Лекции по бх. Втретьих, биохимия оказывает все более глубокое воздействие на медицину

• Название: Втретьих, биохимия оказывает все более глубокое воздействие на медицину
• Дата: 06.06.2020
• Размер: 355.5 Kb.
• Имя файла: Лекции по бх.doc
• Тип: Лекция; #128429
• страница: 3 из 5

Роль металлов в ферментативном катализе

Не менее важную роль отводят ионам металлов в осуществлении фер­ментативного катализа.
Участие металлов в электрофильном катализе. Наиболее часто эту функцию выполняют ионы металлов с переменной валентностью, имеющие свободную d-орбиталь и выступающие в качестве электрофилов. Это, в первую очередь, такие металлы, как Zn²⁺, Fe²⁺, Mn²⁺, Cu²⁺. Ионы щелочных метал­лов, такие так Na⁺ и К⁺, не обладают этим свойством.
В ходе электрофильного катализа ионы металлов часто участвуют в стабилизации промежуточных соединений.
Участие металлов в окислительно-восстановительных реакциях. Ионы металлов с переменной валентностью могут также участвовать в переносе электронов. Например, в цитохромах (гемсодержащих белках) ион железа спосо­бен присоединять и отдавать один электрон.
Благодаря этому свойству цитохромы участвуют в окислительно-восста­новительных реакциях.

Активный центр фермента

Участок молекулы фермента, который специфически взаимодействует с субстратом, называется активным центром. Активный центр – это уни­кальная комбинация аминокислотных остатков в молекуле фермента, обес­печивающая непосредственное взаимодействие её с молекулой субстрата и при­нимающая прямое участие в акте катализа. У сложных ферментов в состав активного центра входит также кофактор. В активном центре условно раз­личают каталитический участок, непосредственно вступающий в химическое взаимодействие с субстратом и участок связывания, который обеспечивает специ­фическое сродство к субстрату и формирование его комплекса с ферментом.
Свойства активных центров ферментов:

1.На активный центр приходится относительно малая часть общего объема фермента.

2.Активный центр имеет форму узкого углубления или щели в глобуле фермента.

3.Активный центр – это трехмерное образование, в формировании которого участвуют функциональные группы линейно удаленных друг от друга аминокислот.

4.Субстраты относительно слабо связываются с активным центром.

5.Специфичность связывания субстрата зависит от строго определенного распо­ложения атомов и функциональных групп в активном центре.

У некоторых регуляторных ферментов имеется еще один центр, назы­ваемый аллостерическим или регуляторным. Он пространственно разделен с активным центром.

Аллостерический центр – это участок молекулы фермента, с которым связываются определенные обычно низкомолекулярные вещества (аллостериче­ские регуляторы), молекулы которых не сходны по строению с субстратом. Присоединение регулятора к аллостерическому центру приводит к изменению третичной и четвертичной структуры молекулы фермента и, соответственно, конформации активного центра, вызывая снижение или повышение фермента­тивной активности.

Механизм действия ферментов

В любой ферментативной реакции выделяют следующую стадийность:

E + S [ES] E + P

где Е – фермент, S – субстрат, [ES] – фермент-субстратный комплекс, Р – продукт.

Механизм действия ферментов может быть рассмотрен с двух позиций: с точки зрения изменения энергетики химических реакций и с точки зрения событий в активном центре.

Роль активного центра в ферментативном катализе

В результате исследований было показано, что молекула фермента, как правило, во много раз больше молекулы субстрата, подвергающегося химиче­скому превращению этим ферментом. В контакт с субстратом вступает лишь небольшая часть молекулы фермента, обычно от 5 до 10 аминокислот­ных остатков, формирующих активный центр фермента. Роль остальных аминокислотных остатков состоит в обеспечении правильной конформации мо­лекулы фермента для оптимального протекания химической реакции.

Активный центр на всех этапах ферментативного катализа нельзя рассматривать как пассивный участок для связывания субстрата. Это ком­плексная молекулярная «машина», использующая разнообразные химические механизмы, способствующие превращению субстрата в продукт.

В активном центре фермента субстраты располагаются таким образом, чтобы участвующие в реакции функциональные группы субстратов находились в непосредственной близости друг к другу. Это свойство активного центра на­зывают эффектом сближения и ориентации реагентов. Такое упорядоченное расположение субстратов вызывает уменьшение энтропии и, как следствие, сни­жение энергии активации (Е_а), что определяет каталитическую эффектив­ность ферментов.

