Современные методы иммунодиагностики инфекционных болезней. Учебное пособие. Удк. 57. 396 Васильев Д. А., Барышников П. И., Новиков Б. В

• Название: Учебное пособие. Удк. 57. 396 Васильев Д. А., Барышников П. И., Новиков Б. В
• Анкор: Современные методы иммунодиагностики инфекционных болезней.doc
• Дата: 26.12.2017
• Размер: 426 Kb.
• Имя файла: Современные методы иммунодиагностики инфекционных болезней.doc
• Тип: Учебное пособие; #13050
• Категория: Биология. Ветеринария. Сельское хозяйство
• страница: 8 из 9

2.6.Учет и оценка результатов ИФА

Учет результатов ИФА проводят визуально по интенсивности окраски в разведениях исследуемой пробы или при помощи регистрирующих приборов.

Визуальный учет результатов прост и удобен при исследовании проб, содержащих антитела или антигены в высокой концентрации. При этом реакцию оценивали положительно при наличии интенсивной коричневой окраски. (В методе ингибирования ИФА, в отличие от других, отрицательные сыворотки дают интенсивное окрашивание, а сыворотки имеющие антитела – не окрашиваются. Это объясняется тем, что отрицательные сыворотки не взаимодействуют с антигеном (нет антител) и он тем самым сохраняет свободные валентности для связывания с конъюгатом, а это позднее выявляется субстратом. В свою очередь сыворотки, имеющие антитела, реагируют с антигеном и у него не остается свободных валентностей для взаимодействия с конъюгатом, а как следствие – отсутствие окрашивания.)

Для более точного (объективного) измерения применяют регистрирующие приборы – спектрофотометры, которые одновременно позволяют определить концентрацию в пробе материала по заранее построенной стандартной кривой в зависимости от оптической плотности пробы. В данном случае реакцию оценивают положительно при оптической плотности исследуемой пробы в 2 и более раза превосходящей плотность отрицательного контроля. Принцип учета и оценка результатов в методе ингибирования ИФА аналогичный, с той лишь разницей, что исследуемая проба считается положительной, если имеет оптическую плотность в 2 и более раза ниже оптической плотности отрицательного контроля.

Инструментальный учет результатов удобно проводить на сканирующем спектрофотометре типа Titertek Multiskan, который позволяет быстро оценивать цветную реакцию в лунках полистироловых панелей. Он распечатывает замеренные с высокой точностью значения оптической плотности и позволяет применять светофильтры с разной длинной волны в зависимости от цвета продукта ферментативной реакции.

2.7.Другие варианты и модификации ИФА

В целях повышения чувствительности, ускорения постановки и учета реакции были разработаны и предложены еще несколько усовершенствованных модификаций ИФА:

энзимрадиоиммунный анализ: Основан на комбинации иммуноферментного и радиоиммунного анализов; что позволяет повысить чувствительность реакции в 1000 и более раз (Harris C.et al.,1979);

иммуноферментный флуоресцентный метод: предполагает использование флуорогенного субстрата, что повышает чувствительность реакции в 10-100 раз, обладает лучшими экономическими показателями (Crum I.et al.,1980; Von Aert A. et al.,1984);

термометрическая модификация: основана на измерении температуры, возникающей в процессе взаимодействия фермента с субстратом, продолжительность анализа при этом сокращается до 10 минут, а чувствительность достигает 10^–10 моль (Muttia Sou B.,etal.,1977);

Следует отметить, что упомянутые методы, а также и некоторые другие, довольно трудоемки в техническом отношении, далеки от автоматизации и поэтому не смогут составить конкуренцию обычным модификациям ИФА для целей экспресс – диагностики.

Детальное описание и схемы постановки многочисленных методов твердофазного ИФА приведены в книге «Иммуноферментный анализ» под ред. Т.Т.Нго и Г.Ленхоффа, М., Мир, 1988.

2.7.1.Dot–ИФА. Метод точечного иммуноферментного анализа

В последние годы преобладает стремление к снижению стоимости диагностических процедур и использованию метода не требующего дорогого оборудования. В связи с этим разработан более простой и достаточно дешевый вариант ИФА. Такую модификацию назвали dot-ИФА (dot-Elisa-точечный твердофазный иммуноферментный анализ). В dot-ИФА минимальные объемы растворов антигена или антител наносят на нитроцеллюлозную подложку (мембрану) в виде серии точек, что позволяет выполнить гораздо большее число анализов с тем же количеством реагентов. Субстраты, дающие нерастворимые продукты ферментативной реакции, на белом нитроцеллюлозном фильтре образуют легко различимые цветные пятна, в результате чего отпадает нужда в дорогих фотометрах. Белый цвет подложки вокруг пятен помогает контролировать реакции неспецифического связывания (или неспецифической адсорбции). Фильтры с результатами анализа можно хранить в темноте в течении многих лет без потери интенсивности окраски. Кроме того, простота постановки и малые расходы антигена и других компонентов, необходимых для проведения реакции, позволяет ее использовать в полевых или домашних условиях. В таблице даны сравнительные показатели dot-ИФА и ИФА (М. Pappas,1988).

