диагностика сифилиса. Диагн_сиф. Учебное пособие для врачей Екатеринбург 2013
 Скачать 1.29 Mb.
|
|
Вопросы для самоконтроля. Основные морфологические признаки Treponema pallidum, учитывающиеся при идентификации возбудителя. Почему не используются методы окраски по Граму раствором метиленового синего для обнаружения Treponema pallidum? 3. Устойчивость Treponema pallidum в окружающий среде. Чувствительность Treponema pallidum к дезинфицирующим средствам. Заражение сифилисом при переливании крови от больного. Устойчивость Treponema pallidum при низких температурах. 7. Группы риска заражения сифилисом с учетом биологических свойств Treponema pallidum. 8. В чем заключаются основные принципы методов микроскопии в темном поле зрения, прямой иммунофлюоресценции, ПЦР? 9. Техника забора материала для выявления Treponema pallidum. 10. Тактика обследования больного для выявления Treponema pallidum при осложненных шанкрах. 11. Причины отрицательных результатов исследования на наличие Treponema pallidum. Тестовые задания для самоконтроля Выберите один или несколько правильных ответов. МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ НА TREPONEMA PALLIDUM 1) кровь) серозная жидкость с поверхности язвенных твердых шанкров 3) гнойное отделяемое с твердого шанкра) тканевая жидкость с эрозивных папул) чешуйки папулезных сифилидов 2. МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ TREPONEMA PALLIDUM 1) бактериологический) микроскопия препарата, окрашенного по Граму 3) микроскопия препарата, окрашенного по Романовскому-Гимзе 4) микроскопия нативного препарата в темном поле зрения 5) метод прямой иммунофлюоресценции 3. TREPONEMA PALLIDUM ЯВЛЯЕТСЯ ПРЕДСТАВИТЕЛЕМ 1) простейших 2) бактерий 3) риккетсий 4) вирусов 5) сапрофитов. ЧИСЛО ЗАВИТКОВ СПИРАЛИ TREPONEMA PALLIDUM 1) 8-14 2) 16-20 3) 6-8 4) 4-5 5) 2-3 5. TREPONEMA PALLIDUM МОЖЕТ БЫТЬ ОБНАРУЖЕНА СО СЛЕДУЮЩИХ СИФИЛИДОВ 1) твердый шанкр 2) лейкодерма 3) розеола 4) эрозированные папулы слизистой ротовой полости 5) гуммозная язва 14 6. ТРОПИЧЕСКИЕ ТРЕПОНЕМАТОЗЫ 1) донованоз 2) фрамбезия 3) беджель 4) пинта 5) мягкий шанкр. ПРИ ЗАБОРЕ МАТЕРИАЛА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ НА TREPONEMA PALLIDUM ПРИ ОСЛОЖНЕННОМ ТВЕРДОМ ШАНКРЕ (ГНОЙНЫЙ НАЛЕТ) НЕОБХОДИМО НАЗНАЧИТЬ 1) примочку с раствором фурацилина 2) обработку раствором перекиси водорода 3) примочку с физиологическим раствором 4) мазь с антибиотиком 5) без дополнительных назначений. ХАРАКТЕРИСТИКА TREPONEMA PALLIDUM 1) морфологически отличается от возбудителей тропических трепонема- тозов 2) слабая восприимчивость красителей) рост на искусственных питательных средах 4) многообразие движений 5) образование цист, форм. ЦИКЛ ДЕЛЕНИЯ ПАТОГЕННОЙ TREPONEMA PALLIDUM 1) 6 – 8 часов 2) 10 – 12 часов 3) 15 – 20 часов 4) 30 – 33 часа) 35 – 40 часов. ДЛЯ ОЧИЩЕНИЯ ПОВЕРХНОСТИ ТВЕРДОГО ШАНКРА ПЕРЕД ИССЛЕДОВАНИЕМ НА TREPONEMA PALLIDUM ПРИМЕНЯЕТ- СЯ(ЮТСЯ) РАСТВОРЫ) борной кислоты 2% 2) хлорида натрия 0,9% 3) фурацилина 0,02% 4) хлорида натрия 10% 5) хлоргексидина 0,05% 15 11. ФАКТОРЫ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ, ДЕЙСТВУЮЩИЕ ГУБИТЕЛЬНО НА TREPONEMA PALLIDUM 1) низкие температуры) высыхание) дезсредства 4) УФ–излучение 5) высокая температура. РЕАКЦИЯ, ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ КАКОТОРОЙ НЕОБХОДИМ ДЛЯ ПОСТАНОВКИ ДИАГНОЗА СИФИЛИС ПЕРВИЧНЫЙ СЕ- РОНЕГАТИВНЫЙ 1) РИБТ 2) МРП 3) ИФА 4) РИФ) РПГА 13. ГОД ОТКРЫТИЯ TREPONEMA PALLIDUM 1) 1890 г) 1905 г) 1910 г) 1895 г) 1907 г. 14. У больной 23 лет на внутренней поверхности малых половых губ имеются множественные болезненные, неправильной формы эрозии размером несколько миллиметров, покрытые серозно-гнойным отделяемым. Температура тела 38 0 с, озноб. Паховые лимфоузлы в норме. ИССЛЕДОВАНИЯ ДЛЯ ИСКЛЮЧЕНИЯ/ПОДТВЕРЖДЕНИЯ СИФИЛИСА) микроскопическое исследование отделяемого эрозии в темном поле) микроскопия отделяемого эрозии, окрашенного