Активный центр фермента также способствует дестабилизации меж­атомных связей в молекуле субстрата, что облегчает протекание химической реакции и образование продуктов. Это свойство активного центра называют эффектом деформации субстрата.

Молекулярные механизмы ферментативного катализа

Механизмы ферментативного катализа определяются ролью функцио­нальных групп активного центра фермента в химической реакции превраще­ния субстрата в продукт. Выделяют 2 основных механизма ферментативного катализа: кислотно-основной катализ и ковалентный катализ.

Специфичность действия ферментов

Ферменты обладают более высокой специфичностью действия по сравнению с неорганическими катализаторами. Различают специфичность по отношению к типу химической реакции, катализируемой ферментом, и специфичность по отношению к субстрату. Эти два вида специфичности характерны для каждого фермента.

Специфичность по отношению к субстрату – это предпочтительность фермента к субстрату определенной структуры в сравнении с другими суб­стратами. Различают 4 вида субстратной специфичности ферментов:

1.Абсолютная специфичность – способность фермента катализировать превраще­ние только одного субстрата. Например – глюкокиназа фосфори­лирует только глюкозу, аргиназа расщепляет только аргинин, уреаза – мочевину.

2.Относительная специфичность – фермент катализирует превращение не­скольких субстратов, имеющих один тип связи. Например – липаза расще­пляет сложноэфирную связь в триацилглицеролах.

3.Относительная групповая специфичность – фермент катализирует превраще­ние нескольких субстратов, имеющих один тип связи, но требуется наличие определенных функциональных групп, входящих в состав субстратов. Например, все протеолитические ферменты расщепляют пептидную связь, но пепсин – образованную аминогруппами ароматических аминокислот, хи­мотрипсин – образованную карбоксильными группами этих же аминокис­лот, трипсин – пептидную связь, образованную карбоксильной группой лизина, аргинина.

Стереохимическая специфичность – фермент катализирует превращение только одного стереоизомера. Например, бактериальная аспартатдекарбокси­лаза катализирует декарбоксилирование только L-аспартата и не дейст­вует на D-аспарагиновую кислоту.

Лекция 4

Нуклеиновые кислоты – это биополимеры, состоящие из нуклеотидов и выполняющие функцию хранения, передачи и реализации генетической инфор­мации. Впервые обнаружены Фридрихом Мишером в 1869 г. в клетках, богатых ядерным материалом.

Мономерами нуклеиновых кислот являются нуклеотиды. Каждый нук­леотид содержит 3 компонента: гетероциклическое азотистое основание, моно­сахарид (пентозу) и остаток фосфорной кислоты. В состав нуклеиновых ки­слот входят азотистые основания двух типов: пуриновые – аденин (А), гуа­нин (Г) и пиримидиновые – цитозин (Ц), тимин (Т) и урацил (У). Кроме главных азотистых оснований в нуклеиновых кислотах присутствуют неболь­шие количества нетипичных (минорных) оснований (псевдоуридин, дигидроури­дин, метиладенозин и др.).

Нуклеотиды, в которых пентоза представлена рибозой, называют рибо­нуклеотидами, а нуклеиновые кислоты, построенные из рибонуклеотидов, ри­бонуклеиновыми кислотами, или РНК. В молекулы РНК входят аденин, ура­цил, гуанин и цитозин. Нуклеиновые кислоты, в мономеры которых входит дезоксирибоза, называют дезоксирибонуклеиновыми кислотами, или ДНК. В ее состав входят аденин, тимин, гуанин и цитозин. Молекулы ДНК, как пра­вило, состоят из 2 полинуклеотидных цепей, РНК в основном представляют собой одноцепочечные структуры.

Молекулы нуклеиновых кислот всех типов живых организмов – ли­нейные полимеры, не имеющие разветвлений. Роль мостика между нуклеоти­дами выполняет 3,5-фосфодиэфирная связь, соединяющая пентозы нуклеотидов. В связи с этим полинуклеотидная цепь имеет определенную направленность. На одном её конце находится 5-ОН группа, этерифицированная остатком фосфорной кислоты (начало цепи), на другом – свободная 3-ОН-группа (ко­нец цепи). Последовательность нуклеотидов в полинуклеотидной цепи форми­рует первичную структуру нуклеиновой кислоты. Углеводно-фосфатный остов цепи представляет собой неспецифический компонент нуклеотида. Функцио­нально значащей является последовательность азотистых оснований, уникаль­ная для каждой молекулы. Это обуславливает большое разнообразие индивиду­альных ДНК и РНК. В то же время нуклеиновые кислоты обладают видовой специфичностью, т.е. характеризуются определенным нуклеотидным составом у каждого биологического вида. В клеточных организмах присутствуют оба типа нуклеиновых кислот; вирусы содержат нуклеиновую кислоту лишь одного типа – ДНК или РНК.

