Вирусология. Вирусология ответы. Вопросы к экзамену по дисциплине Вирусология
 Скачать 0.58 Mb.
|
|
О наличии вируса в зараженной культуре клеток можно судить по цитопатическому действию (ЦПД) – патологические изменения морфологии клеток, вплоть до их гибели, возникающие в результате репродукции вирусов, и наблюдаемые под микроскопом: дегенерация клеток (округление, изменение формы, разрушение); появление включений (Липшются – вирус герпеса; Гварниери – вирус натуральной оспы) и телец (Бабеша-Негри – вирус бешенства); разрушение пласта клеток (парамиксовирусы); образование гигантских многоядерных клеток - симпластов (вирус кори). Образование «негативных колоний», или «бляшкообразование» – ограниченные участки разрушенных вирусами клеток в сплошном монослое культуре клеток. Они видны невооруженным глазом в виде светлых пятен на фоне окрашенного монослоя живых клеток. Добавление агара в питательную среду ограничивает распространение вирусов по всему монослою после выхода их из разрушенной клетки и обеспечивает взаимодействие вирусов только с соседними клетками. Каждая «бляшка» образуется потомством одного вириона. Основные методы индикации вирусов в культуре тканей: 1. “+” гемагглютинация; 2.“+” гемадсорбция; 3.реакция нейтрализации вирусов в культуре тканей; 4.цветная реакция Солка. Реакция гемагглютинации– склеивание эритроцитов при добавлении вирусосодержащего материала (есть вирус – эритроциты оседают в виде “зонтика”; нет вируса – в виде “диска”). Реакция гемадсорбции– адсорбция эритроцитов на поверхности пораженных вирусом клеток и образуют характерные скопления (вирус гриппа– вызывает агглютинацию эритроцитов островкового типа). Цветная реакция Солка– основана на изменении цвета питательной среды. В результате жизнедеятельности клеток в питательную среду выделяются продукты клеточного метаболизма и происходит сдвиг рН в кислую сторону, о чем свидетельствует изменение цвета среды из красного в желтый. Если вирус присутствует и реплицируется в культуре, то вследствие разрушающего действия вируса клетки дегенерируются, и подавляется их метаболизм, т.е. цвет среды не изменяется. Приобретенные факторы антивирусного иммунитета. Вирусные иммуноглобулины. Клеточные факторы:лимфоцит,макрофаги. В отличие от антигенов бактерий, все вирусные антигены имеют белковую природу (гликопротеины, фосфопротеины, нуклео- протеины). Протективными свойствами обладают поверхностные белки, обеспечивающие слияние вируса с клеткой, и некоторые белки, расположенные в более глубоких слоях вируса. Процесс развития вируса в организме хозяина проходит две фазы: внеклеточную и внутриклеточную. В развитии антивирусного иммунитета участвуют гуморальные и клеточные факторы. Особенности противовирусного иммунитета обусловлены своеобразием строения и биологии вирусов. Иммунитет направлен на нейтрализацию и удаление из организма вируса, его антигенов и зараженных вирусом клеток. К основным клеточным факторам антивирусного иммунитета относятся специфические цитотоксические Т-лимфоциты, Т-хелперы, ЕК-клет- ки, Т-эффекторы ГЗТ, макрофаги. Роль макрофагов в противовирусном иммунитете оценивается неоднозначно. Считается, что вирусы из-за очень малых размеров плохо фагоцитируются, проявляют большую устойчивость к лизосомальным ферментам, а некоторые из них, например вирусы медленных инфекций, кори и герпеса, даже размножаются в фагоцитах. В качестве самого серьезного довода против признания защитной роли фагоцитов в противовирусном иммунитете приводятся некоторые данные о том, что, мигрируя, макрофаги диссеминируют репродуцирующиеся в них вирусы на чувствительные клетки. Учитывая это, нельзя забывать, что макрофаги как антигенпрезентирующие клетки участвуют в выработке противовирусных антител, являются продуцентами интерферонов, активно поглощают зараженные вирусами клетки, медленно, но инактивируют многие вирусы. Наконец, способность макрофагов удерживать и переваривать вирусы постепенно нарастает и у взрослых животных выражена в большей степени, чем у новорожденных. В обеспечении видового иммунитета существенную роль принадлежит Т- цитотоксическим лимфоцитам (Т- киллерам), а также главной системе гистосовместимости (подробнее- в следующих лекциях). Т- киллеры по представлению антигенов главной системы гистосовместимости класса 1 распознают любые чужеродные антигены (включая мутантные, например- раковые клетки), атакуют и уничтожают их. Сборка вирусных частиц. Выход вируса из клетки. Выход вируса или вирусовыделение или высвобождение вируса из клетки-хозяина — выброс и высвобождение потомства вируса после успешного размножения в клетке-хозяине. После того, как репликация была завершена и клетка-хозяин исчерпала все ресурсы при создании вирусного потомства, вирусы могут начинать покидать клетку несколькими способами[1]. Термин