исследования 1) небольшое количество бледных трепонем в тканевой жидкости си- филида в результате предварительного местного или системного лечения 2) длительное существование элемента (регресс сифилида); 3) наличие другой бактериальной флоры, лейкоцитов, эритроцитов, эпителиальных клеток 4) дефект забора материала. По показаниям исследование повторяют несколько раз, на этот период назначают примочку с физиологическим раствором. 2. Метод прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) Данный метод не входит в стандарты обследования на сифилис в России, но включен в Европейские стандарты диагностики и лечения заболеваний, передаваемых половым путем. Принцип метода основан на явлении люминесценции – способности некоторых веществ под влиянием падающего на них света испускать лучи с другой длиной волны, что обнаруживается по характерному свечению. Под флюоресценцией понимают свечение, возникающее в момент облучения возбуждающим светом и прекращающееся после его окончания. Для придания флюоресцирующих свойств каким-либо веществом используют флюоресцирующие красители – фюорохромы. Наиболее часто используется ФИТЦ – флюоресцеина изотиоционат (зеленое свечение. Антитела, меченные флюорохромом, называют конъюгатом, они сохраняют способность реагировать сгомологичным антигеном. Комплекс «антиген+анти- тело выявляют по характерному свечению при люминесцентной микроскопии. Метод ПИФ рекомендуется для исследования материала на наличие бледных трепонем с очагов в полости рта, прямой кишки, где возможно наличие комменсальных (сапрофитных) трепонем (Европейские стандарты диагностики и лечения заболеваний, передаваемых половым путем, 2010 г. Кроме того, материалом для исследования могут быть любые тканевые жидкости, суспензии тканей, полученные при биопсии и аутопсии. Метод амплификации нуклеиновых кислот – полимеразная цепная реакция (ПЦР). Данный метод не входит в стандарты обследования на сифилис в России, но включен в Европейские стандарты диагностики и лечения заболеваний, передаваемых половым путем. Принцип метода мишенью для идентификации биологического объекта является нуклеиновая кислота. Метод базируется на принципе комплементарности нуклеиновых кислот (способность цепей ДНК распознавать друг друга с высокой степенью специфичности. В образец, содержащий инфекционный агент, вносятся синтезированные нуклеотидные последовательности (праймеры), комплементарные генетическому материалу искомого возбудителя. При наличии даже небольшого количества возбудителя запускается процесс размножения и копирования (амплификация) в пробирке определенных участков ДНК возбудителя в условиях повторяющихся температурных циклов с целью получения большого количества копий. Копии могут быть выявлены далее обычными методами (праймеры несут метку, например фермент, визуализирующийся при проведении цветной реакции. Метод обладает абсолютной специфичностью и позволяет выявлять возбудителя при малом его количестве в образце pallidum характризуется генетической стабильностью, полная последовательность генома возбудителя определена, что позволяет рассматривать метод ПЦР в диагностике сифилиса как перспективный, позволяющий выявить Treponema pallidum при её существовании, в том числе в виде атипичных форм, при осложненных шанкрах. Объектом исследования могут быть тканевая жидкость, пунктат лимфо- узлов, спинномозговая жидкость, гомогенаты тканей внутренних органов. Биологический метод (заражение кроликов применяется в исследовательской практике. Метод используется также для получения антигенного материала при постановке реакции иммобилизации бледных трепо- нем в серологических лабораториях. |