Иммунология Хаитов. В. Н. Ярыгин профессор, академик рамн, ректорРоссийского государственного медицинского университета академик рамн, председатель Уральского отделения ран. Хаитов P. M., Игнатьева га, Сидорович И. Г
 Скачать 6.93 Mb.
|
|
6.1. Что такое активация лимфоцита Активация лимфоцита в периферических лимфоидных тканях — это инициированные внешними сигналами (следовательно через рецепторы для этих сигналов на клеточной мембране лимфоцита) биохимические реакции внутри клетки, приводящие к активизации транскрипции с определенных генов, что в свою очередь приводит к пролиферации и додифференцировке лимфоцита (те. биосинтезу специфических цитокинов и мембранных молекул). Почему пролиферация — обязательный процесс при активации лимфоцита вначале развития иммунного ответа Пролиферация в периферических тканях в норме — исключительное свойство именно лимфоцитов. Другие клетки крови, в том числе клетки доиммунных механизмов резистентности к инфекциям, фагоциты, в периферических тканях не пролифе- рируют, даже будучи активированными к действию после встречи со своим целевым объектом. Обязательность пролиферации для лимфоцитов объясняется все тем же уникальным свойством лимфоцитов — огромным числом вариантов рецепторов для антигена Отсюда следует, что численность лимфоцитов с конкретным рецептором — один или мало, если учесть с разной аффин- ностью рецепторы, то несколько тысяч клеток. Для адекватной санации от антигена лимфоцитов нужного клона надо столько, сколько потребуется. Поэтому пролиферация клона заложена в жизненную программу каждого лимфоцита — в периферических тканях после встречи с антигеном. Запрограммированность лимфоцитов на пролиферацию объясняет еще два явления, характеризующих именно лимфо- 146 вднуто ткань. Первое — запрограммированность на апоптоз обязательное как нив другой у млекопитающих. Второе трансформация происходит чаще, чем в клетках других гистотипов, так в нормальных механизмах пролиферации есть чему и сломаться в сторону патологического лимфопролиферативного процесса. Активация Т-лимфоцита антигеном осуществляется при сочетанном взаимодействии некоторых молекул на поверхности Т-лимфоцита с рядом комплементарных молекул на поверхности антигенпредставляющей клетки. Это взаимодействие принимает морфологическую форму получившую название агрегатов Недавно на лимфоцитах от генных по генам TCR мышей (у которых все Т-лимфоциты имеют одинаковый TCR, антиген для которого точно известен) люди научились прямо наблюдать эти структуры под флюоресцентным микроскопом высокого разрешения. Взаимодействующие молекулы мембран между двумя клетками называют еще межклеточным интерфейсом Интерфейс между Т- лимфоцитом и антигенпредставляющей клеткой состоит из следующих молекул. Со стороны эти стороны молекулы-лиганды МНС-Г или и Биохимические внутриклеточные реакции проведения сигнала на гены — это реакции фосфорилирования молекул белков по остатку тирозина. Внутриклеточные участки молекул и корецепторов физически ассоциированы с определенными тирозинкиназами, ив результате изменения конформации внеклеточных участков рецепторов при связывании с антигеном внутриклеточные тирозинкиназы инициируют цепь реакций фосфорилирования внутри клетки. В цитоплазматических участках проводящих сигнал цепей рецепторов идентифицированы определенные последовательности остатков тирозина, по которым происходит фосфорилирование. Эти последовательности обозначены ΙΤΑΜ (от англ tyrosine-based activation motifs). Они представляют собой последовательность аминокислотных остатков (L/I). Остатки тирозина фосфорилируются ки- назами семейства src - Lck, Fyn, и Lyn. В Т-лимфоцитах хорошо изучена киназа Она связывается с тическими участками молекул корецепторов CD4, CD8, а также цепей ε, у и β TCR. После фосфорилирования ITAM в этих молекулах они изменяют конформацию и становятся доступны для связывания пос тирозинкиназами цитозоля и Syk. Внутриклеточное проведение сигнала в зрелом, завершившем лимфопоэз Т-лимфоците можно представить схемой на рис. 6.2. 