Современные методы иммунодиагностики инфекционных болезней. Учебное пособие. Удк. 57. 396 Васильев Д. А., Барышников П. И., Новиков Б. В

• Название: Учебное пособие. Удк. 57. 396 Васильев Д. А., Барышников П. И., Новиков Б. В
• Анкор: Современные методы иммунодиагностики инфекционных болезней.doc
• Дата: 26.12.2017
• Размер: 426 Kb.
• Имя файла: Современные методы иммунодиагностики инфекционных болезней.doc
• Тип: Учебное пособие; #13050
• Категория: Биология. Ветеринария. Сельское хозяйство
• страница: 2 из 9

1.Радиоиммунологический анализ (РИА)

Радиоиммунологический анализ (РИА) – метод, основанный на выявлении комплекса антиген-антитело с помощью радиоизотопной метки.

1.1.Введение

Радиоиммунологический анализ произвел революцию в ряде областей медицины (эндокринология), оказал преобразующее влияние на развитие гематологии и фармакологии. Его разработчикам в 1977 г. была присуждена Нобелевская премия. В основе метода лежит применение антигенов и антител, меченых радионуклидами. Такая метка позволяет с помощью современных приборов выявить и количественно определить содержание исследуемого вещества в различных тканях и биологических субстратах.
К преимуществам РИА относятся:

• 
  высокая чувствительность – способность измерительной системы регистрировать минимальные количества веществ;
  
• 
  высокая специфичность – способность системы измерять только одну, строго определенную субстанцию;
  
• 
  надежность – способность определить истинное количество вещества;
  
• 
  точность, характеризующая воспроизводимость получаемых результатов.
  

По этим параметрам РИА значительно превосходит классические биологические методы определения – РА, РСК, РНГА и другие (Гринин А. и др., 1983 г., 1984 г.; Чард Т., 1981; Ткачева Г. А. и др. 1983). Следует отметить, что РИА имеет много общего с ИФА, а принципиальным отличием является индикаторная метка: вместо фермента используется изотоп.

Основные принципы радиоиммуннологических методов разработаны в двух независимых научных центрах Нью-Йорка и Лондона. В 1960 году Yalow. R. и Bersols. опубликовали классическую работу по радиоиммунологическому определению содержания эндогенного инсулина в плазме крови человека, которая ознаменовала новый этап в области применения радионуклидов в биологии. Наибольшее распространение нашел метод РИА на твердофазных носителях, таких как целлюлоза, декстрин, полимеры и т. п. (Halonen P. et al., 1987, Moore, N. et al., 1982; Tevoarwerv Y. et al., 1980; Wide L.Porath. 1966.) Он был значительно упрощен и приобрел особую ценность, когда выяснилось, что в качестве твердой фазы для образования иммунных комплексов можно использовать обычные полистирол, поливинилхлорид и другие пластики, исходя из их сорбционной способности. Однако в каждом случае необходимо подбирать оптимальные условия постановки РИА, вследствие различия адсорбционных свойств разных партий используемых полимеров. Большое внимание уделяют автоматизации РИА, позволяющей не только сократить время анализа, но и повысить его чувствительность, специфичность, точность и воспроизводимость. Полная автоматизация была описана Ekins R. (1979 г.). Она включала не только обработку проб и подсчет результатов, но и оптимизацию процессов и параметров путем включения в систему компьютера. Более поздним подходом к автоматизации РИА являются разработки дискретных анализаторов и создание модульных систем, состоящих из нескольких модулей: разбавителя образцов, дозатора реагентов, фильтрации и другое (Bagschawa K. 1978 г.).

Методом РИА проводится определение различных веществ в биологических субстратах, где он превосходит другие лабораторные методы в плане чувствительности, стоимости анализа, затрат времени и возможности автоматизации. Он позволяет в ряде случаев определить компоненты тканевых экстрактов и жидкостей без их дополнительной очистки и выделения. По мнению А.Ф. Зыкина (1993), эта реакция в отличие от большинства применяемых иммунологических тестов дает возможность количественно определить содержание антигенов или антител в исследуемом образце. По данным указанного автора, в патологическом материале, пищевых продуктах, объектах внешней среды с помощью РИА можно в течение часов или минут выявить наличие возбудителя гепатита В, ботулинического и стафилококкового токсинов.

1.2.Принцип метода

1.2.1.Иммунологический аспект

С точки зрения взаимодействия антитела и антигена, метод РИА аналогичен серологическим реакциям, используемым в диагностике, и отличается от них способом индикации образования комплекса антиген-антитело.

При появлении «чужеродного» антигена, иммунологически отличающегося от собственных антигенов, в организме активируются определенные популяции лейкоцитов, выполняющие две основные функции иммунной защиты: захват, разрушение и элиминация крупных чужеродных структур (например, бактерий и вирусов) и формирование иммунного ответа, в том числе, выработка антител против этого антигена. Антитела, вырабатываемые к какому-либо антигену, являются специфичными, причем антитела, специфичные к одной и той же антигенной детерминанте антигена обладают идентичной структурой связывающего центра. Вследствие того, что относительно крупные белковые антигены, как правило, имеют несколько различных антигенных детерминант, в организме при иммунном ответе образуется достаточно широкий спектр специфичностей антител, что и обусловливает гетерогенность (неоднородность) популяции антител в организме. Кроме того, гетерогенность обусловлена также и собственно структурой связывающего центра антител. Образно говоря, связывание антитела с антигеном можно описать феноменом «замка и ключа». Антитело – «замок» связывает своими специфическими участками (связывающими фрагментами, центрами) только те антигены – «ключ», которые соответствуют конфигурации «замка». Если конфигурация «замка» достаточно свободна, диапазон используемых «ключей» возрастает, специфичность антител понижается. С наличием такой гетерогенности антител связана их перекрестная реактивность, которая означает, что некоторые антитела, имеющие очень низкое сродство к вызывающему иммунный ответ антигену, способны также образовывать иммунные комплексы с другими (не родственными) антигенами, имеющими структурно подобные антигенные детерминанты. Таким образом, чем менее специфично антитело, тем больше вероятность перекрестной реакции.

