ВЭЖХ. Высокоэффективная жидкостная хроматография

Название	Высокоэффективная жидкостная хроматография
Дата	14.04.2021
Размер	1.09 Mb.
Формат файла
Имя файла	ВЭЖХ.docx
Тип	Документы #194791

ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Введение 3

Глава 1. Классификация методов ВЭЖХ по механизму разделения 4

1.1.Адсорбционная хроматография 4

1.2.Распределительная хроматография 4

1.3.Ионообменная хроматография 5

1.4.Эксклюзионная хроматография 5

Глава 2. Области применения ВЭЖХ 7

2.1. Анализ пищевых продуктов 7

2.2. Ранняя диагностика заболеваний по анализам биохимических маркеров 9

2.3. ВЭЖХ для анализа биологических жидкостей 13

2.4. Применение хроматографии в судебных и судебно-медицинских экспертизах 14

Заключение 16

Список литературы 17

Введение

Метод ВЭЖХ имеет более чем 30-летнюю историю интенсивного развития, и на сегодняшний день условно характеризуется скоростью анализа "1 вещество в минуту" и типичной производительностью порядка 20 веществ за хроматографическую процедуру. В распоряжении аналитиков появилось надежное автоматическое оборудование и мощные компьютерные программы обработки данных. В настоящее время ВЭЖХ занимает ведущие позиции среди других методов хроматографии как по объему выпускаемой аппаратуры, так и по числу публикаций. Современная ВЭЖХ реализована в различных вариантах. Эти варианты позволяют разделять различные смеси молекул (включая смеси всех типов изомеров); макромолекулы синтетических и биополимеров (включая вирусы и молекулы с массами до нескольких миллионов); ионы и устойчивые радикалы.

При этом теория размывания хроматографических зон в ВЭЖХ к настоящему времени практически завершена. Разработка этой теории позволила на практике реализовать эффективность колонок, близкую к теоретической. Так, при использовании сорбентов с диаметром зерен менее 3 мкм была получена эффективность до 300000 теоретических тарелок на метр длины колонки.

Казалось бы, созданы все предпосылки для внедрения метода в практику большого круга лабораторий, однако до сих пор ВЭЖХ считается одним из самых трудоемких, продолжительных и дорогостоящих аналитических методов. Главным фактором, сдерживающим широкое внедрение ВЭЖХ, является сложившийся подход к разработке методического обеспечения. [1]

Глава 1. Классификация методов ВЭЖХ по механизму разделения

Большинство проводимых методом ВЭЖХ разделений основано на смешанном механизме взаимодействия веществ с сорбентом, обеспечивающим большее или меньшее удерживание компонентов в колонке. При смешанном механизме удерживания для веществ разного строения и молекулярной массы можно оценить вклад в удерживание адсорбционного, распределительного, эксклюзионного и других механизмов. В ВЭЖХ рассматривается разделение с преобладанием того или иного механизма.

Адсорбционная хроматография

Разделение методом адсорбционной хроматографии осуществляется в результате взаимодействия вещества с адсорбентами, такими, как силикагель или оксид алюминия, имеющими на поверхности активные центры. Различие в способности к взаимодействию с адсорбционными центрами разных молекул пробы приводит к их разделению на зоны в процессе движения с подвижной фазой по колонке. Достигаемое при этом разделение зон компонентов зависит от взаимодействия как с растворителем, так и с адсорбентом. В основе сорбции на поверхности адсорбента, имеющего гидроксильные группы, лежит специфическое взаимодействие между полярной поверхностью адсорбента и полярными (или способным поляризоваться) группами или участками молекул. К таким взаимодействиям относят диполь-дипольное взаимодействие между постоянными или индуцированными диполями, образование водородной связи вплоть до образования π-комплексов или комплексов с переносом заряда. Возможным и достаточно частым в практической работе является проявление хемосорбции, которая может привести к значительному повышению времени удерживания, резкому снижению эффективности, появлению продуктов разложения или необратимой сорбции вещества.