147 6.1. Межклеточный интерфейс между и генпредставляющей клеткой (АПК), А. Адгезия Т-лимфоцита и АПК до распознавания эти ствия слабые и если не произойдет связывания с антигеном, то клетки легко диссоциируют. Б. После связывания TCR с комплексом молекулы пептид изменяется конформация молекулы и связь между клетками становится более сильной и продолжительной. Молекула CD45 является трансмембранной тирозинфосфа- тазой. Ферментативной активностью обладает цитоплазматический участок молекулы. Этот фермент катализирует отщепление ингибиторных фосфатных групп от молекул тирозин- киназ Lck и Fyn, ассоциированных с цитоплазматическими участками молекул соответственно CD4 или CD8 и ζ- и е- цепей CD3. Точно реакции, следующие за этим, неизвестны. Известно, что фосфорилированная цепь присоединяет ци- тозольную тирозинкиназу ΖΑΡ-70 и при этом ее активирует. Активированная ZAP-70 катализирует активацию фосфолипазы которая расщепляет тидил-инозитол-4,5-бифосфат до диацил-глицерола (DAG) и инозитол-трифосфата В идентифицированы еще два так называемых δ ε ε γ ;.ΖΑΡ-70 •) C D 4 C D 4 5 Fyn и Lck фосфорилируют остатки тирозина в ITAM ζ- и цепей, что позволяет связать ΖΑΡ-70, которая при этом активируется и Lck сближаются и тем самым активируются активирует Lck и Fyn ΖΑΡ-70 и Fyn активируют и которые расщепляют дои активирует протеинкиназу С мобилизует Ras активирует каскад киназ точный что активирует фосфатазы и С активирует фактор транскрипции NFkB, Кальцийневрин активирует фактор транскрипции Каскад киназ индуцирует и активирует Fos - компонент фактора транскрипции Факторы транскрипции NFAT и АР индуцируют транскрипцию с определенных генов, что обеспечивает пролиферацию и Т-лимфоцита 6.2. Взаимодействие внутриклеточных молекул, участвующих в проведении внешних сигналов на ядро (гены Т-лимфоцита (схема — трансмембранная тирозинфосфатаза, отщепляет ингибирующие фосфаты от ITAM цитоплазматических участков цепей комплекса чем способствует активации внутриклеточных тирозинкиназ Fyn и Lck; ΖΑΡ-70 (ζ- assotiated protein-70) — тирозинкиназа с молекулярной массой 70 ассоциированная с цепью комплекса TCR; DAG — диацилглицерол; — инозитолтрифосфат; NFkB — ядерный фактор транскрипции каппа-В; NFAT (nuclear factor of activated Τ cells) — ядерный фактор транскрипции, специфичный для активированных Т-лимфоцитов; АР — фактор транскрипции, представляющий собой комплекс генрегулирующих белков из семейств Fos и белка — промежуточные участники проведения сигнала — LAT (Linker for activation of Τ cells) и SLP76 (SH2- containing leukocyte protein of 76 kDa). LAT является мембранным белком, способным связывать фосфолипазу и тем самым физически подводить ее к липидам мембраны SLP76 — цитозольный белок, обеспечивающий связывание тирозинкиназ с фосфолипазой В В-лимфоцитах нет молекул и Вероятно, в В-лимфоцитах есть свои адаптерные молекулы для проведения сигнала (BLNK/SLP65, HS1), но они мало изучены активирует протеинкиназу С (серин/треонинкиназу), которая активирует фактор транскрипции NFkB. Инозитол-трифосфат высвобождает из внутриклеточных депо. Существенно, что в активируемом Т-лимфоците включаются и кальциевые насосы клеточной мембраны для подкачки из внеклеточной среды. Свободные активируют фосфатазу — кальцийневрин (calcineurin), который удаляет ингибирующие фосфатные группы с цитоплазматического белка — предшественника фактора транскрипции Это позволяет данному фактору мигрировать на территорию ядра и связать фактор В результате образуется активный фактор транскрипции NFAT, специфичный именно для активированных Т-лимфоцитов. Третье последствие проявления активности ZAP-70 —- активация