Пособие_по_выживанию_на_вирусологии. Вирусология и этапы ее развития 1 Отличия вирусов от прокариотов и эукариотов 6
 Скачать 102.99 Kb.
|
Тропизм вирусовТРОПИЗМ ВИРУСОВ (греч. tropos поворот, направление; вирусы) — термин, характеризующий свойство отдельных вирусов поражать преимущественно те или иные органы и ткани инфицируемого ими организма. Термин «тропизм вирусов» сохранил лишь историческое значение. При создании первых классификаций вирусов сведения об их основной локализации в организме использовали в качестве определяющего признака, что привело к выделению ряда семейств и родов с соответствующими названиями (аденовирусы, кишечные вирусы — энтеровирусы и др.), сохранившимися и в современных классификациях (см. Вирусы) Онкогенные вирусыОбщая характеристика онкогенных вирусов Опухолевый процесс характеризуется беспредельным размножением трансформированных под действием канцерогенных факторов клеток в организме человека. Ряд вирусов относятся к группе биологических канцерогенов. Их называют онкогенными вирусами. К ним принадлежат отдельные виды и типы ДНК-содержащих и РНК-содержащих вирусов. К ДНК-содержащим онкогенным вирусам относят вирус папилломы человека (основные онкопатогены – ВПЧ 16 и 18-го типов); вирус герпеса 8-го типа, вирус Эпштейна-Барр, вирус гепатита В и некоторые другие. К наиболее изученным РНК-содержащим онковирусам, относится вирус 1-го типа T-клеточного лейкоза (HTLV-1), вирус гепатита С. Общий механизм действия онкогенных вирусов связан с их воздействием на определенные точки мишени генетического аппарата клетки: протоонкогены, гены-супрессоры, гены, контролирующие апоптоз, и гены, ответственные за репарацию. При повреждении этих генов клетки трансформируются, перестают подчиняться механизмам тканевого управления процессом пролиферации и приобретают способность к неограниченному делению. Согласно оценкам, до 20% всех случаев злокачественных новообразований может быть связано с опухолеродными вирусами. Онкогенные вирусы папилломы человека (ВПЧ) Обшая характеристика Само название «папилломавирусы» происходит от лат. рapilla – пузырь и греч. -оma – опухоль. Они относятся к ДНК-содержащим вирусам, которые вызывают образование папиллом на коже или слизистых оболочках человека и животных. Как биологические канцерогены, данные вирусы могут вызывать у человека злокачественные опухоли шейки матки, внешних половых органов, прямой кишки. 292 В больших количествах ВПЧ содержатся в папилломатозных образованиях (бородавках). Возбудители передаются при тесном контакте; распространены повсеместно. Методы диагностики вирусных инфекцийВирусная этиология инфекционных заболеваний может быть установлена только с помощью различных методов лабораторной диагностики вирусных инфекций. Целью диагностики является индикация и идентификация вирусов в клиническом материале, полученном от пациента. Индикация – это обнаружение вирусов в клиническом материале или в системе для вирусного культивирования (культуре клеток, курином эмбрионе и т.д.). Во многих случаях эффективная индикация позволяет провести предварительное определение вируса. Идентификация – это точное установление рода, вида, варианта или типа вируса. Для индикации и идентификации вирусов в медицинских целях используется обширный набор лабораторных методов исследования. 1.7.1. Генетические методы исследования в медицинской вирусологии Поскольку действующая классификация вирусов базируется на их генетическом анализе, ведущими среди методов исследования становятся молекулярно-генетические способы идентификации вирусов с определением их нуклеиновой кислоты в клиническом материале. Генетические тесты позволяют обнаружить вирусы в минимальной концентрации и в кратчайшие сроки. Доминирующими в генодиагностике вирусов сейчас являются методы амплификации нуклеиновых кислот (МАНК); основной из них – полимеразная цепная реакция (ПЦР). Технология ПЦР применяется также в наиболее современных методах генодиагностики, включая определение последовательности (секвенирование) вирусных нуклеиновых кислот. 