Распределительная хроматография

Распределительная хроматография — это вариант ВЭЖХ, в котором разделение смеси на компоненты осуществляется за счет различия их коэффициентов распределения между двумя несмешивающимися фазами: растворителем (подвижная фаза) и фазой на сорбенте (неподвижная фаза). Исторически первыми были сорбенты такого типа, которые получали нанесением жидких фаз (оксидипропионитрила, парафинового масла и др.) на пористые носители, аналогично тому, как готовили и готовят сорбенты для газожидкостной хроматографии (ГЖХ). Однако сразу же обнаружились и недостатки таких сорбентов, основным из которых было относительно быстрое смывание фазы с носителя. За счет этого количество фазы в колонке постепенно уменьшалось, времена удерживания также уменьшались, на начальном участке колонки появлялись не покрытые фазой центры адсорбции, вызывавшие образование хвостов пиков. Из этого следовала необходимость привить химическими связями жидкую фазу к носителю таким образом, чтобы унос ее стал физически невозможен, то есть получить так называемый привито-фазный сорбент. В дальнейшем усилия исследователей были направлены на поиск реагентов, прививка которых протекала бы достаточно быстро и полно, а образовавшиеся связи были максимально устойчивыми. Такими реагентами стали алкилхлорсиланы и их производные, позволившие по сходной технологии получать привито-фазные сорбенты разного типа и с разными как полярными, так и неполярными группами на поверхности.

Различают нормально-фазную (НФХ) и обращенно-фазную (ОФХ) распределительную хроматографию. В НФХ используют полярный адсорбент (например, силикагель), элюент – неполярный (гексан), разделяемые вещества – полярные. В ОФХ применяют неполярный адсорбент (силикагель с привитыми на него алкильными цепями (С₆ – С₁₈), элюент полярный (спирты. вода), разделяемые вещества – любые.

Ионообменная хроматография

В ионообменной хроматографии разделение компонентов смеси достигается за счет обратимого взаимодействия ионизирующихся веществ с ионными группами сорбента. Сохранение электронейтральности сорбента обеспечивается наличием способных к ионному обмену противоионов, расположенных в непосредственной близости к поверхности. Ион введенного образца, взаимодействуя с фиксированным зарядом сорбента, обменивается с противоионом. Вещества, имеющие разное сродство к фиксированным зарядом, разделяются на анионитах или на катионитах. Аниониты имеют на поверхности положительно заряженные группы и сорбируют из подвижной фазы анионы. Катиониты соответственно содержат группы с отрицательным зарядом, взаимодействующие с катионами. Ионообменная хроматография незаменима при разделении высокополярных веществ, которые без перевода в производные не могут быть проанализированы методом ГЖХ. К таким соединениям относятся аминокислоты, пептиды, сахара.

Эксклюзионная хроматография

Эксклюзионная хроматография представляет собой вариант жидкостной хроматографии, в котором разделение происходит за счет распределения молекул между растворителем, находящимся внутри пор сорбента, и растворителем, протекающим между его частицами. В отличие от остальных вариантов ВЭЖХ, где разделение идет за счет различного взаимодействия компонентов с поверхностью сорбента, роль твердого наполнителя в эксклюзионной хроматографии заключается только в формировании пор определенного размера, а неподвижной фазой является растворитель, заполняющий эти поры. Поэтому применение термина «сорбент» к данным наполнителям в определенной степени условно. Принципиальной особенностью метода является возможность разделения молекул по их размеру в растворе в диапазоне практически любых молекулярных масс, что делает его незаменимым для исследования синтетических и биополимеров. [2]

Глава 2. Области применения ВЭЖХ

Метод ВЭЖХ находит широкое применение в таких областях, как химия, нефтехимия, биология, биотехнология, медицина, пищевая промышленность, охрана окружающей среды, производство лекарственных препаратов и во многих других.

При контроле загрязнений окружающей среды методами ВЭЖХ определяют нефтепродукты в поверхностных и питьевых водах; пестициды (особенно нелетучие гербициды на основе фенилмочевины, феноксиуксусных кислот, карбаматы, триазины и др.) в воде, почве, пище; фталаты в воде; ароматические амины и полиядерные ароматические соединения в пище и воде; фенол, хлорфенол и нитрофенолы в питьевой воде; нитрозамины в пище; тяжелые металлы (в виде комплексов) в воде, почве и пище; микотоксины (афлатоксины, зеараленон и др.) в пище и кормах и многие другие загрязнители.