Сравнительная характеристика dot-ИФА и ИФА.

Показатели, характеристики	dot-ИФА	ИФА
Продолжительность	2 ч.	3 – 6 ч.
Число этапов постановки	3	4 – 5
Число промывок	3	3
Цена анализа (USD)	0,05 – 0,1	1 – 2
Специальная подготовка персонала	нет	да
Применяемость в полевых условиях	да	нет
Необходимость фотометра	нет	да
Возможность непрерывной регистрации	да	нет

Принцип метода аналогичен с ИФА. Поэтому остановимся на особенностях постановки реакции.

2.7.1.1.Антигены

В dot-ИФА можно применять различные типы антигенов, как виде живых вирусов и бактерий, так и полученные в результате разрушения бактерий или вирусов. Для уменьшения потерь антигенов на стадии промывки детергентом связанные белковые антигены можно фиксировать ковалентно с помощью глютарового альдегида. Данная методика постановки реакции способствует сохранению антигенности препаратов и позволяет проводить большее количество анализов с ограниченным количеством антигена. Антиген наносят на твердую подложку в объеме от 0,1 до 3 мкл. Удобнее пользоваться стеклянными гамильтоновскими шприцами объемом до 10 мкл и ценой деления 0,1 мкл. При использовании солюбилизированных антигенов лучше использовать мембраны с малым диаметром пор, так как на них белки связываются в основном с поверхностью. При применении целых клеток простейших, размером 5 – 10 мкм, величина пор не играет большой роли.

2.7.1.2.Схема постановки

Метод dot-ИФА позволяет определять как антигены, так и антитела. Все стадии инкубации и промывки выполняются при комнатной температуре. В начале диски с антигеном обрабатывают блокирующим раствором. Для этого лучше всего подходит 3-5% раствор очищенного бычьего сыво-роточного альбумина в триэтаноламиновом буферном растворе (БСА-СТБ), но можно применять и цельную лошадиную сыворотку или 1 %-й раствор нормальной сыворотки кролика в фосфатном буферном растворе NaCl (СФБ) при обнаружении антител. 50 мкл сыворотки пациента в 1%-ном растворе БСА-СТБ инкубируют на диске, антитела связываются с антигеном, сорбированном на диске. Далее диск трехкратно промывают в растворе детергента. Для этого можно использовать 0,05%-ный раствор нонидета Р-40 в СТБ, который является мягким неионным поверхностно активным веществом. Используют и 0,05 % раствор твин 20 в солевом растворе трис HCl. После промывания диски инкубируют с 50 мкл конъюгата афинно очищенных антивидовых антител с ферментом. При данном иммуноанализе широко используют конъюгаты антител с пероксидазой,так как молекулы этого фермента меньше по размерам молекул щелочной фосфатазы и их избыток легче вымывается из пор нитроцеллюлозной мембраны. Но нельзя забывать, что пероксидаза инактивируется азидом натрия, часто используемым в качестве консерванта, а также ароматическими хлорсодержащими углеводородами присутствующими в деионизированной воде, если для ее получения использовали полистирольные смолы.

Конъюгаты с щелочной фосфатазой в меньшей степени подвержены действию различных веществ, но из-за большого размера молекулы фермента они дают более высокий фоновый сигнал.

После того как провели отмывку несвязавшегося материала добавляют хромогенный субстрат, дающий нерастворимый продукт ферментативной реакции. При окислении субстрата ферментом в присутствии перекиси водорода образуется четко окрашенное пятно. При использовании пероксидазы в качестве субстрата используют 4-хлор-1-нафтол (4ХН), дающий голубую окраску пятен, или диаминобензидин, образующий коричневое окрашивание.

При применении щелочной фосфатазы в dot-ИФА применяют 5-бром-4-хлориндолил-3-фосфат (БХИФ), образующий голубое пятно. Во всех случаях интенсивность окраски пропорциональна количеству связавшихся антител.

При определении антигенов пробы наносят непосредственно на подложку, после чего проводят иммунологическую реакцию или со специфическими антителами и затем с конъюгатом вторичных антител с ферментом и хромогенным субстратом, или с конъюгатом специфических антител с ферментом-маркером и субстратом. Последний способ дает более четкую положительную реакцию даже при минимальной концентрации антигена. В двухсайтовом dot-ИФА при определении антигенов вначале на подложку наносят специфические антитела. Антигены в пробе связываются этими антителами. Потом добавляют меченые специфические антитела против другого эпитопа антигена и проводят реакцию с субстратом. Для таких методик характерна высокая специфичность,так как при промывании удаляются несвязавшиеся, мешающие определению, антигены.