37 Используя специфичные праймеры, ПЦР позволяет быстро и с высокой чувствительностью проводить как индикацию (обнаружение) вируса, так и его генетическую идентификацию (определение вида, геногруппы, типа или субтипа вируса). Базовый вариант ПЦР выявляет вирусную ДНК; ПЦР с обратной транскрипцией – вирусную РНК; ПЦР в режиме реального времени определяет количество вирусных нуклеиновых кислот в образцах (вирусную нагрузку); мультиплексная ПЦР может одновременно выявлять несколько вирусов. Также для определения вирусов в материале применяют метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот. На принципе гибридизации основано действие ДНК- и РНК-микрочипов (microarrays), где массив из сотен или даже тысяч зондов, комплементарных разным вирусным ДНК или РНК, адсорбирован в микроячейках на твердой фазе. Достоинством способа является одновременное определение многих вирусов в клинических образцах. Это требуется, например, для быстрой и точной диагностики респираторных или кишечных вирусных инфекций. В самом ближайшем будущем универсальным способом диагностики вирусных инфекций может стать множественное параллельное секвенирование нуклеиновых кислот, выделенных из клинического материала. Данная технология основана на революционных методах «секвенирования нового поколения», которые были разработаны в начале XXI века. Их называют также методами «ультраглубокого секвенирования» (УГС), поскольку каждый анализируемый участок нуклеиновой кислоты (или «рид») «прочитывается» не менее 100 раз. Это значительно снижает вероятность ошибок при диагностике. Ряд таких методов уже активно используется в практике (пиросеквенирование, технологии Illumina или SOLiD и другие). Принцип некоторых из них заключается в амплификации в большом количестве изучаемой ДНК методом ПЦР на твердой или липидной фазе, переводом ее в одноцепочечную форму и проведении полимеразной или лигазной реакции на полученной исходной ДНКматрице. При этом присоединение каждого нуклеотида или зонда сопровождается флюоресцентным сигналом, который регистрируется детектором. Такие методики позволяют анализировать миллиарды перекрывающихся участков изучаемой нуклеиновой кислоты разной длины в течение 1 теста. Дальнейший анализ полученных данных проводится методами биоинформатики с применением сложных 38 вычислительных алгоритмов. В результате можно провести полногеномный анализ нуклеиновой кислоты, представленной в изучаемом материале. Время тестирования занимает от нескольких часов до нескольких дней. В области вирусологии методики ультраглубокого секвенирования обладают преимуществами, которые позволяют решать задачи, недоступные другим способам. Среди них – одновременная идентификация всех вирусов, присутствующих в пробе от пациента. В этом случае будут также установлены вирусы, которые невозможно культивировать; уже известно, что они составляют большинство среди открытых вирусов. Кроме того, только методы УГС позволяют выявить у пациента все возможные генетические варианты и квазивиды («генетическое облако») одного вида вируса. Среди них могут оказаться генотипы, устойчивые к терапии противовирусными препаратами. Наконец, УГС позволяет установить ключевые этапы взаимодействия вируса и клетки, оценивая динамику экспрессии всех вирусных генов («вирусный транскриптом»). Тем не менее, широкое внедрение технологий секвенирования в медицинскую практику пока сдерживается их высокой стоимостью и сложностью клинической интерпретации полученных данных. В целом все молекулярно-генетические методы играют важнейшую роль в лабораторной диагностике вирусных инфекций. Однако их результаты должны рассматриваться только совместно с данными других методов исследования в вирусологии. 