ФИЗХИМ ЭКЗАМЕН. Виды медицинских лабораторий. Организация работы
 Скачать 0.68 Mb.
|
|
Электрохимические методы анализа. Вольтамперометрия и полярография. ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЯ основана на изучении поляризационных или вольтамперных кривых (зависимости силы тока I от напряжения Е), которые получают в процессе электролиза раствора анализируемого вещества при постепенном повышении напряжения с одновременной фиксацией при этом силы тока. Электролиз проводят с использованием легкополяризуемого электрода с небольшой поверхностью, на котором происходит электровосстановление или электроокисление вещества. В вольтамперометрии аналитическим сигналом является максимальный анодный или катодный ток электропревращения определяемого элемента, регистрируемый на вольтамперограмме в виде пика (или нескольких пиков для различных веществ). В качестве индикаторных микроэлектродов используют стационарные и вращающиеся - из металла (ртуть, серебро, золото, платина), углеродных материалов (напр., графит), а также капающие электроды (из ртути, амальгам, галлия). Последние представляют собой капилляры, из которых по каплям вытекает жидкий металл. Применяют: для количественного анализа неорганических и органических в-в в очень широком интервале содержаний - от 10-10% до десятков %; для исследования кинетики и механизма электродных процессов; для изучения строения двойного электрического слоя, равновесия комплексообразования в растворе, образования и диссоциации интерметаллических соединений в ртути и на поверхности твердых электродов и др. Вольтамперометрия с использованием капающих электродов, потенциал которых меняется медленно и линейно, называется ПОЛЯРОГРАФИЕЙ. Полярографический метод основан на автоматической регистрации силы тока при постепенном увеличении напряжения на электродах, погруженных в исследуемый раствор. Изменение разности потенциалов между электродами осуществляется с помощью потенциометра. Сила возникающего при этом тока измеряется гальванометром. Исследуемый раствор не должен содержать кислорода, который может восстанавливаться электролитически и искажать результаты. Поэтому перед началом работы через раствор пропускают какой-либо инертный газ, например, азот, а затем изолируют раствор от атмосферы. В этих экспериментах капельный ртутный электрод является рабочим (или индикаторным). Он способен «поляризоваться» (сила тока по мере достижения этим электродом прилагаемого к нему потенциала если и возрастает, то очень незначительно). Поверхность электрода в результате образования ртутных капель постоянно обновляется, и поэтому продукты реакции его не загрязняют. Второй электрод не поляризуемый. Основной недостаток полярографии заключается в том, что для интерпретации получаемых результатов требуется значительный опыт, кроме того, побочные эффекты довольно часты и не всегда легко устранимы. В связи с этим полярографический метод не слишком широко применяется в биохимических лабораториях. Оптические измерительные приборы, используемые в клинической лабораторной диагностике. К оптическим измерительным приборам, используемым в клинической лабораторной диагностике, относятся: — фотометры и спектрофотометры. При использовании фотометра осуществляют определённое пространственное ограничение потока излучения и регистрацию его приёмником излучения с заданной спектральной чувствительностью. Спектрофотометр — прибор, предназначенный для измерения отношений двух потоков оптического излучения, один из которых — поток, падающий на исследуемый образец, другой — поток, испытавший то или иное взаимодействие с образцом; — денситометры, предназначающиеся для сканирования, т. е. количественного определения содержания разделенных на носителях (хроматографической бумаге, пленках ацетатцеллюлозы, геле, пластинах с тонким слоем силикагеля) веществ; — нефелометры и турбидиметры, позволяющие судить о содержании взвешенных частиц в объеме жидкости по интенсивности светорассеяния (используются, в частности, для оценки выраженности коллоидно-осадочных реакций); — флюориметры, применяемые для определения концентрации сложных органических веществ (витаминов, гормонов и др.) путем измерения интенсивности флюоресценции (в том числе поляризационные); — люминометры, измеряющие количество излученного света (светосумму), зависящее от содержания в биологических жидкостях некоторых веществ (ацилгидро-перекиси и других), при разложении которых ионами металлов переменной валентности либо другими реактивами происходит кратковременное излучение света; — пламенные фотометры, используемые для измерения