тобт. Вопросы по курсу теоретические основы биотехнологии
 Скачать 385.01 Kb.
|
|
Непрерывные методы культивирования. Культивирование продуцентов в промышленных условиях принято называть ферментацией. В зависимости от классификационного признака различают следующие типы ферментационных процессов: · по отношению микроорганизмов продуцентов к кислороду: аэробные и анаэробные; · по локализации продуцентов в питательной среде: глубинные и поверхностные; · по условиям проведения процесса: периодические, полунепрерывные (отъемно-доливные, с подпиткой); непрерывные. В непрерывных процессах биообъект постоянно поддерживается в экс поненциальной фазе роста. Обеспечивается непрерывный приток свежей пита тельной среды в биореактор и отток из него культуральной жидкости, содержа щей клетки и продукты их жизнедеятельности. Фундаментальным принципом непрерывных процессов служит равновесие между приростом биомассы за счет деления клеток и их убылью в результате разбавления свежей средой. Различают хемостатный и турбидостатный режимы не прерывного культивирования. По турбидостатному принципу концентрация биомассы поддерживается скоростью потока среды, а по хемостатному – концентрацией подаваемого субстрата. Известен также способ регулирования роста культуры по рН. При турбидостатном методе регулирования контролируются концентрации суспензии входящей жидкости, создаваемой микробными клетками. Метод осуществляется с помощью фотоэлемента или рН-электрода, если в культуральной жидкости образуются органические кислоты. Хемостатный контроль проще, так как он происходит по входящему потоку. Этот метод регулирования применим ко всем типам микроорганизмов и клеток различных тканей животных и растений. Биореактор в хемостатном режиме снабжен устройствами для вливания и выпуска питательной жидкости, имеет систему контроля скорости потока, перемешивание.
Метаболизм ацетата Ацетат является одним из промежуточных продуктов обмена веществ в нашем организме. В норме ацетат вырабатывается в небольших количествах и быстро метаболизируется. Его физиологическая концентрация в крови достаточно низкая - 0,1 - 0,2 ммоль/л. Метаболизм ацетата, как и любого другого органического аниона, начинается с превращения его в соответствующую кислоту. Для этого необходим ион водорода, источником которого в организме является угольная кислота, а правильнее сказать - два её компонента: углекислый газ и вода. В результате этих реакций образуются бикарбонатный ион и уксусная кислота. Обе реакции можно суммировать в одну: СН3СОО - + СО2 + Н2О -> СН3СООН + НСО3- В процессе метаболизма из каждого иона ацетата образуется один ион бикарбоната. Иначе говоря, при метаболизме одного иона ацетата в организме сохраняется один бикарбонатный ион, так как анион ацетата связывает катион водорода, что делает доступным бикарбонат для других буферных реакций.
Коэнзим-А активизирует уксусную кислоту с потреблением энергии макроэргических связей АТФ, которая, в свою очередь, дефосфорилируется до АМФ. Активный ацетат (ацетил-КоА), являясь основным метаболитом организма, затем обычно полностью окисляется в цикле Кребса до СО2 и Н2О. Метаболизм ацетил-КоА может также идти по малому пути окисления с образованием жирных кислот, кето-кислот и холестерина.