Биологическая роль нуклеиновых кислот заключается в хранении, реа­лизации и передаче генетической информации. Возможно, что нуклеиновые кислоты обеспечивают различные виды биологической памяти – иммунологи­ческую, нейрологическую и т.д., а также играют существенную роль в регу­ляции биосинтетических процессов.

Структура и функции ДНК

ДНК имеет первичную, вторичную и третичную структуры. Первичная структура ДНК – порядок чередования дезоксирибонуклеозидмонофосфатов (дНМФ) в полинуклеотидной цепи. Сокращенно эту последовательность запи­сывают с помощью однобуквенного кода от 5 к 3 концу, например 5-А-Г-Ц-Т-Т-А-Ц-А-3. Первичная структура строго специфична и индивидуальна для каждой природной ДНК и представляет кодовую форму записи биологической информации (генетический код). Впервые доказательство генетической роли ДНК получено в 1944 г. Освальдом Эйвери с сотрудниками в опытах по транс­формации, осуществленных на бактериях. Содержание нуклеотидов в ДНК, под­чиняется закономерностям, выявленным Эрвином Чаргафом (1950): суммарное количество пуриновых оснований равно сумме пиримидиновых, причем количе­ство А равно количеству Т, а количество Г – количеству Ц. Эти закономер­ности определяются особенностями вторичной структуры ДНК.

Вторичная структура ДНК представляет собой спираль, состоящую из двух антипараллельных полинуклеотидных цепей, закрученных относительно друг друга и вокруг общей оси. Все основания цепей ДНК расположены стопкой внутри двойной спирали, а пентозофосфатный остов – снаружи. Полинуклео­тидные цепи удерживаются друг относительно друга за счет водородных связей между комплементарными основаниями. Дополнительная стабилизация спи­рали происходит за счет гидрофобных взаимодействий, возникающих между азо­тистыми основаниями в стопке. Выяснение вторичной структуры ДНК (Д.Уотсон, Ф.Крик, 1953) стало одним из величайших открытий в естествозна­нии, так как позволило раскрыть механизм передачи наследственной инфор­мации в ряду поколений.

Третичная структура ДНК различается у прокариотических и эукарио­тических организмов. У бактерий и вирусов, а также в митохондриях и хлоро­пластах эукариот ДНК имеют либо линейную, либо кольцевую форму, двух- или одноцепочечную. Двухцепочечные ДНК легко переходят в суперспирализован­ное состояние в результате дополнительного скручивания в пространстве двух­спиральной молекулы.

Третичная структура ДНК эукариотических клеток также выражена в многократной суперспирализации молекулы, однако, в отличие от прокариот, она осуществляется в форме комплексов ДНК с гистоновыми и негистоновыми белками. Такие дезоксинуклеопротеины называются хроматином.

Выделяют следующие уровни упаковки хроматина (Рис 5.1):

1.Нуклеосомный. Четыре гистона Н2А, Н2В, Н3 и Н4 (по 2 каждого типа) образуют октамерный белковый комплекс, который называют нуклеосомным кором. Молекула ДНК накручивается на поверхность этого кора, совершая 1,75 оборота (около 146 пар нуклеотидов). Такой комплекс гистоновых белков с ДНК является основной структурной еди­ницей хроматина и называется нуклеосомой. ДНК, соединяющую нук­леосомные частицы, называют линкерной ДНК. С нею связываются мо­лекулы гистона Н1, защищая эти участки от действия нуклеаз.

2.Соленоидный. Нуклеосомная нить скручивается в более толстые фиб­риллы – соленоиды. Их также называют хроматиновыми фибриллами.

3.Петлевой. Соленоидная фибрилла образует петли и дополнительно упако­вывается.

4.Метафазная хромосома. Петельные домены дополнительно конденсирутся и спирализуются, приобретают четкие формы.