интенсивности светоизлучения (эмиссии) внесенных в пламя ионов металла; — атомные абсорбциометры, определяющие содержание ионов металлов (в том числе относящихся к микроэлементам) в разных биологических жидкостях; при измерениях, как и в методе фотометрии пламени, анализируемый раствор вводится в пламя в виде аэрозоля с помощью распылителя. Однако измеряется не излучение, а поглощение монохроматического светового потока атомами исследуемого элемента. Метод позволяет определить содержание элементов, находящихся в пламени в виде свободных атомов; — атомно-эмиссионные многоканальные спектрометры. Методика исследования на приборах такого типа сводится к следующему. Подготовленная к анализу проба помещается в камеру, где под действием электрического разряда вещество испаряется, а его атомы возбуждаются. Излучаемый атомами световой поток специальной оптической системой направляется в полихроматор, где происходит его разложение по спектральным составляющим. Регистрация спектра осуществляется с помощью оптического многоканального анализатора, что позволяет по оценке интенсивности или площади спектральных линий установить содержание 10 и более химических элементов в одной пробе. Общая характеристика хроматографического метода анализа. Хроматография – это метод разделения и определения веществ, основанный на распределении компонентов между двумя фазами – подвижной и неподвижной. Неподвижной (стационарной) фазой служит твердое пористое вещество (часто его называют сорбентом) или пленка жидкости, нанесенная на твердое вещество. Подвижная фаза (элюент) представляет собой жидкость или газ, протекающий через неподвижную фазу, иногда под давлением. Компоненты анализируемой смеси (сорбаты) вместе с подвижной фазой передвигаются вдоль стационарной фазы. Ее обычно помещают в стеклянную или металлическую трубку, называемую колонкой. В зависимости от силы взаимодействия с поверхностью сорбента (за счет адсорбции или по какому-либо другому механизму) компоненты будут перемещаться вдоль колонки с разной скоростью. Одни компоненты останутся в верхнем слое сорбента, другие, в меньшей степени взаимодействующие с сорбентом, окажутся в нижней части колонки, а некоторые и вовсе покинут колонку вместе с подвижной фазой (такие компоненты называются неудерживаемыми, а время их удерживания определяет “мертвое время” колонки). Таким образом происходит быстрое разделение сложных смесей компонентов. В настоящее время хроматографией также называют такие физико-химические методы разделения компонентов смесей газов, паров, жидкостей/растворённых веществ, которые осуществляют путём сорбции в динамических условиях. Сорбция – любой процесс поглощения одного вещества другим. Адсорбция – изменение концентрации вещества на границе раздела фаз. Абсорбция – поглощение одного вещества другим во всём объёме сорбента. Достоинства хроматографических методов: 1. Разделение носит динамический характер, причем акты сорбции-десорбции разделяемых компонентов повторяются многократно. Этим обусловлена значительно большая эффективность хроматографического разделения по сравнению со статическими методами сорбции и экстракции. 2. При разделении используют различные типы взаимодействия сорбатов и неподвижной фазы: от чисто физических до хемосорбционных. Это обуславливает возможность селективного разделения широкого круга веществ. 3. На разделяемые вещества можно накладывать различные дополнительные поля (гравитационное, электрическое, магнитное и др.), которые, изменяя условия разделения, расширяют возможности хроматографии. 4. Хроматография – гибридный метод, сочетающий одновременное разделение и определения нескольких компонентов. 5. Хроматография позволяет решать, как аналитические задачи (разделение, идентификация, определение), так и препаративные (очистка, выделение, концентрирование). Разновидности хроматографических методов: Адсорбционная. Основу данного метода составляет различие сорбируемости разделяемых абсорбентом твердых веществ. Распределительная. У истоков метода стоит растворимость элементов сложного вещества в элюенте и неподвижной фазе. Ионообменная. Этот вид исследования основывается на различии постоянных между неподвижной фазой и монокомпонентами исследуемой смеси. Эксклюзионная. В основе — разная способность проницаемости в неподвижную фазу молекул компонентов. Осадочная. Этот метод предполагает разную способность элементов смеси выпадать в осадок на твердой неподвижной фазе. По агрегатному состоянию элюента хроматографию классифицируют на: Газовую. Ее методы исследования используются для дифференцирования газов на