Клеточная мембрана представляет собой двойной слой (бислой) молекул класса липидов, большинство из которых представляет собой так называемые сложные липиды-фосфолипиды. Молекулы липидов имеют гидрофильную («головка») и гидрофобную («хвост») часть. При образовании мембран гидрофобные участки молекул оказываются обращены внутрь, а гидрофильные -- наружу. Мембраны - структуры инвариабельные, весьма сходные у разных организмов. Некоторое исключение составляют, пожалуй, археи, у которых мембраны образованы глицерином и терпеноидными спиртами. Толщина мембраны составляет 7-8 нм. Биологическая мембрана включает и различные белки: интегральные (пронизывающие мембрану насквозь), полуинтегральные (погруженные одним концом во внешний или внутренний липидный слой), поверхностные (расположенные на внешней или прилегающие к внутренней сторонам мембраны). Некоторые белки являются точками контакта клеточной мембраны с цитоскелетом внутри клетки, и клеточной стенкой (если она есть) снаружи. Некоторые из интегральных белков выполняют функцию ионных каналов, различных транспортеров и рецепторов. Питательные вещества проникают в клетку несколькими способами. 1. Пассивная диффузия, т.е. перемещение веществ через толщу мембраны, в результате чего выравниваются внутренняя концентрация веществ и осмотическое давление по обе стороны оболочки. Таким путем могут проникать питательные вещества, когда концентрация в среде значительно превышает концентрацию веществ в клетке. 2. Облегченная диффузия – проникновение питательных веществ в клетку с помощью активного переноса их особыми молекулами – переносчиками, называемыми пермеазами. Это вещества ферментной природы, которые локализованы на цитоплазматической мембране и обладают специфичностью. Каждая пермеаза адсорбирует соответствующее питательное вещество на наружной стороне цитоплазматической мембраны, вступает с ним во внутреннюю связь и диффундирует через мембрану, отдавая на внутренней стороне транспортируемое ею вещество в цитоплазму. Этот процесс совершается без использования энергии, так как перемещение веществ происходит от более высокой концентрации к более низкой. 3. Активный транспорт питательных веществ осуществляется также с помощью пермеаз, но этот процесс требует затраты энергии. В этом случае питательное вещество не может проникнуть в клетку, если концентрация его в клетке значительно превышает концентрацию в среде. 4. В ряде случаев транспортируемое вещество может подвергаться химической модификации, и такой способ переноса веществ получил название переноса радикалов или транслокации химических групп. По механизму передачи транспортируемого вещества этот процесс сходен с активным транспортом. Выход веществ из микробной клетки осуществляется или в виде пассивной диффузии, или в процессе облегченной диффузии с участием пермеаз.
В зависимости от отношения микроорганизмов к молекулярному кислороду их принято делить на облигатные аэробы, факультативные анаэробы, аэротолерантные анаэробы и облигатные анаэробы. Большинство микроорганизмов, как и макроорганизмы, являются облигатными аэробами (для роста им необходим молекулярный кислород). Наряду с этим есть микроорганизмы, которые хотя и нуждаются в наличии О2, но могут расти или лучше растут при низком его содержании (2-10%). Такие микроорганизмы называют микроаэрофилами, а условия в которых они растут, микроаэробными. Факультативные анаэробы растут как в присутствии, так и в отсутствии О2. Но в зависимости от условий роста происходят изменения в их метаболизме, прежде всего в энергетических процессах. Как правило, при наличии молекулярного кислорода такие микроорганизмы переключаются на окисление субстрата с участием О2, т.е. на аэробное дыхание, поскольку оно более выгодно, чем получение энергии в результате анаэробных процессов. Наглядным примером могут служить некоторые дрожжи, способные осуществлять в анаэробных условиях спиртовое брожение, а в аэробных полностью окисляющие в процессе дыхания сахара с образованием углекислоты и воды. Довольно много факультативных анаэробов и среди бактерий. Это Esсheriсhia, некоторые представители рода Baсillus, Рaraсоссus deiсans и ряд других. К аэротолерантным анаэробам принадлежат многие молочнокислые бактерии, способные расти в присутствии молекулярного кислорода, но при этом их метаболизм остается таким же, как и в анаэробных условиях. И в том и в другом случае они осуществляют брожение. Облигатные анаэробы не только не нуждаются для роста в наличии молекулярного кислорода, но и для многих видов он токсичен даже в ничтожно малой концентрации. К числу строгих анаэробов относятся метанобразующие, сульфатредуцирующие бактерии и ряд других прокариот. Среди эукариот облигатными анаэробами являются некоторые простейшие, в частности отдельные представители трихомонад.