связывающего протеина (мол. масса 000). Этот белок — широко распространенная внутриклеточная молекула, участвующая в проведении сигналов путем активации каскадов протеинкиназ, направленных на семейство генрегулирующих белков Fos. Белки Fos образуют комплексы с братьями из семейства и вместе сними представляют собой факторы транскрипции АР. Сами по себе факторы АР инициируют пролиферацию клеток. В комбинации с тканеспецифичным фактором NFAT образуется активатор транскрипции именно с генов, продукты которых уникальны для Т-лимфоцитов. Кстати, знание тканеспецифичности факторов транскрипции помогает в поиске целенаправленно действующих лекарственных средств. Так были подобраны два препарата, достаточно избирательно ингибирующие кальцийневрин и тем самым препятствующие образованию активного фактора транскрипции Т-лимфоцитов (NFAT) — Аи Эти препараты подавляют в цитах, инициируемых к иммунному ответу антигенным раз- дражением, После проведения сигнала может произойти (ноне обязательно) такое морфологическое событие, как рецепторов с поверхности клетки. Этот феномен называют еще модуляцией рецепторов Всего 100 комплексов пептид — МНС на поверхности антигенпредставляющей клетки способны вызвать интернализацию около 10 000 молекул TCR с поверхности Т-лимфоцитов. При этому Т-лимфоцитов на молекулу TCR приходится 2 молекулы CD4 (димеризация корецептора CD4 при активации Т4-лимфоцита). 150 6.2. и торможение активации Во всякой живой клетке, естественно, происходят противоположные процессы. В лимфоцитах — и Т, и В — в норме есть материальный субстрат (те. наружные рецепторы и внутриклеточные механизмы) не только для активации, но и торможения активности клеточной биохимической машины. Торможение активности происходит по двум вариантам 1) клетка остается живой, ноне пристает к другим клеткам (не проявляет активность, 2) активность лимфоцита «гасится» путем запуска внутриклеточного механизма самоуничтожения клетки, называемого апоптозом (син.: запрограммированная смерть клетки — PCD — programmed cell death). Запрограммированность апоптоза означает, что в клетке для активации внешними сигналами доступны определенные гены (программа смерти, кодирующие определенные продукты — ферменты, предназначенные для закономерной и необратимой дезинтеграции всей ДНК и остального содержимого клетки. Нов нормальных клетках апоптоз не запускается по сугубо внутриклеточной программе развития отдельно взятой клетки. Нужен внешний сигнал. Для его восприятия на клетках, в дифференцировке которых апоптоз предусмотрен, есть специальные рецепторы, например Fas (Следовательно, и сигналы на апоптоз специальные. Но, кроме того отсутствие сигналов с других рецепторов, характеризующих жизненную активность клетки (эти сигналы называют сигналами на выживание также при определенных условиях побуждает клетку выйти в апоптоз. на птоза) является уяпвттетвпритвльнпе связывание с МНС- I или позитивной селекции Для со своим лимфоците Апоптоз Известно два способа смерти живой клетки — некроз и апоп- тоз. Некроз — это травматическая гибель по самым разным причинам механическое или осмотическое нарушение целостности мембраны, термический или химический ожог, повреждение микробными или иными токсинами и т.д. Некроз приводит к попаданию содержимого клетки в окружающую среду ив норме вызывает воспалительную реакцию. Апоптоз это фрагментация содержимого клетки изнутри, осуществляемая специальными внутриклеточными ферментами, индукция и активация которых происходят при получении клеткой внешнего сигнала или при принудительной инъекции в клетку ферментов — активаторов апоптозной машины (последнее имеет место при осуществлении эффекторной функции ЦТЛ и NK при убийстве ими или при повреждении клетки внешними факторами, не приводящими к некрозу, но способными инициировать апоптоз (ионизирующая