1.7.2. Основные методы индикации и идентификации вирусов В лабораторной диагностике вирусных инфекций используют следующие основные группы методов: 1) определение вирусов непосредственно в клиническом материале (экспресс-тесты); 2) выделение вирусной культуры с индикацией и идентификацией вируса (вирусологический метод); 3) серологическая диагностика вирусной инфекции (определение специфических антител к вирусу в сыворотке пациента для подтверждения диагноза вирусной инфекции; при некоторых заболеваниях помимо антител в сыворотках проводят определение антигенов). Происхождение материала для исследования зависит от локализации и формы вирусной инфекции. Исследуют 39 носоглоточный смыв, мокроту, кровь, ликвор, фекалии, мочу, соскобы из высыпных элементов, биоптаты органов и тканей, включая аутопсийный материал. Определение вирусов непосредственно в клиническом материале основано на прямом выявлении специфических вирусных нуклеиновых кислот или вирусных антигенов в образцах, полученных от пациента. Иногда для выявления вируса в материале могут применяться прямые вирусоскопические методы обнаружения вирусных частиц (электронная микроскопия, микроскопия внутриклеточных вирусных включений). Вирусные ДНК или РНК в материалах определяют при помощи ПЦР, реже – методом молекулярной гибридизации. С их помощью проводят как индикацию, так и генетическую идентификацию вирусов (вид, вариант и т.д.) Вирусные АГ выявляют методом иммуноферментного анализа (ИФА) и в реакции иммунной флюоресценции (РИФ). ИФА позволяет быстро и высокочувствительно проводить индикацию вирусов в материале по наличию вирусных АГ. При использовании типоспецифических АТ методом ИФА можно идентифицировать серотип вируса. Вирус-инфицированные клетки в материале обнаруживают по экспрессии вирусных АГ методом иммунной флюоресценции. Электронная микроскопия (просвечивающая или сканирующая) позволяет непосредственно обнаружить вирусные частицы в материале (индикация вируса). Их характерная морфология может указывать на принадлежность вируса к конкретному семейству или роду. Данный вид микроскопии обладает наивысшей разрешающей способностью. Однако в связи со сложностью метода и высокой стоимостью оборудования электронная микроскопия обычно применяется для проведения научных исследований в области вирусологии. Вариант методики – иммуноэлектронная микроскопия – обладает более высокой чувствительностью и специфичностью. В нем обычно используются конъюгаты специфических АТ с коллоидным золотом. Методом световой микроскопии в клетках, содержащихся в материале для исследования при вирусной инфекции, можно обнаружить вирусные включения. Образование внутриклеточных включений – это скопление вирусных частиц (вирусных белков и нуклеиновых кислот), наблюдаемых при микроскопии зараженных 40 клеток. У ДНК-содержащих вирусов они обычно локализованы в ядре (исключение – тельца Гварниери при оспе в цитоплазме). У РНКсодержащих вирусов включения обнаруживаются в цитоплазме (тельца Бабеша-Негри при бешенстве). Для выделения вируса из исследуемого материала (вирусологический метод исследования) применяют различные способы культивирования, индикации и идентификации вирусов. Культивирование проводят в культуре клеток, курином эмбрионе, организме чувствительного лабораторного животного. Индикацию вирусов выполняют по их цитопатическому действию (ЦПД) на клетки. К нему относится дегенерация клеток – мелкозернистая деструкция (энтеровирусы), фрагментация, округление; образование симпластов (вирус кори), синцития, внутриклеточных включений. В клеточном монослое могут образоваться бляшки – зоны разрушения клеток под действием вируса (негативные вирусные колонии). Вариантом оценки цитопатического действия является цветная проба Солка. При ее проведении вирус вносят в культуру клеток, содержащую индикатор; при культивировании вирус разрушает клетки, и изменения цвета индикатора не наблюдается. В контроле без вируса пролиферация клеток ведет к накоплению продуктов их метаболизма с изменением рН среды и цвета индикатора. Если вирус содержит гемагглютинин, то его индикация проводится в реакции гемагглютинации вируса с чувствительными к нему эритроцитами. Для этого к двукратным разведениям культуральной жидкости, содержащей вирус, добавляют эритроциты, и после инкубации определяют гемагглютинирующий титр вируса (соответствует его 1-й гемагглютинирующей единице – ГАЕ). Клетки, инфицированные гемагглютинирующим вирусом, могут также быть обнаружены с помощью микроскопии по феномену гемадсорбции – прикреплению эритроцитов к мембранам инфицированных клеток, экспрессирующих на своей поверхности гемагглютинины вируса. Серологическую идентификацию вируса (определение его серотипа или антигенной группы) проводят в реакции нейтрализации ЦПД (РН ЦПД) с типоспецифическими