по Граму 3) посев отделяемого эрозии на твердые питательные среды) микроскопия отделяемого эрозии, окрашенного метиленовым синим) посев отделяемого эрозии на жидкие питательные среды. К ПАТОГЕННЫМ ПРЕДСТАВИТЕЛЯМ РОДА TREPONEMA ОТНОСЯТСЯ) Treponem a denticola 2) Treponema refringers 3) Treponema phagedenis 4) Treponema reiteri 5) Treponema pallidum Эталоны ответов к тестовым заданиям) 2, 4 2) 4, 5 3) 2 4) 1 5) 1, 4 6) 2, 3, 4 7) 3 8) 2, 4, 5 9) 4 10) 2 11) 2, 3, 4, 5 12) 2 13) 2 14) 1 15) Тема 2. Серологические методы диагностики сифилиса В результате изучения темы обучающийся должен знать перечень серологических реакций для диагностики сифилиса согласно стандартам оказания первичной медико-санитарной специализированной и специализированной медицинской помощи, утвержденные приказами Минздрава России назначение и принцип нетрепонемных реакций назначение трепонемных реакций принципы трепонемных реакций динамику серологических реакций по стадиям развития сифилиса роль серологических реакций в профилактике сифилиса. Обучающийся должен уметь назначать адекватный комплекс серологических реакций в соответствии с клинической ситуацией интерпретировать полученные результаты серологических реакций, в том числе, количественный вариант реакций. Серологические методы занимают ведущее место в лабораторной диагностике сифилиса, так как позволяют выявлять различные стадии инфекции (приложения 1, 2), скрытые формы сифилиса, нейросифилис, висцеральный сифилис проводить оценку эффективности лечения осуществлять профилактические мероприятия. Наличие значительного числа серологических реакций обусловлено следующими причинами • Treponema pallidum имеет сложный полиантигенный состав (в том числе более 30 белковых антигена с различной молекулярной массой, соответственно, в организме больного вырабатываются антитела различных классов и специфичности, при этом спектр их меняется в зависимости от длительности заболевания • серологические реакции имеют различную чувствительность и специфичность, отличия по сложности постановки. Чувствительность – доля больных, для которых получен положительный результат в этой тесте-си- стеме, от общего количества обследованных больных. Специфичность – доля здоровых, для которых получен отрицательный результат в данной тест-системе, от общего количества обследованных здоровых людей. История развития серологической диагностики сифилиса Днем начала лабораторной диагностики сифилиса считается 10 мая 1906 года – выступление доктора Альберта Вассермана на немецком научном обществе с докладом, посвященном реакции связывания комплемента с экстрактом печени новорожденных с врождённым сифилисом. Позднее были разработаны осадочные реакции (преципитации, флокуляции в 1922 г. реакция Р. Канав г. – реакция Закс-Витебского; в 1946 г. – микро- флокуляционный тест VDRL А. Харриса. Первая инструкция по применению реакции Вассермана в Советском Союзе была утверждена в 1928 г приказ о внедрении в практику микрореакции преципитации в 1985 г. Первый специфический трепонемный тест – реакция иммобилизации бледных трепонем (Нельсона–Майера), была использована в 1949 г. В последующие годы были разработаны различные варианты трепонемных тестов. В середине х годов была создана реакция пассивной гемаглютинации с целью выявления антител к T. Pallidum – РПГА (ТРНА) ее микромоди- фикация (МН TP), а позже ее модификация – ТРРА, где в качестве носителя использовались синтетические (желатиновые или полиэ- стироловые) частицы. В х годах был создан и практически применялся иммуноферментный анализ ИФА (ELISA) и его модификации. Одним из высокоэффективных методов диагностики сифилиса является имму- ноблоттинг, разработанный в конце прошлого века для определения иммуноглобулинов разных классов (IgG, M). Серологические методы диагностики, рекомендуемые для исследования сыворотки крови. Нетрепонемные (кардиолипиновые) тесты на сифилис Общая характеристика