Виды и особенности структурной организации РНК

Молекула РНК построена из одной полинуклеотидной цепи. Отдельные участки цепи образуют спирализованные петли – шпильки, за счет водород­ных связей между комплементарными азотистыми основаниями. Участки цепи РНК в таких спиральных структурах антипараллельны, но не всегда полно­стью комплементарны, в них встречаются неспаренные нуклеотидные ос­татки или одноцепочечные петли. Наличие вторичной структуры в виде спи­рализованных участков характерно для всех типов РНК. При взаимодействии спирализованных элементов вторичной структуры возникает упорядоченная третичная структура. Так, возможно образование дополнительных водородных связей между нуклеотидными остатками достаточно удаленными друг от друга, или связей между ОН-группами остатков рибозы и основаниями. Тре­тичная структура РНК стабилизирована ионами двухвалентных металлов (Mg²⁺).

Содержащиеся в клетке РНК различаются размером, составом, функ­циями и локализацией. В цитоплазме содержится стабильная РНК нескольких видов: транспортная (тРНК), матричная (мРНК), рибосомальная (рРНК). В ядре локализована ядерная РНК, основная часть которой представлена предше­ственниками цитоплазматических РНК.

Первичная структура всех мРНК, независимо от уникальности их коди­рующей последовательности, имеет одинаковое строение 5- и 3-концов. Так, на 5-конце присутствует модифицированный нуклеотид 7-метилгуанозин-5-трифосфат (кэп). Этот сайт распознается рибосомой. На 3-конце большинства мРНК присутствует последовательность нуклеотидов из 100-200 аденозинмо­нофосфатных остатков (полиА). Эта последовательность обеспечивает стабиль­ность мРНК, препятствуя её гидролизу. На долю мРНК приходится до 2% от всех РНК.

Пространственную структуру любых тРНК описывают универсальной мо­делью «клеверного листа». В состав тРНК входят минорные основания, которые поддерживают определенную третичную структуру молекулы и делают ее ус­тойчивой к действию нуклеаз цитоплазмы. 3- и 5-концы полинуклеотидной цепи спарены и образуют акцептирующий стебель, он завершается на 3-конце последовательностью ЦЦА. Противостоит акцептирующему стеблю антикодоно­вая петля, которая содержит в своей средней части антикодон, комплементар­ный кодону данной аминокислоты в мРНК. Каждая тРНК имеет свой специ­фический антикодон. Псевдоуридиловая петля осуществляет взаимодействие тРНК с рибосомой, дигидроуридиловая петля участвует во взаимодействии с аминоацил-тРНК-синтетазой. Функции добавочной петли мало исследованы, предполагается, что с её помощью уравнивается длина разных молекул тРНК. На долю тРНК приходится 15-16% от всех РНК.

Больше всего (80-82%) в клетке содержится рибосомальной РНК. Разли­чают 5S, 5.8S, 18S и 28S рРНК. Они имеют многочисленные спирализованные участки и образуют комплексы с белками – рибосомы. Рибосомы эукариоти­ческих клеток имеют константу седиментации 80S, состоят из двух субъеди­ниц. Малая 40S-субъединица содержит 18S РНК и 33 белка, большая 60S-субъ­единица содержит 28S, 5S и 5.8S РНК, а также 50 белков. рРНК имеют V-об­разную или Y-образную форму. Они образуют каркас, к которому прикрепля­ются белки, создавая плотно упакованный рибонуклеопротеин. Вторичная структура создается за счет коротких двухспиральных шпилек. Примерно треть молекулы представлена однотяжевыми участками, с которыми преимущест­венно связаны белки рибосом.

Лекция 6

Биосинтез Нуклеиновых кислот

Способность к передаче наследственных свойств путем переноса генети­ческой информации является уникальным свойством живых систем. В организ­мах существуют три варианта передачи генетической информации.

1.Репликация - перенос генетической информации в пределах одного класса нуклеиновых кислот (от ДНК к ДНК или у некоторых ви­русов от РНК к РНК).

2.Транскрипция – перенос информации между разными классами нук­леиновых кислот, бывает прямая (от ДНК к РНК) и обратная (от РНК к ДНК).

3.Трансляция – перенос генетической информации от мРНК к белку.

Центральная догма молекулярной биологии отражает направление пере­носа генетической информации в клетке: от ДНК через РНК к белку. Со­гласно ей, не может быть переноса информации от белка к РНК, но допус­кается перенос от РНК к ДНК. То есть, генетическая информация сущест­вует только в форме нуклеиновой кислоты и не может передаваться от аминокислотных последовательностей белка.

