Современные методы иммунодиагностики инфекционных болезней. Учебное пособие. Удк. 57. 396 Васильев Д. А., Барышников П. И., Новиков Б. В
 Скачать 426 Kb.
|
2.3.Использование ИФА в диагностике инфекционных болезнейВ настоящее время ИФА эффективно применяется для лабораторной диагностики сравнительно большого круга инфекционных болезней. При этом, используя различные модификации метода, можно одновременно проводить обнаружение антигенов и антител, что значительно повышает результативность исследования. В литературе накопились многочисленные данные, свидетельствующие о широком применении ИФА при выявлении антител и антигенов в отношении почти всех из известных групп вирусов и бактерий, вызывающих заболевания животных: инфекционный бурсит кур (Джавадов Э., и другие,1993), инфекционный ринотрахеит крупого рогатого скота (Кузнецов В. и др.,1991), вирусная диарея (Красочко П. и др., 1991), болезнь Ауески (Мищенко В. и др.,1994), бешенство (Сазонова Э. и др.,1991), болезнь Ньюкасла (Cилаева Н. и др., 1991), инфекционный ларинготрахеит (Atiduk C. et al.,1989) и многих других. В настоящее время ИФА разработан при бруцеллезе, столбняке, сальмонеллезе, паратуберкулезе, лептоспирозе и практически при всех, имеющих эпизоотологическое и экономическое значение, вирусных болезнях сельскохозяйственных животных. Достаточно много работ опубликовано по обнаружению специфических антител в сыворотке крови при микоплазменных инфекциях сельскохозяйственных животных. Большинство авторов отмечают простоту постановки, экономичность и быстроту получения ответа при использовании ИФА, результаты которого коррелируют со многими общепринятыми серологическими методами (РНГА, РДП, РА, ВИЭОФ), но превосходят их по чувствительности, сохраняя при этом высокую специфичность. 2.4.Компоненты реакции, условия их приготовления и применения2.4.1.Буферные растворы
2.4.2.Реактивы.
2.4.3.Оборудование.Для приготовления необходимых ингредиентов и постановки ИФА используется следующее основное оборудование:
2.4.4.Твердая фаза.Для твердофазного ИФА используется множество различных носителей, к которым сорбционно или, реже, ковалентно присоединяются соответствующие антигены и антитела. В ранних работах носителями служили частицы сефарозы, целлюлозы, биогель, найлон, латекс, пористое стекло, силохромы и другие. Наиболее широкое распространение получил метод физической адсорбции на поверхности полистирольных пластин с 96 лунками. Количество адсорбированного вещества при этом зависит от многих факторов: природы и дозы сенситина, рН, времени сенсибилизации, температуры инкубации. Удобно заранее заготовить панели с адсорбированным на них белком и хранить их в холодильнике до употребления. Можно также длительно сохранять сенсибилизированные панели при – 70°С. На сегодняшний день широко используются полистироловые пластины зарубежных фирм (Cooke, Dynateck; Linbro; Flow и другие), ленин-градского завода «Медполимер» и производства ВНИИ медтехники. При получении новой партии пластин необходимо проверять их сорбционную емкость. Для этого отбирают несколько и в каждую лунку вносят по 0,2 мл 5-кратных разведений нормальных бычьих иммуноглобулинов (от 10 до 1000 мкг/мл). После инкубации в течении 16 часов при температуре 20-22°С и последующего отмывания в лунки на 20 минут вносят по 0,2 мл 1%-ного раствора овальбумина. Затем пластины отмывают и добавляют рабочее разведение антивидового (антибычьего) пероксидазного конъюгата на 50 минут при 37°С. Если при данных сенсибилизирующих дозах иммуноглобулинов оптическая плотность после добавления субстрата составляет примерно 1,0, то считают, что сорбционная емкость этих пластин удовлетворительная. При этом разброс показателей параллельных образцов не должен превышать 10 %. 2.4.5.Фермент.Ферменты представляют собой очень удобные метки потому, что их каталитические свойства позволяют действовать им в качестве усилителей, т. к. одна молекула фермента может способствовать образованию более 1·105 молекул продукта каталитической реакции в минуту (Johuson K. et al., 1980). Выбор фермента-метки диктуется не только свойствами самого фермента и условиями опыта, но также склонностью автора, выбирающего наиболее доступный и подходящий для себя фермент. Фермент, выбираемый для метки антител, должен соответствовать следующим нескольким требованиям:
Для постановки ИФА различными авторами наиболее часто использовались такие ферменты как пероксидаза, щелочная фосфатаза, ацетилхолинэстераза, галактозидаза, глюкозооксидаза и другие. Нельзя рекомендовать какой-либо один фермент; у каждого есть свои недостатки и достоинства, поэтому выбор фермента зависит не только от перечисленных выше качеств, но и конкретных целей и способов исследования. Наиболее часто используют в ИФА пероксидазу, которая широко дос-тупна и не так дорога, как другие ферменты, стабильна при хранении. Пе-роксидаза является гликопротеидом (Мол. масса 40000), содержит 18% углеводов. Углеводная часть ее не проявляет энзиматической активности и поэтому может служить местом для прикрепления к ней белков (8 точек). Препараты пероксидазы производят ряд зарубежных фирм (Serva, ФРГ; Fluka, Швейцария), налажен также выпуск отечественной пероксида-зы. Ферменты этих фирм, как и препарат отечественного производства, являются высокоочищенными, высокоактивными и их можно непосредственно использовать в работе. 2.4.6.Субстрат.Выбор субстрата для выявления активности связанного фермента в системе «антиген-антитело» зависит от вида фермента-метки, так как реакция фермента с субстратом весьма специфична. Кроме того, желательно использовать субстраты, позволяющие проводить визуальный и инструментальный учет реакции. С этой точки зрения, наиболее подходящи, так называемые, хромогенные субстраты, растворы которых, изначально бесцветные, в процессе ферментативной реакции приобретают окраску, интенсивность которой пропорциональна количеству фермента. Для выявления активности пероксидазы в твердофазном ИФА в качестве субстрата чаще всего используют 5-аминосалициловую кислоту, образующую интенсивное коричневое окрашивание, орто-фенилендиамин, дающий оранжево-желтое окрашивание, и ABTS, дающий окраску цвета морской волны. Для выявления активности щелочной фосфатазы и (-галактозидазы используется исключительно нитрофенил-фосфаты и нитрофенил-галактозиды, соответственно. Для повышения чувствительности ИФА предложен субстрат, дающий при расщеплении продукт, обладающий способностью к флюоресценции (Prouovost E et al.,1981). В этом случае, даже минимальная степень преобразования субстрата может быть зарегистрирована высокочувствительным прибором – флюориметром. 2.4.7.Выделение иммуноглобулинов и методы контроля их чистоты, активности и специфичностиСыворотка, полученная от животных, помимо широкого набора антител содержит и «балластные» белки, способные адсорбироваться на твердом носителе, мешать связыванию антител и значительно снижать чувствительность и специфичность реакции. Во избежании этого исходную антисыворотку очищают с помощью 2 – 3-кратного осаждения сульфатом аммония, полиэтиленгликолем (Berqquist N. et al., 1970) или каприловой кислотой (Steiubuch W. et al.,1969) с последующим фракционированием белков гельфильтрацией (Остерман Л.,1985). В своей повседневной работе для получения иммуноглобулинов из сыворотки кролика и крупного рогатого скота предварительно выделяли гамма-глобулиновую фракцию белка: из кроличьей антивидовой сыворотки 3-х кратным высаливанием сульфатом аммония при 35 % -ном насыщении, а из сыворотки крупного рогатого скота – 2-х кратным высаливанием при 45 %-ном насыщении. 15 – 20 мл раствора высаленных глобулинов (30-40 мг/мл) вносили в колонку (диаметр 2,6 см, длина 100 см) с Ультрогелем АсА-34 для выделения иммуноглобулинов класса G методом двукратной гельфильтрации. В качестве элюирующего раствора использовали 0,25 М раствор NaCl на 0,01М ФБР, рН 8,0, при скорости элюции 30 мл/час. Выход белка их колонки регистрировали на проточном спектрофотометре (иммуноглобулины G содержатся во фракциях второго пика, которые объединяют: концентрируют высаливанием и вновь подвергают гельфильтрации). После второго цикла гельфильтрации получали один пик белка. Полученый материал концентрировали сульфатом аммония при 50 % насыщении и диализовали против дистиллированной воды в течение 2-х суток, сменяя воду не менее 4-6 раз. Степень освобождения от ионов сульфата контролировали 10 % -ным раствором BaCl2. Активность препаратов иммуноглобулинов из кроличьей антисыворотки проверяли в РДП (не ниже 1:64), а из специфической сыворотки крупного рогатого скота – в непрямом методе ИФА (не ниже 1:1600) чистоту фракций контролировали при помощи иммуноэлектрофореза (ИЭФ). |