нетрепонемных тестов применяется антиген нетрепонемного происхождения – стандартизованный кардиолипиновый антиген позитивируются через 1–2 недели после образования первичной сифиломы имеют невысокую чувствительность (допри ранних формах сифилиса и допри поздних) – могут давать ложноположительные результаты (более 3 Преимущества техническая простота и быстрота получения результатов, низкая стоимость, возможность оценки активности сифилиса. Данные тесты выявляют антитела к кардиолипиновому антигену – аналогу липидам клеточной стенки Treponema pallidum или липидным компонентам поврежденных клеток тканей (аутоантигены). Нетрепонемные тесты (кроме РСК с кардиолипиновым антигеном) являются реакциями флокуляции, продукт реакции в виде преципитата или хлопьев оценивается визуально с количественной характеристикой от + до +4. При максимальной выраженности реакции проводят двукратные разведения плазмы или сыворотки для определения титра антител. Титром антител) считают последнее разведение, где обнаружен преципитат. Величина титра антител указывает на активность процесса. Антитела к липидным антигенам определяются в тестах через 2-3 недели после появления твердого шанкра, что является критерием выделения периодов первичного сифилиса серонегативного и первичного сифилиса се- ропозитивного. Максимальный титр антител к кардиолипину наблюдается вначале вторичного периода сифилиса с дальнейшим постепенным снижением при поздних формах инфекции тесты дают отрицательный результат примерно у 30% больных. По снижению титра антител к кардиолипину оценивают эффективность терапии. После лечения ранних форм сифилиса титр антител должен снизиться не менее чем в 4 раза в течение года, в большинстве случаев результаты нетрепонемных тестов становятся отрицательными. После лечения поздних форм сифилиса нетрепонемные тесты часто остаются положительные, при этом титры антител могут снижаться или оставаться неизмененными. Показания к применению нетрепонемных тестов проведение скрининга населения на сифилис определение активности течения инфекции (определение титрован- ти-тел); • контроль эффективности терапии (определение титров антител Виды нетрепонемных тестов на сифилис Реакция микропреципитации (РМП). Для исследования используют плазму крови, сыворотку, спинномозговую жидкость. Постановка проводится в неглубоких лунках планшета (рис. В них наносят 2-3 капли сыворотки крови или плазмы больного и добавляют одну каплю кардиоли- пинового антигена. Легким движением пластинку покачивают в течение 5 мин. Результаты реакции оценивают невооруженным глазом над источником света (обычная лампа. Результат считается положительным при появлении в лунке крупных хлопьев. Мелкие хлопья свидетельствуют о слабо- положительном или сомнительном результате. Рис. 2. Оценка результатов реакции микропреципитации VDRL (Veneral Disease Researeh Laboratory) – тест исследовательской лаборатории венерических заболеваний. Для тестирования используют сыворотку, спинномозговую жидкость. Реагенты смешивают на предметном стекле, комплексы антиген-антитело в форме коротких брусков выявляются при микроскопическом исследовании (Rapid Plasma Reagins) – быстрый плазмареагиновый тест. Для тестирования используют плазму или сыворотку. Тест выполняется на специальных кассетах с лунками. Антиген абсорбирован на мелких частицах угля. Комплексы антиген-антитело склеивают частицы угля в большие агрегаты – тест с толуидиновым красными непрогретой сывороткой (Toluidin Red Unheated Serum Test); RST – тест на скрининг реагинов (Reagin Screen Test); USR – тест на реагины с непрогретой сывороткой (Unheated Serum Реакция связывания комплемента (реакция Вассермана).