Пособие_по_выживанию_на_вирусологии. Вирусология и этапы ее развития 1 Отличия вирусов от прокариотов и эукариотов 6
 Скачать 102.99 Kb.
|
Получение вируссодержащего материала от больных животных и трупов: консервация, транспортировка и подготовка к исследованиюПодготовка вируссодержащего материала. В лаборатории полученный патматериал освобождают от консерванта, оттаивают, отмывают от глицерина, взвешивают или измеряют. Часть берут для вирусологического анализа, оставшуюся — хранят в холодильнике на случай необходимости дополнительных исследований. Затем составляют план исследований присланного материала. Подготовку вируссодержещего материала для заражения чувствительных объектов осуществляют двумя методами: с помощью обработки антибиотиками или путем стерилизующего фильтрования. Подготовка органов и тканей. Вирус необходимо высвободить из клеток органов и тканей и перевести в раствор Хенкса. Для этого материал тщательно измельчают ножницами и растирают в ступке со стерильным кварцевым песком. Добавлять толченое стекло менее желательно, так как оно обладает щелочными свойствами и может инактивировать часть вирусных частиц. Но и на тонко растертых песчинках или частицах стекла, обладающих большой поверхностью, часть вируса может адсорбироваться и уйти затем в удаляемый осадок. Из растертого материала обычно готовят 10%-ную суспензию на растворе Хенкса. Полученную суспензию на растворе Хенкса центрифугируют при 1500...3000 об/мин в течение 15...30 мин, надосадочную жидкость отсасывают в стерильные флаконы и освобождают от микрофлоры, либо пропуская через бактериальные фильтры (это делают редко, так как теряется много вируса за счет адсорбции на фильтре), либо обрабатывают антибиотиками широкого спектра действия (пенициллин, стрептомицин, нистатин, тетрациклин, кристалломицин и т.д.). Дозы антибиотиков, применяемых для этой цели, могут колебаться в довольно широких пределах (от 100 до 1...2 тыс. ЕД и более на 1 мл) в зависимости от характера исследуемого материала. Рекомендуют следующие дозы антибиотиков- пенициллина 1000 ЕД, тетрациклина 100 мкг, стрептомицина 500 ЕД, нистатина 30 ЕД на 1 мл. Следует избегать излишне больших доз, так как их избыток при дальнейшем внесении в культуру клеток может вызвать неспецифическую дегенерацию последних. Предпочтительность тех или иных доз антибиотиков и оптимальный режим центрифугирования в каждом конкретном случае указан в инструкции по диагностике соответствующих вирусных болезней. Экспозиция суспензии с антибиотиками должна быть не менее 30...60 мин при комнатной температуре, затем материал подвергают бактериологическому контролю на наличие бактерий, грибов путем посева на МПА, МПБ, МППБ и среду Сабуро. После получения отрицательного результата бактериологического контроля вируссодержащий материал используют для заражения лабораторных животных, куриных эмбрионов и культур клеток. В случае положительного бактериологического контроля суспензию вируса подвергают дополнительной обработке антибиотиками и повторно ставят контроль. Суспензию хранят при минус (20... 70) °С. Подготовка выделении из носа и глаз. Тампоны погруженные в соответствующий раствор, встряхивают 10...15 мин, тщательно отжимают, полученную жидкость центрифугируют 20 мин при 2000...3000 об/мин. Надосадочную жидкость отсасывают в стерильную пробирку и в нее добавляют пенициллин и стрептомицин по 500...1000 ЕД на 1 мл, выдерживают и после бактериологического контроля используют для заражения. Из осадка клеток готовят мазки для РИФ. Подготовка фекалий. Пробу кала (приблизительно около 1 г) помещают в баночку с бусами, содержащую 10 мл раствора Хенкса. После гомогенизации материала встряхиванием и последующего центрифугирования при 2000...3000 об/мин в течение 30 мин надосадочную жидкость отсасывают, добавляют пенициллин, стрептомицин по 500... 1000 ЕД/мл, нистатин 30 ЕД/мл и тетрациклина 200 мкг/мл. После 30...60 мин контакта производят посев на стерильность, замораживают и хранят при минус (10... 20) °С. В день заражения животных или культуры клеток исследуемый материал оттаивают и повторно центрифугируют для удаления вновь образующегося поле замораживания осадка. Неиспользованный материал хранят в замороженном состоянии до конца исследований. Исследование кала может быть заменено ректальными мазками, обработка которых требует меньше времени, а частота выделения вируса при этом не только не меньше, но иногда выше. Мочу обрабатывают антибиотиками 500...1000 ЕД/мл и используют для заражения. При кожных высыпаниях исследуют содержимое папул, пузырьков и пустул, чешуйки и корки. Содержимое папул и пузырьков разводят раствором Хенкса в соотношении 1:5, а корки, чешуйки после растирания суспендируют в солевом растворе 1:5-1:10 и подвергают центрифугированию при 2000...3000 об/мин в течение 10... 