2.1. Анализ пищевых продуктов

Можно выделить следующие основные цели хроматографического анализа пищевых продуктов: установление пищевой ценности продуктов; определение подлинности, доброкачественности, свежести пищевых продуктов; определение стадии порчи продуктов; обнаружение фальсификации пищевых продуктов; обнаружение трансгенных продуктов; контроль техногенных загрязнителей; контроль природных загрязнителей; определение пищевых искусственных добавок; контроль ароматов пищевых продуктов; анализ ветеринарных лекарств; контроль загрязнений от упаковок пищевых продуктов; контроль при специальных обработках пищевых продуктов, в частности, радиацией или термообработкой. Пищевую ценность продуктов устанавливают путем определения в них аминокислотного состава белков, жирных кислот и глицеридов, углеводов, органических кислот и витаминов. В последние годы большинство из этих анализов выполняются только с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Для оценки безопасности пищевых продуктов в них определяют различные загрязняющие компоненты, пищевые добавки (консерванты, антиоксиданты, подслащивающие вещества, красители и др.), выявляют их фальсификацию. Чтобы установить доброкачественность и свежесть пищевых продуктов, выявляют ранние стадии порчи и оценивают допустимые сроки их хранения. Основные загрязняющие вещества в пищевых продуктах, определяемые с помощью хроматографии, включают пестициды, нитрозамины, микотоксины (афлатоксины, охратоксин А, зеараленон и другие), полиядерные ароматические соединения, биогенные амины и другие. [1]

Так, например, в Московском Институте физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина с помощью ВЭЖХ было проведено исследование антиоксидантных свойств вин. Вино является богатейшим источником природных биологически активных веществ – фенольных соединений, обладающих антиоксидантным действием и по своей активности превосходящих витамины С, Е и β-каротин. Установлено, что биологическая активность вин обусловлена сложным составом фенольных соединений, их структурой и влиянием различных факторов. Особый интерес представляет сравнение биологической активности вин, связанной с их потенциальной способностью регулировать окислительно-восстановительные процессы и противостоять окислительному стрессу в живых системах, вызванному воздействием ионизирующего излучения, УФ-, СВЧоблучения, присутствием тяжелых и радиоактивных элементов и других факторов. С этой целью было проведено сравнение антиоксидантных активностей (АОА) и радиопротекторных свойств вин различной сортовой и региональной принадлежности и разных сроков хранения.

Количественное определение индивидуальных фенольных соединений проводили методом ОФ-ВЭЖХ на жидкостном хроматографе «Agilent 1100 Series» с диодно-матричным детектором. Элюенты: А – вода (pH=3, H₃PO₄), B – ацетонитрил (pH=3, H₃PO₄). Детектирование фенольных соединений проводили при 230, 254, 280, 330 и 500 нм, спектр сканировали в диапазоне 200 – 700 нм. Идентификацию фенольных соединений в образцах вин проводили сравнением времён удерживания и спектров оптического поглощения соответствующих стандартов с аналогичными данными для соединений, входящих в состав вин. Для расчета их содержаний использовали метод внешнего стандарта. Антиоксидантную активность образцов вин определяли электрохимическим методом, используя анализатор «ЦветЯуза-01-АА» с амперометрическим детектором. За единицу антиоксидантной активности принималась окислительная активность, проявляемая раствором кверцетина с концентрацией 1мг/дм³. Для определения способности вин противостоять окислительному стрессу использовали метод радиационно-химического моделирования окислительно-восстановительных реакций с участием свободных радикалов и активных форм кислорода, генерированных при воздействии ионизирующего излучения со средой и взаимодействующих с молекулами фенольных соединений. Для этого образцы вина в количестве 3 см³ подвергали γ-облучению на установке «60Со РХМ- γ-20» в присутствии кислорода воздуха при комнатной температуре в течение 3 ч., доза облучения, в соответствии с ферросульфатной дозиметрией, составляла 2,5 кГр. Продукты радиолиза, образующиеся при взаимодействии ионизирующего излучения с фенольными соединениями вина, регистрировали в пострадиационный период спектрофотометрическим и хроматографическим методами.

В ходе эксперимента было определено, что по содержанию фенольных соединений, как красные, так и белые вина одного наименования, но произведенные в разных регионах, незначительно отличаются между собой. Однако содержание фенольных соединенийй в красных винах в среднем в 8 раз больше, чем в белых. Следует обратить внимание, что при практически близком содержании фенольных соединений в образцах вин одного наименования антиоксидантная активность различна. Так, в красных винах Чили антиоксидантная активность в 5 раз, а в белых - в 2 раза выше, чем в исследованных образцах аналогичных марок Французских вин.