используется для обозначения выделения вируса из одной клетки, также, для обозначения выделения вируса из одной части тела в другую часть тела[2], также, для обозначения выделения из организма в окружающую среду, где вирусы могут заразить другие тела[3]. Через почкование «Почкование» через клеточную оболочку — по сути, заимствование клеточной мембраны для создания собственной вирусной оболочки — наиболее встречающийся способ размножения тех вирусов, которым в первую очередь нужна оболочка. К таковым относятся вирусы с оболочкой, такие как вирус иммунодефицита человека, вирус простого герпеса первого типа, тяжёлый острый респираторный синдром и натуральная оспа. В начале процесса почкования капсид, — внешняя оболочка вируса, состоящая из белков, — взаимодействует с определенной областью мембраны клетки-хозяина. Во время этого взаимодействия гликозилированный белок вирусной оболочки внедряется в клеточную мембрану. Чтобы успешно расплодиться из клетки-хозяина, капсид вируса должен образовать связь с цитоплазматическими хвостами белков оболочки[4]. Хотя почкование не приводит к немедленному разрушению клетки-хозяина, этот процесс будет медленно истощать клеточную мембрану и в конечном итоге приведет к гибели клетки. Этот процесс также вовлекает противовирусное реагирование, обнаруживающее зараженные вирусом клетки[5]. Почкование наиболее интенсивно изучалось в отношении вирусов из домена эукариоты. Однако было продемонстрировано, что вирусы, инфицирующие прокариоты домена Археи, также используют этот механизм высвобождения вирионов[6]. Через апоптоз Животные клетки запрограммированы на самоуничтожение, когда они подвергаются вирусной атаке или повреждаются каким-либо иным способом. Заставляя клетку подвергаться апоптозу, или самоубийству клетки, вирусное высвобождение потомства в межклеточное пространство становится возможным. Однако апоптоз не обязательно приводит к тому, что клетка просто раскрывается и выливает свое содержимое во межклеточное пространство, — апоптоз обычно контролируется и приводит к тому, что клеточный геном расщепливается до тех пор, пока апоптотические тела (в английской литературе: apoptotic bodies, bleb, — везикулярный нарост плазмы или ядерной мембраны) материала мертвой клетки не оторвутся от клетки, чтобы быть поглощенными макрофагами. Для вируса это хороший способ проникнуть в макрофаги, как для того, чтобы заразить их, так и для того, чтобы таким простым образом путешествовать в другие ткани организма. Хотя этот процесс в основном используется вирусами без оболочки, вирусы с оболочкой также могут его использовать. Вирус иммунодефицита человека является примером вируса с оболочкой, который использует этот процесс для заражения макрофагов[7]. Через экзоцитоз Вирусы также покидают клетки через экзоцитоз, которого клетка-хозяин не разрушается. Вирусы, которые относятся к вирусам с оболочками из ядерных или эндосомальных мембран могут покинуть клетку через экзоцитоз[4]. Вирусное потомство синтезируется в клетке, и транспортная система клетки-хозяина используется для включения их в везикулы; везикулы вирусного потомства переносятся на клеточную мембрану и затем высвобождаются во межнеклеточное пространство. Это используется, прежде всего, вирусами без оболочки, хотя вирусы с оболочкой также показывают это. Примером является использование рециркуляции рецепторов вирусных частиц вирусом ветряной оспы, имеющей оболочку[8]. Вирусовыделение См. также: Механизм передачи инфекции и Бессимптомный носитель Человек с вирусным заболеванием заразен, если он выделяет вирусы. Поэтому скорость, с которой зараженный человек с течением определённого времени выделяет вирусы, представляет значительный интерес. Некоторые вирусы, такие как Вирус простого герпеса первого типа (который вызывает генитальный герпес), могут вызывать «бессимптомное выделение вируса» и, следовательно, распространяться незамеченными от человека к человеку, так как при этом нет повышенной температуры и других признаков болезни, которые бы показали контагиозную природу хозяина во время такого рода вирусовыделения[9]. Другим важным компонентом вирусовыделения является вопрос о том, играет ли возраст зараженного человека роль в том, как долго человек будет распространять вирус. Миланский университет провел исследование вируса гриппа A/H1N1/2009, чтобы определить, происходит ли распространение новой пандемии в течение более длительного времени у молодых, чем у взрослых. В исследование были включены только дети с симптомами, которые появились за два дня до посещения больницы, они были моложе 15 лет и не сталкивались с какими-либо серьезными осложнениями. После физических осмотров и образцов, взятых из глотки детей с вирусоположительным диагнозом, результаты определили, что продолжительность вирусовыделения (в днях) не зависит от возраста. Вирусовыделение не было связано с возрастом, потому что не было различий между детьми в разных возрастных группах. Заразность в этой ситуации может длиться до 15 дней, что означает, что, когда данное вирусное заболевание поражает большую часть локализованной популяции, должны быть приняты надлежащие меры карантинной защиты, чтобы предотвратить дальнейшее распространение вируса через вирусовыделение[10]. Механизм действия интерферонов. При заражении клетки вирус начинает размножаться. Клетка-хозяин одновременно с этим начинает продукцию интерферона, который выходит из клетки и вступает в контакт с соседними клетками. Хотя интерферон не обладает прямым противовирусным действием, он способен вызывать такие изменения в клетках, которые препятствуют размножению вируса, формированию вирусных частиц и дальнейшему его распространению. Интерферон действует в нескольких направлениях. Во-первых, он оказывает влияние на клетки, соседние с инфицированной, запуская в них цепь событий, приводящих к подавлению синтеза вирусных белков и в некоторых случаях сборки и выхода вирусных частиц (путём активации олигоаденилатциклазы). В ответ на воздействие интерферона клетки вырабатывают большое количество протеинкиназы R. Этот фермент фосфорилирует фактор инициации трансляции eIF-2, фосфорилированный eIF-2 формирует неактивный комплекс с другим фактором, eIF-2B. В результате уровень белкового синтеза в клетке снижается. После протеинкиназы R активируется синтез рибонуклеазы L, которая расщепляет клеточные РНК и ещё больше снижает уровень белкового синтеза. В целом, интерферон-зависимое подавление трансляции является губительным как для вируса, так и для клетки-хозяина. Помимо влияния на трансляцию, интерфероны способны активировать сотни других генов (они известны как гены, стимулируемые интерфероном), играющих роль в защите клетки от вирусов[12][13]. Кроме того, интерферон лимитирует распространение вирусных частиц путём активации белка p53, что ведёт к апоптотической смерти инфицированной клетки[14][15]. Вторым направлением действия интерферонов является стимуляция иммунной системы для борьбы с вирусами. Интерферон повышает синтез молекул главного комплекса гистосовместимости I и II классов и активирует иммунопротеасому. Высокий уровень молекул главного комплекса гистосовместимости I класса обеспечивает эффективную презентацию вирусных пептидов цитотоксическим Т-лимфоцитам и натуральным киллерам, а иммунопротеасома осуществляет процессинг вирусных пептидов, предшествующий презентации. Высокий уровень молекул главного комплекса гистосовместимости II класса обеспечивает презентацию вирусных антигенов Т-хелперам. Т-хелперы, в свою очередь, выделяют цитокины, которые координируют активность других клеток иммунной системы. Некоторые виды интерферонов, например интерферон-γ, могут прямо стимулировать клетки иммунной системы, такие как макрофаги и натуральные киллеры. Образование интерферона могут стимулировать не только интактные вирусы, но и различные другие агенты, например некоторые инактивированные вирусы, двухцепочечные РНК, синтетические двухцепочечные олигонуклеотиды и бактериальные эндотоксины. Биологическая активность интерферона очень высока. У мышиного интерферона она составляет 2⋅109 ед./мг, а одна единица снижает образование вирусов примерно на 50 %. Это означает, что достаточно одной молекулы интерферона, чтобы сделать клетку резистентной к вирусной инфекции. Показано, что молекулы интерферона должны оказывать действие на клетку в течение минимум четырёх часов, для того, чтобы в клетке начались процессы борьбы с вирусом, таким образом, многие специалисты не считают эффективным интраназальное применение интерферона для профилактики ОРВИ[16]. Тем не менее, последние исследования на мышах показывают, что интерферон, применённый на слизистую оболочку, может действовать в качестве иммунологического адъюванта против вируса гриппа, усиливая специфический ответ иммунной системы[17]. В США проводятся клинические испытания вакцины против гриппа, которая использует интерферон в качестве адъюванта[18]. Интерферон вызывает и целый ряд других биологических эффектов, в том числе подавляет размножение клеток. Репликация вирусов. Репликация вирусов происходит в несколько стадий: 1.Адсорбция: вирус контактирует с клеткой специфическими молекулами на своей поверхности: например, ортомиксовирусы и парамиксовирусы адсорбируются с помощью гликопротеинов, а аденовирусы — с помощью пентоновых волокон. В адсорбции участвуют специфические клеточные рецепторы: гликопротеины, фосфолипиды или гликолипиды. Адсорбция может быть нарушена антителами, связывающимися с вирусной оболочкой или самой клеткой хозяина. 2.