Биосинтез ДНК

Удвоение ДНК у эукариот проходит в S-фазу клеточного цикла. Ини­циацию репликации регулируют специфические сигнальные белковые молекулы – факторы роста. Они связываются с рецепторами клеточных мембран, гене­рируя сигнал, который и побуждает клетку к началу репликации. Одними из первых активируются гены, кодирующие белки циклины. Циклинзависимые киназы, связывая циклин, переходят в активную форму и фосфорилируют специфические белки, которые регулируют синтез ферментов, обеспечивающих репликацию.

Синтез новых цепей ДНК может произойти только при расхождении ро­дительских цепей. В точке начала репликаци (сайты инициации или орид­жины) происходит локальное расхождение цепей ДНК и образуются две репли­кативные вилки, движущиеся в противоположных направлениях.

В образовании репликативной вилки принимает участие ряд белков и ферментов (Рис. 6.1.):

- семейство ДНК-топоизомераз обеспечивает устранение суперспирализа­ции.

- ДНК-хеликазы, используя энергию АТФ, осуществляют разрыв водород­ных связей между полинуклеотидными цепями и распле­тают двойную спираль ДНК.

В поддержании этого участка ДНК в раскрученном состоянии участвуют ДНК-связывающие белки (ДСБ). Они связываются с одноцепочечной ДНК по всей длине разделившихся цепей, предотвращая их комплементарное взаимодействие.

Репликация ДНК осуществляется ДНК-зависимыми ДНК-полимеразами. Субстратами и одновременно источниками энергии для синтеза служат дАТФ, дГТФ, дЦТФ и дТТФ. Ферменты проявляют каталитическую активность только в присутствии предварительно раскрученной матричной двухцепочечной ДНК. Синтез цепей происходит в направлении 53 растущей цепи. Мат­ричная цепь всегда считывается в направлении 35, т. е. синтезируемая цепь всегда антипараллельна матричной цепи. В ходе репликации образуются 2 дочерние цепи, представляющие собой копии матричных цепей.

В синтезе эукариотических ДНК принимают участие 5 ДНК-полимераз. ДНК-полимераза  обеспечивает репликацию только митохондриальной ДНК. ДНК-полимеразы , , ,  участвуют в синтезе ДНК в ядре клеток.

Инициирует репликацию ДНК-полимераза . Фермент обладает сродством к определенному сайту одноцепочечной ДНК. Присоединяясь к нему, ДНК-поли­мераза синтезирует небольшой фрагмент РНК – праймер, состоящий из 8-10 рибонуклеотидов, к которому присоединяет еще около 50 дезоксирибонуклеоти­дов. Таким образом, ДНК-полимераза  синтезирует олигонуклеотид, состоя­щий из короткой последовательности РНК и фрагмента цепи ДНК.

Олигонуклеотид, синтезированный ДНК-полимеразой  и образующий небольшой двухцепочечный фрагмент с матрицей, позволяет присоединиться ДНК-полимеразе  и продолжить синтез новой цепи в направлении 53 по ходу раскручивания репликативной вилки. Выбор ДНК-полимеразой очередного нуклеотида определяется матрицей: включение нуклеотида в синтезируемую цепь ДНК невозможно без предварительного связывания азотистого основания водородными связями с комплементарным нуклеотидом матричной цепи.

В каждой репликативной вилке идет одновременно синтез двух дочерних цепей. Направление синтеза цепи ДНК совпадает с направлением движения реп­ликативной вилки лишь для одной из вновь синтезируемых цепей (лидирую­щая цепь). На второй матричной цепи синтез новой цепи осуществляется двумя ферментами: ДНК-полимеразой  и ДНК-полимеразой  в направлении 53, но против движения репликативной вилки. Поэтому вторая цепь син­тезируется прерывисто, короткими фрагментами, которые по имени открыв­шего их исследователя называют «фрагменты Оказаки». Дочернюю цепь, синтез которой происходит фрагментами, а потому отстает, называют отстающей цепью.

Каждый фрагмент Оказаки содержит праймер. Праймеры удаляет ДНК-полимераза , после чего присоединяет к ОН-группе на 3-конце предыдущего фрагмента дезоксирибонуклеотиды в количестве, равном вырезанному фраг­менту и таким образом заполняет брешь, возникающую при удалении рибо­нуклеотидов.

Фермент ДНК-лигаза катализирует образование фосфодиэфирной связи между 3-ОН-группой дезоксирибозы одного фрагмента и 5-фосфатом сле­дующего. Реакция протекает с затратой энергии АТФ. Таким образом из множества фрагментов Оказаки образуется непрерывная цепь ДНК.

Терминация синтеза ДНК наступает вследствие исчерпания матрицы при встрече двух репликативных вилок.