Таким образом, было установлено, что при практически близком содержании фенольных соединений в образцах вин одного наименования антиоксидантная активность их различна. Вина с высоким значением антиоксидантной активности отличались большим содержанием кверцетина, катехина и кофейной кислоты – соединений, которые относятся к группе сильных антиоксидантов. В молодых винах, независимо от показателей антиоксидантной активности, при радиолизе происходят интенсивные процессы, сопровождающиеся значительным увеличением фенольных соединений. За время хранения содержание танинов в красных винах снизилось на 10-20 %, а содержание оксикоричных и оксибензойных кислот на 30-70 %. [3]

2.2. Ранняя диагностика заболеваний по анализам биохимических маркеров

Окислительный стресс – предшественник многих опасных заболеваний. В биологических жидкостях человека действие неблагоприятных факторов – облучение, плохая экологическая обстановка, стрессы – вызывает рост концентрации высокореакционных кислородных и азотных соединений, в том числе свободных радикалов (супероксидный радикал кислорода, гидроксид-радикал, пероксинитрит и прочие). В определенных количествах свободные радикалы необходимы организму: для участия в различных биохимических процессах, поддержания иммунного статуса человека. Однако избыточное содержание свободных радикалов неизбежно приводит к патологическим изменениям в человеческом организме. Такое состояние называется окислительным стрессом. Подавляющее большинство известных теорий старения основано на теории развития окислительного стресса. Многочисленные научные публикации подтверждают, что окислительный стресс ведет к развитию таких самых опасных и социально значимых заболеваний, как сердечно-сосудистые, онкологические, сахарный диабет, нарушения мозгового кровообращения, воспалительные, ревматоидные, нейродегенеративные (болезни Паркинсона, Альцгеймера) и некоторых других. Существуют экспресс-методы, в частности, амперометрический метод, которые диагностируют присутствие окислительного стресса. В их основе лежит определение антиоксидантного статуса, то есть измерение суммарного содержания антиоксидантов в организме человека. Существуют более достоверные методы диагностирования окислительного стресса. Некоторые из них основаны на обнаружении на уровне 10^-12–10^-9 г/см³ специальных маркеров, появление которых в биологических жидкостях свидетельствует об идущем в организме окислительном процессе. Другие – на поиске эндогенных антиоксидантов. К их числу относятся глутатион (GSH), цистеин, мочевая кислота и убихинол – молекулы, соединения которых могут существовать в восстановленной форме (в этом случае они являются антиоксидантами) или в окисленной форме.

В настоящее время для определения маркеров окислительного стресса используют преимущественно хроматографические методы. На хроматографических приборах при одном взятии тестируемого образца можно определить несколько маркеров, в частности, все маркеры производных тирозинов, весь профиль измененных нуклеозидов. Одновременно с ними можно определять все эндогенные антиоксиданты: цистеин, глутатион (GSH), убихинол, мочевую кислоту и другие.

В большей степени воздействию свободных радикалов подвержены ненасыщенные связи жирных кислот в мембранах. Маркеры окисления липидов – альдегиды, диальдегиды, метилглиоксаль, производные гексеналя, ноненаля и изопростана. Наиболее часто используют маркер малоновый диальдегид (МДА), который наиболее информативный. МДА образуется при перекисном окислении липидов свободными радикалами при разрыве молекул полинасыщенных жирных кислот. Повышенная концентрация МДА в сыворотке крови служит маркером степени эндогенной интоксикации и окислительного стресса. МДА образует шиффовы основания с аминогруппами белка, в результате чего возникают нерастворимые липид-белковые комплексы (пигменты изнашивания). МДА определяют в образцах многих биологических жидкостей: сыворотке, плазме, моче, конденсате выдыхаемого воздуха. Чаще всего для обнаружения МДА используют образцы сыворотки, такое определение самое надежное, а пробоподготовка проще и дешевле. Концентрация МДА в сыворотке крови у здоровых людей (в норме) меньше 1 мкмоль/л. Метод ВЭЖХ с фотометрическим детектором в видимой области (длина волны λ=532 нм) дает наиболее достоверные результаты. Для определения МДА используют реакцию с тиобарбитуровой кислотой. При реакции МДА с тиобарбитуровой кислотой образуется окрашенное соединение – триметиновый комплекс (поглощение при 532–535 нм) (Рисунок 1). Производные после этой реакции можно обнаружить и флуориметрическим детектором.