Проникновение (пенетрация) следует сразу за адсорбцией. После этого вирусную частицу уже невозможно отделить от клетки хозяина, не повредив её. Механизмы проникновения: а. Прямое проникновение: капсид остаётся связанным с внешней поверхностью клеточной мембраны, а его содержимое попадает внутрь клетки. б. Слияние с мембраной. в. Эндоцитоз. 3.Разрушение оболочки происходит благодаря закислению среды эндосомы, в которой находится вирусная частица, до pH = 5. За это ответственны протонные насосы H+-АТФазы в мембранах эндосом. Низкие значения pH приводят к изменению конформации компонентов вирусной оболочки, которые своими гидрофобными участками начинают контактировать с мембранами эндосом, это приводит к попаданию вируса в цитозоль. 4.Репликация вирусного генома становится возможной, благодаря переключению клеточных систем синтеза на репликацию и транскрипцию вируса. Для этого вирус приостанавливает синтез белка клеткой и диссоциирует полирибосомы. Некоторые вирусы не только не блокируют клеточные синтезы, но и ускоряют их. 5.Сборка вирионов. 6.Выход вирионов из клетки. Основные типы вакцин против вирусов. Вакцина представляет собой биологический препарат, приготовленный из возбудителей инфекции, лишенных патогенных свойств, но сохранивших иммунногенные свойства. Введение в организм вакцины ведет к активации факторов иммунитета, в том числе и к образованию антител против того возбудителя, из которого приготовлена вакцина. Вакцина – это биопрепарат, предназначенный для создания активного иммунитета. В зависимости от биологической системы, используемой для культивирования вакцинного штамма вируса, различают тканевые, авинизированные, культуральные вакцины. Тканевые вакцины в своей основе содержат какую-либо ткань животных, в которой размножался и накапливался вакцинный вирус. Например, вакцину против бешенства готовили из мозговой ткани овец, зараженных пастеровским вирусом-фикс бешенства, лапинизированную вакцину против ящура – из тканей крольчат, зараженных адаптированным к ним вакцинным штаммом. Количество тканевых вакцин постепенно сокращается. Авинизированные вакцины готовят из эмбриональных жидкостей и тканей развивающихся эмбрионов птиц, зараженных вакцинным штаммом. Наиболее часто для этих целей используют эмбрионы кур, реже уток и японских перепелов. Например, для получения вакцин против гриппа птиц, болезни Ньюкасла, гепатита утят и др. Культуральные вакцины готовят из зараженных культур клеток или переживающих тканей, при этом применяют роллерный (используют бутыли) или суспензионный (глубинный – используют реакторы) методы культивирования клеток и тканей. Это наиболее перспективный и прогрессивный метод получения вакцин. Таким методом готовят, например, вакцины против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3 крупного рогатого скота, ящура, чумы крупного рогатого скота и др. В зависимости от видовой принадлежности вакцинного штамма различают гомологические и гетерологические противовирусные вакцины. Гомологические вакцины готовят из того вида вируса, против которого предполагается создать иммунитет, например, вакцины против вирусной диареи, чумы крупного рогатого скота, бешенства и др. Большинство вирусных вакцин – гомологические. Гетерологические вакцины готовят из вирусов другого вида, но имеющих в своем составе сходные антигены и обладающих перекрестной иммуногенностью. Например, вакцину против оспы кур готовят из вируса оспы голубей, вирус герпеса индеек используют для защиты кур от болезни Марека, вирус кори – для защиты собак от чумы плотоядных и т.д. В зависимости от количества типов или видов возбудителей, включенных в состав вакцины, различают моновалентные, поливалентные, ассоциированные и смешанные вакцины. Моновалентные вакцины содержат антигены одного типа (вида) вируса. Поливалентные вакцины (бивалентные, трехвалентные и т.д.) готовят из нескольких типов одного вируса. Например, трехвалентную противоящурную вакцину получают из трех типов вируса ящура – А, О и С. Ассоциированные вакцины содержат антигены возбудителей разных видов, например, вакцина «Бивак» – против инфекционного ринотрахеита и парагриппа-3 крупного рогатого скота, «Тетранак» – против чумы, аденовироза, инфекционного гепатита и парвовирусного энтерита собак. Смешанные вакцины представляют собой смесь вирусных и бактерийных антигенов, например, вакцина против чумы плотоядных, ботулизма и вирусного энтерита собак. В зависимости от жизнеспособности (способности к репродукции) вируса, входящего в состав вакцины, все противовирусные вакцины подразделяют на живые и инактивированные. Живые вакцины содержат живые селекционированные ослабленные (аттенуированные) штаммы вирусов. Инактивированные вакцины содержат инактивированные штаммы вирусов. Чаще для этой цели используют эпизоотические штаммы, которые инактивируют (обезвреживают) физическими или химическими методами. |