радиация, обратимый перегрев и др.). Явление дружной гибели определенных клеток в многоклеточном организме наблюдали еще в конце XIX — начале вв. и именно на лимфоцитах. Физиологи регистрировали, что при голоданиив организм теряет значительную часть лимфоцитов. Поскольку функции лимфоцитов в неизвестны, их даже называли иногда тро- фоцитами как раз зато, что организм съедает их при голодании. Наблюдали также безвоспалительную гибель тимоцитов при введении в организм экспериментальных мышей глюко- кортикоидных гормонов. Термин «апоптоз» тогда еще не применяли более 20 лет назад назвали биологическое явление, описанное зоологами J.F.R. et 1972] при гистологическом исследовании развития личинок круглых червей нематод (на примере elegans). У них наблюдали одновременную гибель одного итого же числа клеток в строго определенный момент развития тело личинки содержит клеток, а тело взрослого червячка — 945; ровно клетка в нужный момент исчезает. Эта ровность навела на правильную мысль о запрограммированности такой клеточной смерти. Термин «апоптоз» взят из греческого языка этим словом называли в споили У нематод идентифицировали два гена ced-3 и ced-4, необходимые для осуществления апоптоза, и ген ced-9, подавляющий апоптоз. В 1976 г. при электрофорезе ДНК обнаружили фрагментацию ДНК на регулярные отрезки размером примерно в 180 пар нуклеотидов. Как всякая регулярность и правильность, а не хаос, это также навело на правильную мысль о том, что в данном случае исследователи столкнулись с закономерным явлением природы, имеющим отлаженный биохимический и клеточный механизм развития. Нос феноменом запрограммированной гибели клеток этот факт был увязан позже. У млекопитающих клетки всякой ткани, которой свойственна пожизненная физиологическая регенерация, в дифференцировке приобретают программу на апоптоз. Лимфоцитам апоптоз свойствен в мере, превышающей таковую для любых других клеток лимфоциты — единственные клетки крови, которые мало того, что излишне делятся при лимфопоэзе (под нужды позитивной и негативной селекции, еще и обязаны делиться на периферии при инициации иммунного ответа Примеры морфогенстических событий, при которых происходит апоптоз, как минимум следующие удаление стадиоспецифичных тканей и органов в эмбриогенезе удаление короткоживущих (несколько часов) клеток крови (например, нейтрофилов позитивная и негативная селекция тимоцитов; • элиминация пролиферирующих клеток в отсутствие их специфических факторов роста индуцированная активацией смерть лимфоцитов (Кроме того, апоптоз запускается в клетках-мишенях при работе таких эффекторных механизмов иммунитета, как действие ЦТЛ и NK. Апоптоз развивается как процесс. Точная последовательность событий строго неизвестна. Возможно первое необратимое действие в клетке — это повышение проницаемости мембран митохондрий. При апоптозе активируются особые ферменты — цистеи- новые протеазы, специфичные по остатку аспарагина и поэтому называемые (caspases). У млекопитающих идентифицировали 10 каспаз. Их обнаруживали путем скри- нинга клеточной ДНК на последовательности, гомологичные гену нематод Позже происходит еще один существенный и характерный для апоптоза процесс, состоящий в том, что специальные ферменты, эндонуклеазы, нарезают всю клеточную ДНК между нуклеосомами на регулярные фрагменты в основном пар нуклеотидов (разброс от 50 до 300 пар. Вероятно, эндонуклеазы активируются под действием каспазы-3, известной еще под названиями СРР32 или apopain. Каспазы связаны с кислыми и нейтральными сфингомие- линазами, которые будучи активированными, генерируют це- рамиды и ганглиозиды, меняющие мембраны клетки. В результате ядро постепенно сморщивается и фрагментируется. Клеточная мембрана теряет упругость, местами происходит инверсия фосфолипидов, и наружу выворачивается фосфатидил- серин. Его способны