Рисунок 1. Реакция взаимодействия МДА с тиобарбитуровой кислотой

Тирозин – α-амино-β-(n-оксифенил)-пропиловая кислота – заменимая аминокислота с ароматическим кольцом и гидроксильной группой в ней в пара-положении, поэтому тирозин является антиоксидантом. В организме человека присутствует только L-тирозин, который входит в состав белков и ферментов. Тирозин – важная аминокислота, являющаяся предшественником биологически активных соединений: адреналина, норадреналина, дофамина и др. При воздействии свободных радикалов на свободный тирозин или тирозин, содержащийся в составе белков, происходит его окисление. В результате появляются производные – маркеры процесса окисления белков (3-хлортирозин, 3-нитротирозин, 3,5-дихлортирозин, дитирозин и некоторые другие). Появление этих маркеров в биологических жидкостях возникает при атеросклерозе, болезнях Паркинсона и Альцгеймера и других заболеваниях. Дитирозин является специфическим маркером окислительного стресса головного мозга. Окисленные формы тирозина легко определить с помощью амперометрического детектора. Для разделения смеси исследователями был выбран обращенно-фазовый режим высокоэффективной жидкостной хроматографии. В качестве разделительной колонки использовали колонку Zorbax SB-C18 4,6×250 мм. Эта колонка заполнена зернами сорбента – силикагеля с привитыми к его поверхности цепями С₁₈, размер зерен – 5 мкм. Далее, после выбора оптимальных рабочих условий разделения, в качестве элюента (подвижной фазы) в изократическом режиме использовали ацетонитрил (4%), подкисленный ортофосфорной кислотой. Скорость подачи (прокачки) элюента 1 мл/мин обеспечила за 15 мин полное разделение смеси: 3,4-DOPA, тирозина, м-тирозина, o-тирозина, 3-хлортирозина и 3-нитротирозина. Конечно, если увеличить скорость элюента или поднять температуру колонки, можно значительно сократить время разделения смеси.

Рисунок 2. Хроматограмма разделения стандартной смеси производных тирозина (3,4-DOPA 10 мг/дм³, тирозин 4,64 мг/дм³, мета-тирозин 5 мг/дм³, орто-тирозин 10 мг/дм³, хлортирозин 10 мг/дм³, 3-нитротирозин 10 мг/дм³) в изократическом режиме (колонка Zorbax SB-C18 4,6×250 мм

Рисунок 3. Хроматограмма определения производных тирозина в слюне больной, обнаружены: мочевая кислота, тирозин, хлортирозин, 3-нитротирозин (колонка Zorbax SB-C18 4,6×250 мм, градиентный режим элюирования)

На рисунке 2 приведена хроматограмма разделения стандартных соединений в изократическом режиме, а на рисунке 3 – хроматограмма определения производных тирозина в слюне, в ней заметны пики, соответствующие мочевой кислоте, тирозину, хлортирозину и 3-нитротирозину. В тех случаях, когда в биологических жидкостях присутствуют более высокомолекулярные соединения, желательно использовать режим градиентного элюирования. При работе в таком режиме элюирующая способность подвижной фазы (элюента) возрастает за счет роста концентрации ацетонитрила в общей смеси элюента

Так, внедрение метода ВЭЖХ для определения маркеров окислительного стресса в стандартные биохимические лаборатории больниц и диагностических центров может позволить диагностировать окислительный стресс в самом начале его наступления. [4]

