тобт. Вопросы по курсу теоретические основы биотехнологии
 Скачать 385.01 Kb.
|
|
Первичные и вторичные метаболиты. Особенности образования. См 3 и 4
Различные физико-химические факторы, а также микроорганизмы, могут вызывать разложение и порчу жиров. Начальной стадией разрушения жиров является их гидролиз (омыление) на глицерин и жирные кислоты. Этот процесс легко происходит при высокой температуре под действием щелочей или кислот. Под влиянием ферментов (липаз) гирдолиз протекает при обычной температуре. Омыление жиров при воздействии ферментов происходит, например, во время переваривания жиров в пищеварительном тракте животных. Ферменты, разрушающие жиры, вырабатываются многими микроорганизмами. Образовавшиеся в результате гидролитического расщепления глицерин и жирные кислоты затем подвергаются дальнейшему разрушению. Наиболее легко разрушается глицерин, служащий для многих микроорганизмов источником углерода. Разрушение глицерина может происходить в аэробных и анаэробных условиях. Жирные кислоты менее подвержены разрушению, однако и они постепенно окисляются, преимущественно в аэробных условиях. Конечной стадией разрушения глицерина и жирных кислот является их минерализация, сопровождающаяся образованием углекислого газа и воды. Наиболее активно разлагают жиры некоторые пигментные и флуоресцирующие бактерии, микрококки и актиномицеты, а также плесневые грибы, особенно оидиум лактис и многие виды из родов аспергиллус и пенициллиум. Разложение жиров микроорганизмами в почве и воде происходит постоянно, оно является составной частью общего круговорота веществ в природе. Порча пищевых жиров микробами нередко наносит большой ущерб. Развитию в жирах микроорганизмов способствует наличие в них воды и органических примесей. Поэтому чем меньше влаги содержится в жире и чем полнее он очищен от примесей, тем лучше сохраняется.
Микроорганизмы используют питательные вещества среды не только на построение клеточного вещества, но и на обеспечение энергией всех биохимических превращений в клетке. В процессе роста культуры состав среды меняется, это оказывает влияние на развитие культуры и ее биосинтетическую способность. Часто сырьем для выращивания микроорганизмов служит материал,который они не в состоянии использовать без предварительной подготовки (целлюлоза, гемицеллюлоза, крахмал, пектин и т. д.). В этих слу- чаях для приготовления питательной среды биополимеры предварительно гидролизуют ферментативным или химическим способом дополучения усвояемой формы. Наибольшее значение среди веществ питательной среды имеет углерод. Он входит в состав почти всех органических соединений клетки: аминокислот, белков, углеводов, нуклеиновых кислот, липидов. Большинство микроорганизмов, применяемых как продуценты белков и аминокислот, в качестве источника углерода используют органические вещества. Клетки сине-зеленых водорослей используют диоксид углерода. Непосредственным источником углерода могут быть углеводы несложного строения: гексозы, пентозы, низкомолекулярные олигосахариды, органические кислоты, спирты, жирные кислоты, легкие и тяжелые углеводороды и др. Азот микроорганизмы усваивают только в виде неорганических солей, кислот, органических соединений. Незначительный недостаток азота в питательной среде приводит к «ожирению» клеток, т. е. к повышению содержания в них липидов за счет уменьшения белковой и аминокислотной фракции. Поэтому в производственных условиях при получении обогащенных белком кормовых дрожжей следят за тем, чтобы в среде не было недостатка азота. Источниками фосфора являются соли фосфорной кислоты. Их вносят в среду с различными естественными субстратами (отварами растительных тканей, мукой, кукурузным экстрактом), реже – с синтезированными соединениями (фитин). В клетке фосфор входит в состав АТФ, АДФ, АМФ, обеспечивая энергетический конструктивный обмен. Состав питательной среды для каждого продуцента устанавливают экспериментально. Это трудоемко и требует глубоких знаний физиологии микроорганизма. Для обеззараживания питательных сред применяют дезинфекциию, воздействие температуры и других физических факторов (ультразвук,ультрафиолетовое облучение, ультрафильтрация). Каждый из этих методов весьма избирателен. В биотехнологии широко применяют термические методы обеззараживания (автоклавирование, стерилизацию, кипячение, пастеризацию и др.). Состав среды и оптимальные режимы определяют двумя способами: длинным многостадийным эмпирическим подбором и использованием математических методов планирования эксперимента. Первый способ является самым распространенным в настоящее время.