Зыкин Л.Ф., Яковлев А.Т.(1993) приводят следующую схему постановки dot-ИФА, используемую для диагностики сапа, мелоидоза, чумы, туляремии. Определяемый антиген, разведенный 0,1М трис-HСl буфером, наносят в объеме 2 мкл на нитроцеллюлозный мембранный фильтр (НМФ) (размеры пор 0,22-0,45 мкм, использовали мембраны фирм «Millipor»(США), «Schleicher-Schull» (ФРГ), «Synpor» (Чехия)), антиген инкубировали на фильтре при 56°С в течение 30 мин. Затем наносили 5 % раствор БСА и помещали в термостат на 30 мин. при 37°С. Фильтр дважды по 5 мин промывали раствором 0,15М NaCl c твином 20 в кювете на аппарате для встряхивания. После этого НЦМ заливали иммунопероксидазным конъюгатом (ИПК) в рабочем разведении, инкубировали 30-60 мин.при 37°С. Заключительное промывание проводили четырех-пятикратно по пять минут. Далее для проведения реакции НЦМ погружали в рабочий раствор субстрата на 10-15 мин. и проводили учет. При положительном результате на НЦМ проявлялись коричневые точки (пятна), в отрицательном варианте поверхность была бесцветна. Для определения антител использовали следующую схему. На МЦМ наносили взвесь микроорганизмов в концентрации 10⁸, оставляли на 18 часов при температуре +7°С, подсушивали, обрабатывали БСА, отмывали, а потом исследуемую сыворотку наносили на мембрану. Фильтр (НЦМ) двукратно промывали, погружали в антивидовой пероксидазный конъюгат на 1 час при 37°С, четырехкратно промывали и погружали в раствор субстрата с последующим учетом реакции. По наблюдениям авторов специфичность данного метода не уступает классическому ИФА, а чувствительность ниже только на один порядок.

2.7.1.3.Чувствительность, специфичность метода

Хорошие результаты в этом направлении впервые были продемонстрированы при диагностике висцерального лейшманиоза у людей. Специфические антитела в пробе выявляли в количестве от 0,1 нг и выше (Pappas M., 1983). Специфичность метода составила 98 %. Перекрестные реакции с 9 вирусными, бактериальными и паразитарными инфекциями, схожими по клинике с лейшманиозом, отсутствовали.

Показатели воспроизводимости результатов при использовании dot-ИФА была чуть выше по сравнению с обычным ИФА и значительно лучше, чем при использовании РСК. Сравнительные исследования показали, что чувствительность и специфичность dot-ИФА и ИФА равноценна. Специфичность и чувствительность метода практически не зависели от сроков хранения сенсибилизированной мембраны. Если мембраны с нанесенными антигенами хранились при комнатой температуре (22°C) в течение 60 дней, то наблюдали снижение титра на 2 разведения. При хранении при температуре 4°С (холодильник бытовой) понижение титра на 1 разведение наблюдали через 3 дня. Хранение при –20°С даже через 270 дней не приводило к уменьшению их реакционной способности. Подвергли проверке и конъюгированные с пероксидазой антитела и субстраты, хранившиеся при 4°С до 28 дней. Указанные условия и сроки хранения не приводили к снижению титра. Кроме того, титры в dot-ИФА не изменяются и после нескольких циклов замораживания – размораживания контрольной сыворотки.

2.7.1.4.Оборудование

Для данного метода предложено использовать 96 луночные микропланшеты, в дно лунок которых вплавлены пористые нитроцеллюлозные мембраны. Papas et al. предложили применять полоски нитроцеллюлозных мембран на пластиковой подложке (дипстики). Их удобнее использовать в полевых условиях. Однако необходимо учитывать, что полоски легко ло-маются и очень не прочны. Поэтому предложено, чтобы эти нитроцеллю-лоидные фильтры после нанесения антигена наклеивали на гибкие пласти-ковые полоски. Сейчас используют мультиантигенные дипстики – с четырьмя разными антигенами. Экспериментально доказано, что этот вид дипстиков обладает диагностической чувствительностью. Третий вид экспериментального оформления dot-ИФА разработан специально для экспресс-диагностики. Антиген наносится на непрозрачные пластиковые карточки в виде точек расположенных так же, как и на обычном микротитровальном планшете. Эту карточку можно обрезать, если использовано небольшое количество проб. Результаты dot-ИФА на карточках в 97 % случаев согласуется с результатами анализа при использовании коммерческого набора.

Таким образом, основным преимуществом dot-ИФА является возможность его использования в различных условиях и для различных количеств исследуемых образцов. Все модификации этого метода отличаются экономичым расходом реагентов, не требуют приборов с электропитанием, наборы очень компактны. По-видимому, в ближайшее время этот метод найдет широкое применение.