15 мин. После обработки пенициллином и стрептомицином (по 200...500 ЕД/мл) материал используют для заражения. Подготовка крови. Для выделения вируса может быть использована цельная дефибринированная, "лаковая" кровь или кровь с антиксагулянтом. В последнем случае берут 5 мл крови в пробирку с 5-6 каплями гепарина и замораживают. После оттаивания гемолизированную кровь центрифугируют при 2000...3000 об/мин в течение 15 мин, добавляют пенициллин и стрептомицин из расчета 100... 200 ЕД/мл и после проверки на стерильность используют для заражения. Для этих целей пригодна и свернувшаяся кровь. Ее растирают в ступке и добавляют небольшое количество раствора Хенкса (1:1 или 1:2), а далее поступают аналогично. Для освобождения вируссодержащего материала от микроорганизмов применяют стерилизующее фильтрование. Чаще всего используют асбестовые пластинки, керамические свечи, коллодийные мембраны и стеклянные фильтры. Асбестовые фильтры готовят из прессованного асбеста в виде кружков диаметром35,140 и 350 мм. Выпускают фильтры марки "Ф" (фильтрующие), задерживающие взвешенные частицы, но пропускающие частично бактерии, и "СФ" (стерилизующие), задерживающие все виды бактерий, не пропускающие вирусы. Коллодийные мембраны (ультрафильтры) готовят из нитроклетчатки (коллодия) с точно калиброванными порами. Иногда их называют градоколовыми фильтрами (англ. graduate — калибровать; кол — от слова коллодий). Широкое распространение получили мембранные фильтры. Для фильтрования вирусов используют фильтры с диаметром пор 100-400 нм. В настоящее время мембранные фильтры являются наиболее совершенными. Керамические свечи представляют собой удлиненной формы полые цилиндры, закрытые в нижней части (свечи Шамберлена, Беркефельда, каолиновые фильтры Санкт-Петербургского керамического НИИ). Их изготовляют из каолина с различной степенью порозности. Стеклянные фильтры готовят из пористого стекла. В последние годы довольно широкое распространение получили фильтры Шота с пластинкой №5 из сплавленных мельчайших гранул отекла. Суспензии, содержащие вирус, перед фильтрованием необходимо освободить от грубой взвеси. Для этого их вначале центрифугируют в течение 10...15 мин при 1500...2000 об/мин и фильтруют через бумажный фильтр большой порозности (800 нм). Суспензия, подлежащая стерилизующему (заключительному) фильтрованию, должна быть прозрачной и лишь слегка опалесцирующей. Жидкость, хранившуюся на холоде, перед фильтрованием рекомендуется в течение часа выдержать при комнатной температуре, а затем нужный ее объем вылить в стакан фильтровального прибора. В приемном сосуде (колбе) создают разрежение при помощи водоструйного или масляного насоса. Фильтрат проверяют на стерильность (наличие бактерий, грибов) путем посева на МПА, МПБ, среду Сабуро. Следует отметить, что фильтрование сопровождается адсорбцией вируса на фильтре и приводит к его значительным потерям. Отбор крови для серологических исследований. Для серологической диагностики необходимо иметь две пробы сыворотки крови (парные сыворотки), взятые в начале и в конце болезни. Первую пробу берут как можно раньше — в инкубационный период или в начале проявления клинических симптомов болезни, вторую — во время выздоровления или через 2...3 недели после заболевания. Брать кровь и готовить сыворотку необходимо стерильно, нельзя применять энтикоагулянты или консерванты, которые могут придать сыворотке антикомплементарность, а в реакции нейтрализации оказать инактивирующее действие на вирус, оказаться токсичными для культур клеток или просто нестерильными. Кровь в объеме 10... 15 мл берут в стерильные пробирки с резиновыми пробками, выдерживают при комнатной температуре до образования сгустка, обводят стеклянной палочкой или другим инструментом и переносят в холодильник при 4 °С на 18... 20 ч. После максимальной ретракции сгустка сыворотку отсасывают, добавляют пенициллин и стрептомицин по 100 ЕД/мл, проводят высевы на бактериологические среды. Вместо отстаивания в холодильнике можно после обведения кровь центрифугировать. Серологические методы вирусологической диагностики требуют исследования парных проб сывороток, поэтому необходимо правильно сохранять первые пробы, пока не будут получены вторые. Хранить сыворотки необходимо в холодильнике при 4 °С или в замороженном виде, строго соблюдая порядок нумерации проб и соответствия записей в журнале и на пробах |