Механизм реакции комплекс антиген-антитело связывает дозированный добавленный в систему комплемент морской свинки. Индикатором реакции является гемолитическая система (эритроциты барана с гемолитической сывороткой). Рис. 3. Оценка результатов реакции связывания комплемента реакция Вассермана) Степень позитивности реакции обозначают по задержке гемолиза (рис 3). Постановка сложна, реакция трудно поддается стандартизации. С 2006 г. РСК не входит в комплекс серологических реакций при диагностике сифилиса в России. Трепонемные тесты на сифилис Общая характеристика трепонемных тестов применяется антиген трепонемного происхождения чувствительность варьирует от 70 до 100% (в зависимости от вида теста и стадии сифилиса специфичность находится в диапазоне от 94 до 100%. РИФ, ИФА, иммуноблоттинг (ИБ) становятся положительными с й недели от момента заражения и ранее, РПГА и РИБТ – с 7–8-й. Преимущества: высокая чувствительность и специфичность. Трепонемные тесты выявляют антитела классов IgM и IgG к белковым антигенам Treponema pallidum, которые синтезируются в разный период заболевания, что имеет значение при определении стадии сифилиса. Трепонемные тесты являются диагностическими и непригодны для оценки результатов лечения, так как сохраняются положительными у пролеченных больных годами, а в некоторых случаях всю жизнь. В трепо- немных тестах возможно раздельное определение трепонемоспецифиче- ских IgM и трепонемоспецифических IgG. Трепонемоспецифические IgM появляются через 10-14 дней, достигают максимума через 1,5-2,5 месяца после заражения. Далее происходит снижение их количества с исчезновением через 18 месяцев, возможно сохранение их на низком уровне. Трепонемоспецифические IgG появляются на ой неделе после заражения. Максимальные значения достигаются через 1-2 года, после лечения исчезают в различные сроки в зависимости от стадии сифилиса после поздних форм сифилиса сохраняются всю жизнь. Клиническое значение определения IgM: • самые ранние антитела – свидетельствуют о заражении • индикаторы активности инфекции, появляются при клинических рецидивах являются свидетелями неэффективности лечения при длительном сохранении после лечения имеют диагностическое значение при врожденном сифилисе грудного возраста (имеют крупную молекулярную массу и не могут проникнуть через плацентарный барьер от матери). К трепонемным тестам относятся: Реакция связывания комплемента реакция Вассермана) с трепо- немным антигеном. С 2006 года согласно приказу МЗ РФ № 87 предусмотрен переход на более чувствительные современные стандартизованные трепонемные тесты. В реакции использовался ультраозвученный трепо- немный антиген из культуральной трепонемы, позже Treponema pallidum. РСК с кардиолипиновым антигеном и РСК с трепонемным антигеном были объединены и многие годы использовались как стандартный комплекс серологических реакций для диагностики сифилиса. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ – метод непрямой иммуно- флюоресценции. Антигеном являются цельноклеточные фиксированные Treponema pallidum. Комплекс «антиген-антитело» визуализируется при люминесцентной микроскопии препарата с помощью сыворотки против Ig человека, меченной флюорохромом. Результаты оценивают по интенсивности свечения от + до 4+. Модификации РИФ РИФ, РИФ-ц, РИФ-абс. РИФ характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью, однако реакция сложна и трудоемка в постановке. Рекомендуется использовать в качестве референс-метода. Иммуноферментный анализ (ИФА).Принцип метода выявление сорбированного на твердой фазе (лунки планшета) комплекса антиген-антитело с помощью сыворотки против Ig человека, меченной ферментом (пероксидазой) прицветной реакции с субстратом для фермента, учитываемой количественно спектрофотометрически. Антигены, используемые для ИФА: • лизатные, получают разрушением ультразвуком Treponema pallidum; • рекомбинантные белки с антигенными детерминантами, идентичные Treponema pallidum; • пептидные, химически синтезированные фрагменты белков Treponema Качество ИФА тест-систем зависит от качества использованного антигена, качества конъюгата. Ловушечный ИФА – выявление трепонемоспец- ифических IgM. На твердой фазе сорбированы антитела к IgM человека, которые улавливают в исследуемой сыворотке все IgM. Наличие среди связанных специфичных для Treponema pallidum выявляют с помощью антигенов Treponema pallidum, конъюгированных с ферментом. Постановка реакции автоматизирована. Результат по интенсивности цвета оценивается от + до 4+, с указанием титра антител, выраженном в коэффициенте позитивности. Анализатор иммуноферментных реакций (рис. Рис. 4. Анализатор иммуноферментных реакций Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА).Принцип метода агглютинация эритроцитов, сенсибилизированных трепонемным антигеном, в присутствии специфических противотрепонемных антител в исследуемой сыворотке. Результат оценивается визуально от + до 4+ с последующим определением титра антител (рис. 5). Рис. 5. Оценка результатов реакции пассивной гемагглютинации Рис. 6. Оценка результатов иммуноблоттинга Метод иммуноблоттингасочетает в себе иммуноферментный анализ с предварительным электрофоретическим разделением антигенов бледной трепонемы по молекулярной массе. Диагностическими являются иммуно- детерминанты 15, 17, 45, 47 кД. Результат реакции оценивается визуально рис. 6). Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ).Антигеном служат живые подвижные Treponema pallidum, полученные из 7-10 дневного орхита кролика. В РИБТ выявляются антитела иммобилизины, вызывающие обездвиживание бледных трепонем. Иммобилизины появляются только с вторичного периода сифилиса и сохраняются при поздних стадиях инфекции. Обязательным условием является исключение перед обследованием приема больным антибиотиков. Ответ дается в удельном весе иммобилизации отрицательный результат 21-30% сомнительный результат 31-50% слабоположительный результат 51-100% положительный результат. Тест рекомендован для референс-лабораторий. Метод иммунохемилюминесценции (ИХЛ), обладающий высокой чувствительностью и специфичностью (98–100%), дает возможность количественного определения уровня антител к возбудителю сифилиса, может быть использован для подтверждения сифилитической инфекции и скри- нинга. Ограничения применения не может быть использован для контроля эффективности терапии, может давать ложноположительный результат. Метод иммунохроматографии (ИХГ) позволяет проводить быстрое пределение содержания трепонемоспецифических антител к возбудителю сифилиса в образцах сыворотки и цельной крови без использования специального лабораторного оборудования и применяться при оказании первичной медико-санитарной помощи, в том числе по эпидемиологическим показаниям. Ограничения применения не может быть использован для контроля эффективности терапии, может давать ложноположительный результат. В обоих методах в качестве антигенов используются рекомбинантные липопротеины, полученные генно-инженерными методами, которые являются полными аналогами антигенов T.pallidum например антигены Tp15, Tp17, Tp47) и биосинтетический пептид TmрА. Показания к применению трепонемных тестов подтверждение положительных результатов нетрепонемных тестов подтверждение в случае расхождения результатов скринингового тре- понемного теста и последующего нетрепонемного теста, а также скринин- гового и подтверждающего трепонемных тестов 25 • проведение методами ИФА, РПГА скрининга отдельных категорий населения на сифилис (доноры, беременные, больные офтальмологических, психоневрологических, кардиологических стационаров, ВИЧ-инфи- цированные). Примечания: • трепонемные тесты не могут быть использованы для контроля эффективности терапии, т. к. антитрепонемные антитела длительно циркулируют в организме больного, перенесшего сифилис дают положительные результаты при невенерических трепонематозах и спирохетозах могут давать ложноположительные реакции у больных с аутоиммунными заболеваниями, проказой, онкопатологией, эндокринной патологией и при некоторых других заболеваниях. |