После окончания репликации происходит метилирование вновь образован­ных цепей ДНК. Наличие СН₃-групп необходимо для формирования структуры хромосом, а также для регуляции транскрипции генов.

На каждом конце хромосомы имеются неинформативные повторяющиеся последовательности нуклеотидов – теломеры. В соматических клетках с ка­ждым актом репликации теломеры укорачиваются из-за невозможности до­строить ДНК на месте 5-праймера. Это укорочение является важным факто­ром, определяющим продолжительность жизни клетки. Однако в эмбриональных и других быстро делящихся клетках потери концов хромосом недопустимы, так как укорочение хромосом будет происходить очень быстро. У эукариотиче­ских клетках имеется фермент теломераза, обеспечивающий восстановление недореплицированных 5-концов. В большинстве клеток теломераза неактивна, так как соматическая клетка имеет длину теломерной ДНК, достаточную для времени жизни клетки и её потомства. Небольшая активность теломе­разы обнаруживается в клетках с высокой скоростью обновления, таких как лимфоциты, стволовые клетки костного мозга, клетки эпителия и т.д.

Репарация ДНК

Высокая стабильность ДНК обеспечивается не только консервативностью её структуры и высокой точностью репликации, но и наличием в клетках всех живых организмов специальных систем репарации, устраняющих из ДНК воз­никающие в ней повреждения.

Действие различных химических веществ, ионизирующей радиации а также ультрафиолетового излучения может вызвать следующие нарушения структуры ДНК:

- повреждения одиночных оснований (дезаминирование, ведущее к превраще­нию цитозина в урацил, аденина в гипоксантин; алкилирование осно­ваний; включение аналогов оснований, инсерции и делеции нуклеотидов);

- повреждение пары оснований (образование тиминовых димеров);

- разрывы цепей (одиночные и двойные);

- образование перекрестных связей между основаниями, а также сшивок ДНК-белок.

Некоторые из указанных нарушений могут возникать и спонтанно, т.е. без участия каких-либо повреждающих факторов.

Любой тип повреждений ведет к нарушению вторичной структуры ДНК, что является причиной частичного или полного блокирования репликации. Такие нарушения конформации и служат мишенью для систем репарации. Процесс восстановления структуры ДНК основан на том, что генетическая информация представлена в ДНК двумя копиями – по одной в каждой из це­пей двойной спирали. Благодаря этому повреждение в одной из цепей может быть удалено репарационным ферментом, а данный участок цепи ресинтези­рован в своем нормальном виде за счет информации, содержащейся в неповреж­денной цепи.

В настоящее время выявлены три основных механизма репарации ДНК: фотореактивация, эксцизионная и пострепликативная репарация. Последние два типа называются также темновой репарацией.

Фотореактивация заключается в расщеплении ферментом фотолиазой, активируемой видимым светом, тиминовых димеров, возникающих в ДНК под действием ультрафиолетового излучения.

Эксцизионная репарация заключается в узнавании повреждения ДНК, вы­резании поврежденного участка, ресинтезе ДНК по матрице интактной це­почки с восстановлением непрерывности цепи ДНК. Такой способ называют также репарацией по типу выщепления – замещения, или более образно механизм «режь – латай». Эксцизионная репарация представляет собой мно­гоэтапный процесс и заключается в:

1) «узнавании» повреждения;

2) надрезании одной цепи ДНК вблизи повреждения (инцизии);

3) удалении поврежденного участка (эксцизии);

4) ресинтезе ДНК на месте удаленного участка;

5) восстановлении непрерывности репарируемой цепи за счет образования фосфодиэфирных связей между нуклеотидами

Репарация начинается с присоединения ДНК-N-гликозилазы к повреж­денному основанию. Существует множество ДНК-N-гликозилаз, специфичных к разным модифицированным основаниям. Ферменты гидролитически расщепляют N-гликозидную связь между измененным основанием и дезоксирибозой, это приводит к образованию АП (апуринового-апиримидинового) сайта в цепи ДНК (первый этап). Репарация АП-сайта может происходить при участии только ДНК-инсертазы, которая присоединяет к дезоксирибозе основание в соответствии с правилом комплементарности. В этом случае нет необходимости разрезать цепь ДНК, вырезать неправильный нуклеотид и репарировать разрыв. При более сложных нарушениях структуры ДНК необходимо участие всего комплекса ферментов, участвующих в репарации (Рис. 6.2.): АП-эндонуклеаза распознает АП-сайт и разрезает возле него цепь ДНК (II этап). Как только в цепи воз­никает разрыв, в работу вступает АП-экзонуклеаза, которая удаляет фраг­мент ДНК, содержащий ошибку (III этап). ДНК-полимераза  застраивает воз­никшую брешь по принципу комплементарности (IV этап). ДНК-лигаза соеди­няет 3-конец вновь синтезированного фрагмента с основной цепью и завер­шает репарацию повреждения (V этап).