2.3. ВЭЖХ для анализа биологических жидкостей

Высокоэффективная жидкостная хроматография является одним из самых мощных методов аналитической химии, применяемых во всем мире для проведения фармакокинетических исследований с целью определения индивидуальной схемы дозировки лекарственных препаратов, а также для определения эндогенных метаболитов в биологических жидкостях с целью диагностики ряда заболеваний. Однако активное применение ВЭЖХ в повседневной клинической практике ограничено необходимостью использования дорогостоящей аппаратуры и расходных материалов (колонки, элюенты) и отсутствием унифицированных методик анализа и квалифицированных специалистов. ВЭЖХ является одним из самых мощных методов аналитической химии, применяемых во всем мире для проведения фармакокинетических исследований с целью определения индивидуальной схемы дозировки лекарственных препаратов, а также для определения эндогенных метаболитов в биологических жидкостях с целью диагностики ряда заболеваний. Однако активное применение ВЭЖХ в повседневной клинической практике ограничено необходимостью использования дорогостоящей аппаратуры и расходных материалов (колонки, элюенты) и отсутствием унифицированных методик анализа и квалифицированных специалистов. Один из возможных путей решения этой проблемы – разработка максимально унифицированных, экономичных и экспрессных методик одновременного определения больших групп лекарственных веществ. Так, например, в рамках единой унифицированной методики все вещества хроматографируются на одной и той же колонке с обращенно-фазовым (ОФ) сорбентом типа "C18", с использованием одной и той же двухкомпонентной подвижной фазы, состоящей из водного буферного раствора и ацетонитрила.

Для исследований такого рода активно используется метод микроколоночной хроматографии с применением многоволнового детектирования и градиентного элюирования для анализа различных веществ в биологических жидкостях: 1) возможность определения больших групп лекарственных веществ по унифицированной методике с использованием одного бинарного элюента и колонки с одним и тем же сорбентом; 2) высокая селективность разделения при использовании градиентного режима элюирования; 3) надежная идентификация веществ с использованием многоволнового детектирования и спектральных отношений; 4) значительная экономия дорогостоящих расходных материалов; 5) простота подготовки пробы; 6) экспрессность анализа. [5]

2.4. Применение хроматографии в судебных и судебно-медицинских экспертизах

Аналитические задачи в судебной экспертизе весьма разнообразны: от точных количественных анализов до простого сравнения или установления идентичности различных объектов. Аналитический контроль важен при расследовании преступлений, связанных с употреблением наркотиков и спиртных напитков, при неумышленных и умышленных отравлениях, при злоупотреблениях лекарствами, при убийствах, пожарах, кражах, взрывах, авариях и прочем. Объектами хроматографического анализа (по последним публикациям) чаще всего являются наркотики (морфин и его производные, кокаин, каннабиноиды, ЛСД и другие) амфетамины, барбитураты, различные лекарства, дихлорэтан и растворители. В судебных экспертизах методом хроматографии анализируют также нефтепродукты и горюче-смазочные материалы, которые могут быть использованы в качестве горючих средств при поджогах, выявляют подделки и фальсификации горюче-смазочных материалов. Анализируют также лакокрасочные материалы и покрытия, в том числе частицы окраски автомобилей, краски в чернилах для выявления материалов письма или давности документов, древесину, взрывчатые вещества, продукты выстрела и другое. Много опубликованных работ из области судебной экспертизы посвящено хроматографическим анализам биологических объектов, в частности крови, сыворотки, мочи, слюны, пота выдыхаемого воздуха, волос человека и т. д. Только за последние два года опубликованы сотни статей по применению хроматографии в судебной и судебно-медицинской экспертизе. Для быстрого скрининга разработаны систематические токсикологические методы анализы лекарств и их метаболитов. В последние годы уникальные применения находит комбинация ВЭЖХ/массспектрометрия.

К примеру, в последнее время участились случаи отравления клозапином (СZ, азалептин, (8-хлор-11-(4-метил-1-пиперазенил)-5Н-дибензо[b,e][1,4]-диазепин). Чаще всего они связаны с криминальными действиями, реже CZ употребляют в суицидальных целях или случайно. Таким образом, учитывая данные по фармакокинетике, токсикокинетике, основные пути метаболизма и распределения CZ в организме человека, современные достижения в области ВЭЖХ, была разработана методика обнаружения и определения CZ при судебно-химическом исследовании. Методика состоит из следующих этапов: 1) изолирование CZ из подщелоченного раствора крови и мочи с применением экстракции органическими растворителями с последующей реэкстракцией веществ перед вводом в хроматограф, из печени CZ изолировали подкисленным ацетонитрилом; 2) обнаружение и определение изолятов методом ВЭЖХ с диодно-матричным детектором; 3) ВЭЖХ проводили на стандартных обращенно-фазовых колонках с элюцией слабокислыми водными растворами и ацетонитрилом в градиентном режиме.