распознавать фагоциты. Затем клетка распадается на окруженные мембраной фрагменты — апоптозные тельца. Внутриклеточное содержимое при этом не «вытекает» во внеклеточную среду. Воспалительная реакция в ткани не развивается. Апоптозные тельца, мембранные пузырьки, фаго- цитируют макрофаги либо поглощают макроэндоцитозом дендритные клетки. Макрофаги сорбируют апоптозные тельца следующими молекулами своей мембраны интегрином CD36 (молекула адгезии, GPIIIb), возможно, рецептором для «мусора» (scavenger receptor). Дендритные клетки сорбируют апоптозные тельца интегрином и молекулой CD36. 153 Макрофаги разрушают вещество телец до мелких метаболитов. При этом продукция провоспалительных цитокинов в макрофагах не активируется. А вот дендритные клетки процессируют вещества апоптозных телец (как и любых других антигенов) ив результате экспрессируют на мембране комплексы пептидов с молекулами MHC-I и II, среди — как экзогенные, например вирусные (если апоп- /тозу подверглась инфицированная вирусом клетка, таки пептиды — фрагменты собственных белков организма. Дендритные клетки способны индуцировать иммунный ответ на компоненты апоптозных телец. Именно такие процессы лежат в основе развития иммунного ответа на собственные поврежденные ткани, а также на тканевые антигены чужеродных трансплантатов Точные биохимические механизмы апоптоза еще не изучены. Известны лишь отдельные факты. Известны гены (по крайней мере два, продукты которых предотвращают апоп- тоз. Это гены (соответственно белок и Вс1-х. Ген Вс1-2 млекопитающих гомологичен гену ced-9 нематод. С гена Вс1-х в результате альтернативного сплайсинга первичного РНК-транскрипта получаются два белка — малый (small) и большой (large) Малый белок индуцирует, а большой белок предотвращает апоптоз. белков происходит хронических ревматоидном артрите последнем случае полагают, что сигналы лимфоциты синовиальных полостей получают от разросшихся фибробластов стромы, что в патогенезе заболевания отношению к патогенетическим эффектам активированных Т-лимфоцитов. Сигналы для экспрессии Вс1-2 и вероятно, приходят с уцепи рецепторов для цитокинов, общей у рецепторов для IL-2, 15, 4, 7 и 13. Кроме того, при анализе механизмов хронического воспаления суставов при ревматоидном артрите установили, что индукция антиапоптозных генов в зрелых Т-лимфоцитах (которым в норме положено было бы умереть апоптозом) происходит, вероятно, при взаимодействии молекул интегринов на фибробластах (активный пептид) с молекулой 11a/ 18) на Т-лимфоцитах. Известны некоторые пары рецептор — лиганд, связывание которых индуцирует апоптоз в клетке — носителе рецептора рецептор Fas (CD95) на клетке-мишени — лиганд) на мембране клетки-«убийцы»; • рецептор для глюкокортикоидных гормонов в лимфоците глюкокортикоидные гормоны (этот механизм индукции апоптоза работает на территории тимуса при позитивной селекции, зируются На территории негативной селекции тимоцитов апоп- тоз индуцирует лиганд, экспрессированный на дендритных клетках тимуса при определенных сопутствующих условиях рецептор для I и его лиганды TNF или LT. Выделяют до так называемых рецепторов TRAIL (TNF — receptor- related apoptosis inducing ligand) — рецепторов, родственных рецептору для TNF, лиганды которых вызывают апоптоз; • CD30 (на тимоцитах или Т-лимфоцитах) — CD30L (на эпителии и дендритных клетках мозговой зоны тимуса и других клетках). В экспериментах с В-лимфоцитами показано, что активация В-лимфоцита через специфический рецептор для антигена сопряжена с защитой от апоптоза на несколько дней, необходимых для развития иммунного ответа, тогда как стимуляция В-лимфоцита (например, митогенами), помимо, приводит к их быстрому, опосредованному через Fas- рецептор апоптозу. Индукция так называемой высокодозовой толерантности (когда в организм парентерально вводят большую дозу специфического