Пострепликативная репарация включается в тех случаях, когда эксци­зионная не справляется с устранением всех повреждений ДНК до её реплика­ции. В этом случае воспроизведение поврежденных молекул приводит к появле­нию ДНК с однонитевыми пробелами, а нативная структура восстанавлива­ется при рекомбинации.

Врожденные дефекты системы репарации являются причиной таких на­следственных заболеваний, как пигментная ксеродерма, атаксия-телеангиэк­тазия, трихотиодистрофия, прогерия.

Биосинтез РНК

Транскрипция – первая стадия реализации генетической информации в клетке. В ходе этого процесса происходит синтез цепи РНК, нуклеотидная последовательность которой комплементарна последовательности одной из цепей ДНК. В отличие от репликации, при которой копируется вся хромосома, транскрипция протекает избирательно. Процесс управляется особыми регулятор­ными последовательностями, указывающими начало и конец участков ДНК, подлежащих транскрипции. Единицы процесса транскрипции несут информацию о структуре одного или нескольких белков. Участок ДНК, в котором заклю­чена информация о структуре одного белка, называется структурным геном. Внутри этих участков существуют разрывы – интроны, которые не несут генетической информации, относящейся к синтезу белка, кодируемого данным геном. Кодирующие части гена называются экзонами.

Субстратами и одновременно источниками энергии для транскрипции являются рибонуклеозидтрифосфаты (ЦТФ, ГТФ, АТФ, УТФ). Процесс осуществ­ляется ДНК-зависимой РНК-полимеразой, которая у большинства изученных организмов представляет собой комплекс 4 и более неидентичных субъединиц, выполняющих разные роли. В ядрах эукариот обнаружены 3 специализирован­ные РНК-полимеразы: РНК-полимераза I, синтезирующая 45 S пре-рРНК; РНК-полимераза II, ответственная за синтез пре-мРНК; РНК-полимераза III, синтезирующая пре-тРНК и 5 S рРНК.

В процессе транскрипции различают 3 стадии: инициацию, элонгацию и терминацию. Инициация начинается с активации промотора (знак начала транскрипции). Это происходит при участии особого белка – ТАТА-фактора, называемого так потому, что он взаимодействует со специфической последова­тельностью нуклеотидов промотора – ТАТААА- (ТАТА-бокс). Присоединение ТАТА-фактора облегчает взаимодействие промотора с РНК-полимеразой. Фак­торы инициации вызывают изменение конформации фермента и раскручивание спирали ДНК с образованием транскрипционной вилки, в которой матрица ДНК доступна для инициации синтеза цепи РНК. РНК-полимераза синтези­рует небольшой олигонуклеотид. После этого к ней присоединяются факторы элонгации, значительно повышающие активность фермента и облегчающие расхождение цепей ДНК. РНК-полимераза перемещается вдоль молекулы ДНК и копирует одну из её цепей, последовательно присоединяя нуклеотиды в обра­зующейся РНК в соответствии с принципом комплементарности. Синтез цепи РНК идет от 5- к 3-концу, при этом матричная цепь ДНК всегда анти­параллельна синтезируемой мРНК. По мере движения РНК-полимеразы расту­щая цепь РНК отходит от матрицы, а двойная спираль ДНК позади фермента восстанавливается. Когда РНК-полимераза достигает конца копируемого уча­стка (терминатора), фермент и первичный транскрипт отделяются от матрицы. Этот этап происходит с участием факторов терминации.

Регуляция транскрипции

Транскрипция не связана с фазами клеточного цикла; она может ус­коряться и замедляться в зависимости от потребности клетки или орга­низма в определенном белке. Такое избирательное функционирование возможно благодаря существованию механизмов регуляции генной экспрессии, которые действуют на разных уровнях. С помощью этих механизмов клетка экономит свои ресурсы и в каждый момент времени синтезирует определенный набор ве­ществ, а не весь возможный их спектр.