В качестве внутреннего стандарта использовали налтрексон. Диапазон измеряемых концентраций — от терапевтических до токсических. Хроматографирование проводили на жидкостном хроматографе Agilent 1200 («Agilent Technologies», США) с диодно-матричным детектором. Режим хроматографического разделения: колонка стальная размером 4,6×150 мм с обращенно-фазовым сорбентом Zorbax Eclipse XDB-C18 с размером частиц 5 мкм. Детектирование проводили при длинах волн от 210 до 600 нм. Опорная длина волны для расчета концентрации CZ — 210 нм. Подвижная фаза — раствор А (0,1% раствор трифторуксусной кислоты), раствор В — ацетонитрил. Скорость хроматографирования 0,7 мл/мин, градиентный режим изменения содержания ацетонитрила: начальную концентрацию 5% ацетонитрила выдерживали в течение 2 мин, далее концентрацию ацетонитрила увеличивали до 60% в течение 20 мин. Идентификацию CZ проводили по времени удерживания и УФ-спектру.

Рисунок 4. Фрагмент хроматограммы экстракта крови, содержащей 0,054 мг% CZ. Пик с временем удерживания 8,811 мин соответствует внутреннему стандарту. Пик с временем удерживания 11,163 мин соответствует CZ (спектрограмма с длиной волны 230 нм).

CZ в описанных выше условиях имеет время удерживания 11,1 мин, УФ-спектр имеет максимумы при 242 и 294 нм и минимумы при 226 и 290 нм). Для расчета концентрации CZ в крови, моче, печени (почке) использется калибровочный график, построенный методом внутреннего стандарта с использованием растворов налтрексона (внутренний стандарт) и CZ (модельные растворы), которые добавляются к биологическому материалу. [6]

Заключение

Таким образом, высоко эффективная жидкостная хроматография играет важную роль во многих областях науки и производства. ВЭЖХ применяется в таких жизненно важных областях науки и производства, как биология, биотехнология, пищевая промышленность, медицина, фармацевтика, судебно-медицинская экспертиза, в последние годы успешно решает задачи протеомики.

Однако, на сегодняшний день не достигнуты пределы развития ВЭЖХ. Все еще острыми темами в теории ВЭЖХ являются компьютерная оптимизация процесса разделения, в частности в обращенно-фазной хроматографии, влияние в этом варианте температуры на селективность, связь удерживания со структурой молекул. Основные усилия хроматографистов в настоящее время направлены на теоретическое исследование вопросов селективности разделения. Продолжаются исследования по изучению механизма удерживания в обращенно-фазной хроматографии на привитых фазах. Все чаще для этого привлекаются спектральные методы.

Список литературы

Яшин, Я. И. Высокоэффективная жидкостная хроматография. Состояние и перспективы / Я. И. Яшин, А. Я. Яшин // Рос. хим. ж. – 2003. – т. XLVII, № 1. – с. 64-79.
Стыскин, Е. Л. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография / Е. Л. Стыскин, Л. Б. Ициксон, Е. В. Брауде. – М: Химия, 1986. - 213 с.
Ульянова, Е. В. Высокоэффективная жидкостная хроматография в исследовании антиоксидантных свойств вин / Е. В. Ульянова, О. Г. Ларионов, А. А. Ревина, Д. В. Андриевская // Сорбционные и хроматографические процессы. – 2010. – т. 10, № 4. – с. 522-532.
Яшин, Я. И. Высокоэффективная жидкостная хроматография маркеров окислительного стресса / Я. И. Яшин, А. Я. Яшин // Аналитика. – 2011. - №1. – с. 34-43.
Федорова, Г. А. Применение микроколоночной ВЭЖХ для анализа биологической жидкости / Г. А. Федорова, Л. А. Кожанова // Хроматография на благо России: сб. науч. ст. / редкол.: Л. Н. Коломинец [и др.]. – М.: Граница, 2007. – 688 с.
Барсегян, С. С. Определение клозапина при судебно-химическом исследовании трупной крови, мочи и печени с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии / С. С. Барсегян, Н. О. Николаева, М. М. Онищенко, Е. М. Саломатин, Е. А. Сальникова // Судебно-медицинская экспертиза. – 2012. - №4. – с. 43-47.