антигена) по механизму — это элиминация антигенспецифичного клона лимфоцитов апоптозом как следствие ударной активации клона специфическим антигеном. Превышение меры — всегда патология. В норме факторы транскрипции, образующиеся при нормальном процессе активации Т-лимфоцита, NFAT и активируют и энхансерные последовательности для Fas-лиганда, что создает перспективу апоптоза у лимфоцитов, «отработавших свое в иммунном ответе. Суперантигены индуцируют апоптоз сразу после пролиферации охваченных Т-лимфоцйтов, а также апоптоз в дендритных клетках. Все это объясняет продолжительную иммунодепрессию после воздействия на организм суперантигенов. Описаны случаи наследственных дефектов в Fas или/и FasL: такие люди с самого рождения страдают тяжелыми формами лимфопролиферативных или/и аутоиммунных болезней, быстро приводящих к летальному исходу. У млекопитающих описаны и другие гены, кодирующие продукты, которые ингибируют апоптоз: ALG- 3 и др. лены у вирусов аденовирусов свиней. Клиницисты рассматривают эти потенциально онкогенные Есть и гены, ускоряющие апоптоз. У млекопитающих выявлены такие гены — Bak, Иногда в литературе можно отметить, что апоптоз и индуцированную активацией смерть клеток (AICD — activation- induced cell death) считают синонимами. Это не вполне корректно. Явление апоптоза шире, чем AICD. Например, апоп- тоз запускается в клетках, в которых произошло радиационное повреждение ДНК в большем объеме, чем это могут исправить ферменты репарации ДНК. Некроза клеток при этом нет, есть именно апоптоз. Внутриклеточным фактором, индуцирующим программу на апоптоз, в данном случае является, вероятно, белок с молекулярной массой 53 он обозначен р. Белок р — фактор транскрипции. Физиологические функции этого белка малоизвестны, неизвестно даже, функционирует ли он в норме. Однако при дефектах в р развиваются опухоли. УС р онтогенез примерно до месячного возраста происходит без видимых отклонений, но после 10 мес практически все такие животные умирают от рака или саркомы. Или, например, если тимоциты in vitro поместить в среду с температурой Сто через некоторое время они погибнут по механизму некроза. Но если те же тимоциты прогреть до той же температуры 43 в течение 3 мин, после чего вернуть к физиологической температуре 36,7 то тимоциты будут все равно погибать, но по механизму апоптоза. Кроме того, постнатальный апоптоз возможен и не в лимфоидной ткани. Например, апоптоз гепатоцитов происходит при алкогольных циррозах печени, при которых показана экспрессия Fas и именно на гепатоцитах. Правильно ли рассматривать алкогольную альтерацию печени как AICD, сказать трудно. Торможение активации Исследования закономерностей взаимодействия TCR со своими лигандами показали, что не всякое связывание приводит к активации лимфоцита. Некоторые комплексы пептидов с МНС связываются сне вызывают активацию лимфоцита и препятствуют собой связыванию стем же TCR другого комплекса пептид — МНС, который в отсутствие первого вызывает активацию лимфоцита. Такие ингибирующие пептиды называют Пептиды, вызывающие активацию с TCR, называют пептидами-агонистами. Химические исследования показывают, что пептиды-антагонисты получаются при замене в пептидах-агонистах аминокислотных остатков, участвующих в связывании с TCR, при сохранении остатков, участвующих в связывании с молекулами МНС. Вероятно, ингибиция активации лимфоцитов пептидами- антагонистами играет определенную роль в патогенезе перси стирующих вирусных инфекций. Это показано, например, для ВИЧ-инфекции: мутантные вирусные пептиды-антагонисты способны заблокировать активацию вирусспецифических ЦТЛ, будучи в количестве враз меньшем, чем нормальные вирусные пептиды-агонисты, те. в каких-то случаях по крайней мере аффинность связи су пептида-антагони- ста может превосходить аффинность связи пептида-агониста. |