монокомпоненты, определения примесей в воздухе, жидкости, почве, продуктах промышленности. Хроматографический анализ данного типа активно применяется для определения состава лекарственных препаратов и выхлопных газов, а также в сфере криминалистики. Жидкостную. Ее методы эффективны при анализе, очистке и разделении синтетических полимеров, медикаментов, гормонов, белков и прочих биологически важных веществ. Благодаря высокочувствительным детекторам этот способ позволяет работать с малым объемом сложных веществ, что чрезвычайно важно при проведении биологических исследований. Метод Мора. Сущность. Определение точки эквивалентности. Применение. Метод Мора относится к аргентометрии и основан на образовании ионами серебра с галогенидами осадков и фиксированием точки эквивалентности с помощью осадительного индикатора хромата калия [К2CrO4]. Титрант: стандартизированный раствор нитрата серебра AgNO3. Стандартный раствор: раствор NaCl. Растворимость АgСl значительно меньше, чем растворимость Аg2СгO4. Поэтому если постепенно добавлять раствор АgNOз к раствору, содержащему Сl- и CrO42-, то ПР AgСl достигается раньше ПР Аg2СгO4. Это означает, что вначале образуется труднорастворимая соль. После того как хлорид-ионы будут практически полностью выделены в виде АgС1, избыток нитрата серебра взаимодействует с индикатором и появляется осадок. Происходит изменение окраски титруемой смеси и таким образом определяется конец титрования. Осадок хромата серебра [Аg2СгО4] имеет кирпично-красный цвет. Однако такой цвет можно наблюдать в сильно перетитрованном растворе. В действительности надо титровать только до ясно заметного перехода лимонно-желтой окраски в желто - розовую. Метод Мора не применим при титровании в кислой среде, так как хромат серебра растворим в кислотах и в их присутствии не выпадает. Метод Мора находит широкое применение при анализе пищевых продуктов. Количество поваренной соли в колбасе, соленой рыбе, масле и других продуктах определяют по методу Мора. Этот метод применяется также для определения хлоридов в воде. Метод Мора используется и при анализе некоторых фармацевтических препаратов, например, хлоридов и бромидов натрия и калия. Перманганатометрия. Сущность. Определение точки эквивалентности. Применение. Перманганатометрическое титрование — метод анализа, в котором титрантом служит раствор перманганата калия. В процессе титрования анализируемого раствора малиново-фиолетовая окраска раствора перманганата обесцвечивается. Однако после достижения точки эквивалентности первая же избыточная капля раствора перманганата окрашивает титруемую жидкость в розовый цвет. Индикатором в данном случае является перманганат калия. Поэтому обычно при перманганатометрических определениях посторонние индикаторы не добавляют. Вблизи точки эквивалентности происходит резкое изменение редокс-потенциала — скачок титрования. В слабокислой, щелочной и нейтральной средах реакция протекает с образованием осадка диоксида марганца (IV) бурого цвета, что затрудняет определение ТЭ. Кроме того, окислительная активность перманганата калия в кислой среде гораздо выше, чем в щелочной. В связи с этим титрование перманганатом калия чаще всего проводят в сильнокислых средах: чаще всего используют серную кислоту. Хлороводородную и азотную кислоты применять не следует, так как в их присутствии могут идти конкурирующие окислительно-восстановительные реакции. Определение точки эквивалентности. Как было сказано, в пер- манганатометрии сам титрант КМnО4 является одновременно и индикатором: прибавление одной избыточной капли титранта в ТЭ приводит к появлению розовой окраски титруемого раствора. При этом необходимо учитывать, что окраска неустойчива, раствор может обесцветиться, так как избыток перманганат-ионов взаимодействует с образовавшимися в растворе ионами марганца. Перманганатометрия используется для определения общей окисляемости воды или почвы. При этом с MnO4– – ионом в кислой среде реагируют все органические компоненты. В биохимии и в клиническом анализе методом перманганатометрии определяют содержание мочевой кислоты в моче, ионы Ca2+ в кровяной сыворотке, сахара в крови. Метод Фольгарда. Сущность. Определение точки эквивалентности. Применение. Метод Фольгарда основан на титровании раствора, содержащего ионы серебра, стандартными растворами роданида аммония/калия NH4SCN или KSCN. В качестве индикатора используется специфический индикатор – раствор соли железа (III), например, железоаммонийных квасцов NH4Fe(SO4)2*12H2O. Прямым титрованием в этом методе определяются только ионы серебра; При добавлении роданида к