Большинство антител относятся к классу иммуноглобулинов «G», являющимися двухвалентными (имеющими два связывающих антиген центра). Это означает, что они способны взаимодействовать с двумя идентичными молекулами антигена. Антигены могут быть одно-, двух- или поливалентными (имеющими одну, две или более идентичных по структуре и специфичности антигенных детерминант). Валентность антител и антигенов определяет тип реакции, которая может происходить между ними в системе in vitro (в пробирках). Поливалентные антигены, соединяясь в комплексы с 2-х или поливалентными антителами, образуют полимолекулярные структуры, называемые приципитатами и агглютинатами. В случае, если существует избыток антител, образуемые комплексы, как правило, являются нерастворимыми. При классических реакциях РИА образуется растворимый комплекс.

1.2.2.Химический аспект

Как уже указывалось, в РИА сочетается специфичность, свойственная реакциям антиген-антитело, с чувствительностью и достаточной простотой, которые дает применение радиоактивной метки. В наибольшей степени эти преимущества сочетаются в конкурентном РИА. Для проведения этого анализа необходимо иметь специфические антисыворотки и меченые антигены при выявлении антигенов и специфические антигены и меченые радионуклидом антитела при выявлении антител.

При выявлении антигенов метод основан на конкуренции определяемого немеченого антигена с известным количеством меченого антигена за ограниченное количество добавленных в систему специфических антител.

При этом количество меченого антигена, который связывается в иммунных комплексах, обратно пропорционально количеству немеченого антигена, содержащегося в исследуемом материале. Оба конкурирующих взаимодействия представлены на следующей схеме:





1 – специфическое антитело

2 – меченый антиген.

3 – немеченый антиген.

4 – иммунный комплекс антитела 1 с меченым антигеном

5 – свободный меченый антиген.

6 – иммунный комплекс антитела немеченым антигеном

7 – свободный немеченый антиген.

С. Берсон и Я. Ялоу (1968) пользовались отношением активности связанной метки к активности свободной метки – коэффициент В/F, чтобы выразить связывание меченого антигена как функцию концентрации исследуемого антигена. Согласно закону действия масс К[Aт][ Аг] = [Аг Ат], где К – константа равновесия, при условии равновесия отношение связанного антигена к свободному В/F = [Аг Ат] / [Аг], где В – связанный антиген, F – свободный антиген. При типичной радиоиммунологической процедуре концентрация свободного антигена и находящегося в равновесии антитела описывается уравнениями [Аг] = [Aг_i – Aг Ат] и [Ат] = [Ат_i – Aг Ат], Аг_i и Ат_i – исходные концентрации компонентов. Отсюда истинное отношение связанного антитела к свободному антигену описывается:
В / F = [Aг Ат] / [Аг_i – Аг Ат]. Для РИА используется меченый радионуклидом антиген, который ведет себя также как холодный, поэтому
В*/F* = [Аг* Ат] / [Аг_i* – Аг*Ат], где Аг_i* – исходное количество меченого антигена, Аг* Ат – количество связанного с антителом меченого антигена. Источником радиоактивного Аг*Ат является Ат + Аг + Аг* = Аг*Ат + АгАт. Отсюда очевидно, что если концентрация немеченого Аг будет увеличена при постоянной концентрации меченого Аг*, то первый займет большее число связывающих мест антитела. Результатом этого, будет снижение концентрации связанного меченого антигена [Аг*Ат]. Следовательно, отношение В*/F* =[Аг*Ат] / [Аг_i* – Аг*Ат] должно уменьшаться по мере увеличения в реакционной смеси холодного антигена немеченого. Так как немеченый антиген получен от пациента, соотношение В*/F* отражает количество вещества присутствующего в изучаемой пробе. Изменение этого отношения максимально тогда, когда концентрация антигена мала по сравнению с концентрацией антитела.

При проведении РИА нельзя не учитывать следующие факторы. Специфичность метода может быть снижена из-за перекрестной реактивности антисывороток и гетерогенности антигена. Решающее значение при этом имеет способ получения антисывороток. В идеале хорошо было бы иметь моноспецифические антитела, но их технологически трудно получить. Для РИА считается достаточным 50 % связывание меченого антигена в отсутствии холодного антигена. Если константа равновесия является низкой, то количество антител, необходимых для адекватного связывания антигена, должно быть увеличено. Однако избыток свободных антител будет снижать действие холодного антигена в этой системе. Чувствительность данной системы будет низкой и в том случае, если меченый антиген будет иметь низкую удельную радиоактивность. В данной ситуации для достаточного связывания меченого антигена потребуется введение в систему большого количества антител.

В растворе, где присутствуют антигены (Аг) и специфические антитела (Ат), между ними устанавливается динамическое равновесие (по закону действия масс). В выше указанной реакции это динамическое равновесие можно выразить формулой:

, где
К – константа ассоциации или константа равновесия;
[Аг Ат] – концентрация комплекса антитела с антителом;
[Аг] – концентрация свободного антигена;
[Ат] – концентрация свободного антитела.