Культивирование продуцентов в промышленных условиях принято называть ферментацией. В зави-симости от классификационного признака различают следующие типы ферментационных процессов: • по отношению микроорганизмов продуцентов к кислороду: аэробные и анаэробные; • по локализации продуцентов в питательной среде: глубинные и поверхностные; • по условиям проведения процесса: периодические, полунепрерывные (отъемно-доливные, с под-питкой); непрерывные. Глубинный метод культивирования продуцентов ферментов Глубинный метод культивирования заключается в выращивании микроорганизмов в жидкой питательной среде. Он технически более соверше нен, чем поверхностный, так как легко поддается механизации и автоматизации. Весь процесс должен проводиться в строго асептических условиях, что с одной стороны, является преимуществом метода, а с другой - составляет наи большую техническую трудность, т.к. нарушение асептики часто приводит к прекращению образования фермента. Концентрация фермента в среде при глубинном культивировании обыч но значительно ниже, чем в водных экстрактах поверхностной культуры. Фильт раты культуральных жидкостей содержат не более 3% сухих веществ. Это вызы вает необходимость предварительного концентрирования фильтратов перед тем, как выделять ферменты любым методом. Культивирование аэробных микроорганизмов проводят следующим образом: на поверхности плотных сред или в тонком слое жидких сред, когда микроорганизмы получают кислород непосредственно из воздуха; в жидких средах (глубинное культивирование). В этом случае микроорганизмы используют растворенный в среде кислород. В связи с низкой растворимостью кислорода, для обеспечения роста аэробных бактерий в толще среды, требуется постоянное аэрирование. Культивирование анаэробных микроорганизмовболее сложно, чем выращивание аэробов, так как здесь должен быть сведен до минимума контакт микроорганизмов с молекулярным кислородом. Для создания анаэробных условий используют различные приемы. Их подразделяют на физические, химические и биологические. Все они основаны на том, что микроорганизмы культивируют в каком-то замкнутом пространстве. Поверхностный метод культивирования продуцентов ферментов Культура растет на поверхности твердой увлажненной питательной среды. Мицелий полностью обволакивает и прочно скрепляет твердые части цы, клетки получают питание за счет содержащихся в этих средах веществ и ис пользуют для дыхания кислород воздуха, поэтому для их нормального обеспече ния кислородом приходится применять рыхлые по своей структуре среды с не большой высотой слоя. Недостатком метода является необходимость больших площадей для вы ращивания. Выращивание производственной культуры происходит обычно в не асептических условиях. Однако среда и кюветы должны быть надежно стерили зованы. Перед новой загрузкой должны дезинфицироваться растильные камеры, а также все мелкое оборудование и инвентарь. Главное преимущество поверхностного метода - более высокая конечная концентрация фермента на единицу массы среды. Например, для осахаривания 100 кг крахмала в спиртовом производстве требуется 5 кг поверхностной культу ры плесневых грибов или около 100 кг культуральной жидкости. Поверхностные культуры можно быстро и легко высушить, их легко перевести в товарную фор му и транспортировать. Меньше потребность электроэнергии по сравнению с глубинным методом. епрерывное культивирование перспективное. Его сущность заключается в том, что в ферментаторе поддерживаются постоянные условия среды, в результате чего микроорганизмы остаются в определенном физиологическом состоянии. Подается свежая питательная среда и удаляется избыток среды с продуктами метаболизма, поддерживается фаза экспоненциального роста. Если для культивирования продуцента используется один ферментатор, то говорят о гомогенно-непрерывном процессе. Если же используется батарея, то это гетеро-непрерывный процесс, так как в каждом ферментаторе, соединенном в батарею, поддерживаются постоянные условия. При непрерывном культивировании микроорганизмов отсутствует смена фаз развития культуры. В таких процессах скорость потока питательной среды и отвода культуральной жидкости из системы необходимо отрегулировать, чтобы концентрация клеток оставалась постоянной. В стерильных условиях непрерывный метод обеспечивает сохранение культуры в физиологически активном состоянии длительное время. Поддержание динамики равновесия в реакторе осуществляется двумя методами: турбидостатным и хемостатным. Периодическое культивирование микроорганизмов. В периодическом состоянии динамика роста и размножения