противовирусными антителами (сыворотками). Вариантами РН являются реакция нейтрализации бляшкообразования; предупреждения образования включений; нейтрализации по цветной пробе. В последнем случае специфические АТ связывают вирус, он не 41 блокирует клеточный метаболизм; клетки размножаются, и с накоплением продуктов метаболизма происходит изменение цвета индикатора в среде. Идентификация гемагглютинирующих вирусов осуществляется в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с типоспецифическими сыворотками и в реакции торможения гемадсорбции. При культивировании в курином эмбрионе индикацию вируса выполняют по гибели эмбриона, помутнению хорион-аллантоисной мембраны с кровоизлияниями, образованию бляшек на мембране, в реакции гемадсорбции и реакции гемагглютинации с аллантоисной жидкостью. Идентификацию проводят в реакции нейтрализации гибели куриного эмбриона и в РТГА. Соответственно, при заражении лабораторных животных индикацию вирусов проводят по их гибели животных, идентификацию – в реакции нейтрализации со специфическими сыворотками. Дополнительно при любом варианте культивирования вируса может производиться его генетическая индикация и идентификация (определение вида и генетического типа или варианта) методом ПЦР. Серологическая диагностика относится к непрямым методам лабораторной диагностики вирусных инфекций. Она основана на определении специфических антител к вирусу в сыворотке пациента при помощи серологических реакций. Иногда с этой целью в сыворотке также определяют специфические вирусные АГ (например, Hbs АГ при вирусном гепатите В). Накопление и последующее выявление АТ к вирусу происходит не сразу, а в течение некоторого времени после заражения («серонегативное окно»). Обнаружение в сыворотке специфических противовирусных АТ после серонегативного периода различной степени длительности называется сероконверсией. Сероконверсией также является переключение синтеза противовирусных АТ с класса IgM на IgG с последующим выявлением АТ класса IgG в сыворотке. Наибольшее распространение для серологической диагностики вирусных заболеваний получил иммуноферментный анализ (ИФА). Метод высокочувствителен и специфичен, может выполняться в автоматическом режиме, применяется для массового скрининга вирусных инфекций. 42 Обычно в ИФА определяют уровень (количество) специфических АТ к вирусу; в случае превышения порогового значения («точка отсечения») устанавливают диагноз вирусной инфекции. Уровень АТ необходимо исследовать в динамике. Повышенную диагностическую значимость имеет определение АТ в реакции с парными сыворотками. В этих случаях АТ в сыворотке крови пациента определяют в начале и конце заболевания (обычно с интервалом в 2-3 недели). При увеличении уровня (нарастании титра) АТ в 4 раза и более диагноз вирусной инфекции подтверждается. Нахождение АТ класса IgM к вирусу, как правило, свидетельствует об острой первичной вирусной инфекции. Выявление АТ класса IgG свидетельствует о вторичном иммунном ответе (продолжающаяся или перенесенная вирусная инфекция, обострение хронической инфекции, предыдущая вакцинация и т.д.). В этих случаях также целесообразно исследовать уровень АТ в динамике. Если вирус имеет в своем составе гемагглютинин, то наличие противовирусных АТ устанавливают в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). При постановке реакции предварительно готовят ряд последовательных двукратных разведений сыворотки пациента (титрование сыворотки). В РТГА определяют титр АТ сыворотки – максимальное разведение сыворотки, при котором еще наблюдается положительная реакция. Полученные значения титра сравнивают с диагностическим титром АТ, который заранее устанавливается для конкретной вирусной инфекции. В случае равенства или превышения данного показателя диагноз инфекции считается подтвержденным. Весьма часто РТГА проводят с парными сыворотками, полученными от пациента в начале и конце заболевания. Для выявления противовирусных АТ также используют латексагглютинацию, метод иммунохроматографии, вестерн-блотинг. РСК для серодиагностики вирусных инфекций сейчас применяется редко из-за трудоемкости методики и недостаточной стандартизации реагентов. |