Среди нескольких уровней регуляции экспрессии генов наиболее существен­ной и часто используемой является регуляция синтеза белков, которая осу­ществляется на уровне транскрипции. Суть такого типа регуляции сводится к ускорению или замедлению процессов транскрипции определенных генов, что в конечном итоге отражается на скорости синтеза их продуктов.

Наилучшим образом регуляция транскрипции генов изучена у прока­риот. Их особенностью является организация генов, участвующих в одном ме­таболическом пути, в особые структурные единицы – опероны. Оперонами называют участки молекулы ДНК, которые содержат информацию о группе функционально связанных структурных белков, и регуляторную зону, кон­тролирующую транскрипцию этих генов. Структурные гены оперона экспрес­сируются согласованно: либо все сразу, либо ни один из них. Это дает воз­можность прокариотам «включать» и «выключать» транскрипцию такой группы генов одновременно. Связывание РНК-полимеразы с промотором зависит от присутствия белка-репрессора на смежном с промотором участке – опера­торе. Белок-репрессор (продукт гена-регулятора, не входящего в оперон) син­тезируется в клетке с постоянной скоростью и имеет сродство к оператор­ному участку. Структурные участки промотора и оператора частично пере­крываются, поэтому присоединение белка-репрессора к оператору создает стери­ческое препятствие для присоединения РНК-полимеразы и соответственно де­лает невозможной транскрипцию структурных генов.

Гипотеза оперона была предложена Ф.Жакобом и Ж.Моно на основании данных, полученных при изучении свойств лактозного оперона E.coli, т.е. опе­рона, в котором закодированы белки, участвующие в усвоении лактозы. Клетки кишечной палочки обычно используют в качестве источника углерода глюкозу. Но, если в среде культивирования глюкозу заменить на лактозу, клетки в течение нескольких минут перестраиваются и начинают утили­зировать лактозу. Теория оперона объясняет это явление следующим образом. В отсутствие индуктора (лактозы) белок-репрессор связан с оператором, бло­кируя таким образом транскрипцию структурных генов. Когда в среде появ­ляется индуктор, т.е. лактоза, то он присоединяется к белку-репрессору, из­меняет его конформацию, снижает сродство к оператору и способствует отде­лению репрессора от оператора. РНК-полимераза связывается со ставшим дос­тупным промотором и транскрибирует структурные гены. Это явление на­зывается индукцией синтеза белков.

Регуляция транскрипции генов высших организмов сходна с регуляцией экспрессии генов прокариот. Основное различие состоит в значительно большем количестве участков ДНК и регуляторных факторов, контролирующих этот процесс. Скорость транскрипции в основном определяется скоростью формирования инициаторного комплекса. В настоящее время идентифицировано более 100 белков, способных взаимодействовать со специфическими регуляторными последо­вательностями ДНК, влияя тем самым на процесс сборки транскрипционного комплекса. Эти белки имеют один или несколько доменов, обеспечивающих вы­полнение регуляторных функций:

ДНК-связывающие домены, ответственные за узнавание и связывание ре­гуляторных факторов со специфическими участками на молекуле ДНК;

домены, активирующие транскрипцию за счет связывания с транс­крипционными факторами, коактиваторами или РНК-полимеразой;

антирепрессорные домены, благодаря которым белки способны взаимодейст­вовать с гистонами нуклеосом и освобождать участки ДНК для транскрипции;

домены, связывающие лиганды. Присоединение лиганда способствует фор­мированию ДНК-связывающего участка, узнающего специфическую последова­тельность в регуляторной зоне ДНК и индуцирующего/подавляющего транс­крипцию определенных генов. К лигандам-индукторам транскрипции отно­сятся стероидные гормоны, ретиноевая кислота, кальцитриол и гормоны щи­товидной железы. Репрессорами могут быть конечные продукты метаболических путей.
На молекуле ДНК на небольшом расстоянии до стартовой точки транскрипции имеются короткие специфические последовательности: ЦААТ-эле­мент, ЦГ-бокс и октамерный бокс, узнающие факторы транскрипции. Эти элементы есть во всех клетках, и постоянно транскрибируемые гены нужда­ются только в них. В то же время для генов, подвергающихся адаптивной ре­гуляции, обнаружены участки молекулы ДНК, более удаленные от промотора, но тоже участвующие в транскрипции. Эти нуклеотидные последовательности бывают двух типов. Энхансеры – участки ДНК, присоединение к которым ре­гуляторных белков увеличивает скорость транскрипции. Если же участки ДНК, связываясь с белками, обеспечивают замедление транскрипции, то их называют сайленсерами.