раствору, содержащему Ag+, образуется белый осадок AgSCN. Пока не достигнут момент эквивалентности, концентрация ионов SCN- в растворе (насыщенный раствор над осадком AgSCN) слишком мала для образования комплекса с Fe3+. После точки эквивалентности одна избыточная капля роданида создает достаточную концентрацию для протекания реакции, приводящей к окрашиванию раствора в красный цвет. Обратным титрованием определяют анионы, осаждаемые ионами серебра (хлориды, бромиды, иодиды, роданиды и др.) К раствору определяемого аниона добавляют известное избыточное количество раствора нитрата серебра (определенный объем раствора с известной концентрацией). Часть ионов серебра, эквивалентная количеству присутствующим в растворе анионам расходуется на выпадение осадка соли серебра, остальные ионы Ag+ остаются в растворе. Для определения количества, оставшихся в растворе ионов Ag+ проводят титрование роданидом калия в присутствии железоаммонийных квасцов. Количество определяемых анионов в титруемом растворе рассчитывают по формуле обратного титрования. Метод Фольгарда имеет преимущество перед методом Мора в том, что он применим не только в нейтральной, но и в кислой среде. А наличие свободных кислот способствует получению более точных результатов. Поэтому этот метод применяется чаще, чем метод Мора. В клинических исследованиях метод Фольгарда применяют для определения хлоридов в крови. В фармацевтическом анализе этот метод используется для количественного определения йодидов калия и натрия и определения содержания брома в бромкамфоре. Колориметрические методы. Метод стандартного ряда. Метод уравнивания окраски. Колориметрия использует зависимость между интенсивностью окраски и концентрацией раствора. Обычно, чем выше концентрация, тем интенсивнее окраска раствора. Различают субъективные (визуальные) и объективные (фотоколориметрические) методы колориметрии. В первом случае оптическую плотность определяют, сравнивая окраску исследуемого раствора с окраской серии стандартных (эталонных) растворов, а также при помощи визуальных колориметров, методов цветной шкалы, разбавления, колориметрического титрования, уравнивания. В объективных методах колориметрии используют фотоэлектрические колориметры. Действие колориметра основано на свойстве окрашенных растворов поглощать проходящий через них свет тем сильнее, чем выше в них концентрация с окрашивающего вещества. Все измерения с помощью колориметра производятся в монохроматическом свете того участка спектра, который наиболее сильно поглощается данным веществом в растворе (и слабо – другими компонентами раствора). Поэтому колориметры снабжаются набором светофильтров. Применение различных светофильтров с узкими спектральными диапазонами пропускаемого света позволяет определять по отдельности концентрации разных компонентов одного и того же раствора. Колориметрия – один из наиболее простых методов абсорбционного анализа, основанный на измерении поглощения света окрашенными растворами. Из всех оптических методов колориметрический анализ имеет в настоящее время наиболее важное значение для биологических и агрохимических исследований. С помощью этого метода изучают содержание большинства микроэлементов в различных объектах, так как он отличается высокой чувствительностью. Колориметрия обладает рядом преимуществ перед весовым анализом. Колориметрические определения выполняются гораздо быстрее. Если в весовом анализе химическая реакция является только началом определения, за которым следует ряд длительных операций, то в колориметрии после химической реакции сразу производят сравнение окрасок. 1. Метод стандартных серий (метод цветной шкалы). Приготавливают ряд стандартных растворов какого-либо вещества с постепенно изменяющимися концентрациями в определенном объеме растворителя. Помещают определенный объем каждого стандартного и такой же объем анализируемого раствора в пробирку, добавляют равные объемы необходимых реактивов. Сравнивают интенсивность полученной окраски исследуемого и стандартных растворов. Рекомендуется для получения более точных результатов приготовить промежуточные серии стандартных растворов. 2. Метод уравнивания. Сравнение интенсивности окрасок анализируемого и стандартного растворов проводят в колориметрах. Метод основан на том, что, изменяя толщину слоя двух растворов с различной концентрацией одного и того же вещества, добиваются такого состояния, при котором интенсивность светового потока, прошедшего через оба раствора, будет одинакова — наступает оптическое равновесие. Фотоэлектроколориметрия. Устройство КФК-3. Построение градуировочных кривых. |