микроорганизмов в жидкой питательной среде обладает рядом особенностей, общих для бактерий, актиномицетов, микроскопических грибов, микоплазм. При индивидуальном развитии им свойственна высокая скорость размножения. Развитие происходит в виде последовательных фаз, характер и продолжительность которых зависят от физиологического состояния клеток, определяемого, в свою очередь, условиями разнообразных факторов среды, в которой развивается популяция того или иного организма. Другими словами, фазы роста микроорганизма отражают количественные и качественные изменения в их биомассе и окружающей среде. В простой гомогенной периодической культуре микроорганизмов выделяют от 4 до 8 и даже до 16 фаз. Рост микробной популяции изображают обычно графиками, откладывая на оси абсцисс время роста, а на оси ординат - число микробных клеток а) исходная фаза (лаг-фаза или инукционный период) является фазой задержки роста, когда размножение микробных клеток не происходит. Данная фаза характеризуется отсутствием роста клеток. В этот период посевная культура приспосабливается к изменившимся внешним условиям и вырабатывает ферменты, необходимые для роста на данной питательной среде. В лаг-фазе в клетках культуры происходят значительные качественные изменения: возрастает количество нуклеиновых кислот, в первую очередь РНК, активизируются одни ферменты и синтезируются другие. Продолжительность лаг-фазы зависит от следующих факторов: - от состава питательной среды: если питательная среда по составу мало отличается от среды, на которой росла посевная культура, лаг-фаза может практически отсутствовать; - от качества посевного материала, а именно, количества в нем жизнеспособных клеток, их возраста, способа хранения; - от посевной дозы. б) период положительного ускорения роста. Длительность этого периода для большинства микроорганизмов составляет 2 часа и зависит от температуры, состава питательной среды, качества посевного материала. Многие авторы эти две фазы рассматривают вместе. Число клеток остается постоянным по причине отсутствия в этот период клеточного деления. Общее состояние микробных клеток характеризуется как состояние приспособления к питательной среде. В этот период усиливается синтез вещества, клеток, они увеличиваются в размере, в них образуется большое количество индуцибельных ферментов. в) фаза логарифмического (лог-фаза), или экспоненциального (показательного), роста. Она характеризуется постоянной и максимальной скоростью роста клеток. Рост микробов в эту фазу происходит в геометрической прогрессии. Продолжительность этой фазы зависит: - от запасов питательных веществ в среде; - от условий аэрации; - от перемешивания и др. факторов. Для описания процессов роста микроорганизмов используют такие характеристики, как общая и удельная скорости роста биомассы (или числа клеток). Другой важной характеристикой роста культуры является время генерации, за которое биомасса культуры удваивается. Время генерации из разных культур микроорганизмов сильно различается. Наиболее быстрорастущие бактерии при благоприятных условиях имеют период генерации - 20-25 мин. Продолжительность генерации в лог-фазе у разных микроорганизмов неодинакова. Так, для сальмонелл она равна 20-30 мин., для стрептококков и стафилококков - 25-35 мин., для эшерихий - 15-17 мин. На продолжительность генерации влияют температура, рН среды, состав среды и т.д. Высокая скорость развития микроорганизмов сохраняется на всей экспоненциальной стадии. Однако эта зависимость наблюдается в течение ограниченного времени. По мере роста культуры в среде постепенно потребляются питательные вещества, накапливаются продукты обмена, затрудняется транспорт питательных веществ (в первую очередь кислорода) и метаболитов вследствие увеличения плотности популяции. г) фаза отрицательного ускорения. В эту фазу скорость размножения замедляется, а время генерации увеличивается. Наступление данной фазы обусловлено истощением питательной среды и накоплением в культуральной жидкости токсических веществ, которые начинают ингибировать развитие культуры. Кроме того, в эту фазу происходит наивысшее накопление микробной массы в единице объема. д) стационарная фаза роста, или максимума, на протяжении которой численность микробной популяции не уменьшается. В эту фазу скорость размножения и отмирания клеток одинаковая. Концентрация живых клеток в данную фазу достигает максимума, и она называется М-концентрацией. В этой фазе сама биомасса микроорганизмов и продуктов их биосинтеза обладает наибольшей биотехнологической ценностью. е) фаза отмирания микробной популяции. |