 
роме репрессии конечным продуктом, характерной для анаболических путей, описан тип репрессии, называемой катаболитной и заключающейся в том, что быстро используемые клеткой источники энергии способны подавлять синтез ферментов других путей катаболизма, участвующих в метаболизировании сравнительно медленно используемых источников энергии. Катаболитную репрессию можно рассматривать как приспособление клетки к использованию в первую очередь наиболее легко доступных источников энергии. В присутствии такого источника энергии потребление других субстратов, менее "удобных" для клетки, временно приостанавливается, и пути катаболизирования этих субстратов временно выключаются. Известно, что если в среде для выращивания E.coli одновременно содержатся глюкоза и лактоза , сначала используется глюкоза. Несмотря на присутствие индуктора лактозного оперона , ферменты, участвующие в катаболизме лактозы, не синтезируются. Транскрипция генов лактозного оперона начинается, когда концентрация глюкозы в среде становится низкой. Таким образом, глюкоза препятствует синтезу ферментов лактозного оперона. Как это осуществляется? Изучение механизма катаболитной репрессии обнаружило, что этот тип регуляции тесно связан с внутриклеточным уровнем циклического АМФ (цАМФ) , который в этом процессе функционирует в качестве эффектора . Он образует комплекс с аллостерическим белком - катаболитным активатором, не активным в свободном состоянии. Этот комплекс, присоединившись к определенному участку на промоторе , обеспечивает возможность связывания РНК-полимеразы с промотором и инициацию транскрипции. Количество образующегося комплекса определяется концентрацией цАМФ, которая уменьшается пр увеличении содержания глюкозы в среде. Таким образом, глюкоза вызывает изменение внутриклеточной концентрации цАМФ. Это соединение обнаружено в клетках всех прокариот. Его единственная функция - регуляторная. Циклический АМФ образуется из АTФ в реакции, катализируемой аденилатциклазой , связанной с ЦПМ : АТФ обратимо переходит в цАМФ + пирофосфат. Аденилатциклаза обладает высокой активностью, если компоненты системы транспорта глюкозы в клетку фосфорилированы. Это происходит в отсутствие глюкозы, которую необходимо транспортировать. Таким образом, активность аденилатциклазы возрастает при уменьшении концентрации глюкозы в среде. Последнее приводит к повышению образования цАМФ и в конечном итоге к индукции синтеза ферментов катаболизма лактозы. Наоборот, при высокой концентрации глюкозы в среде система ее транспорта находится в дефосфорилированном состоянии, следствием чего является уменьшение активности аденилатциклазы и соответственно количества цАМФ. Таким способом глюкоза через систему своего транспорта регулирует концентрацию цАМФ в клетке. Поскольку катаболизм глюкозы связан с образованием метаболической энергии и запасанием ее в молекулах АТФ, через глюкозу в клетке связаны пулы АТФ и цАМФ: при увеличении количества АТФ уменьшается количество цАМФ, и наоборот. Особенностью всех ферментных систем, находящихся под контролем катаболитной репрессии, является участие в их индукции универсального комплекса, состоящего из белкового катаболитного активатора и цАМФ.
Как уже отмечалось, метаболическая регуляция может нарушаться вследствие мутаций. Именно последние приводят к сверхсинтезу метаболитов. Для понимания мутационных влияний можно ограничиться рассмотрением следующего упрощенного примера. Аллостерические ферменты, подверженные ингибированию по принципу обратной связи, состоят из двух видов белковых субъединиц: субстратсвязываюшей, несущей на себе каталитический .центр, и регуляционной (аллостерической), служащей центром связывания ингибитора, действующего по принципу обратной связи. Временное занятие центра ингибитором, конечным метаболитом {или аллостерическим эффектором) приводит к конформационному изменению белковой макромолекулы фермента, затрудняющему прикрепление субстрата к центру его связывания (рис. 1.7). Мутация меняет конформацию белка таким образом, что теряется активность по отношению к алло- * стерическому эффектору, но не каталитнчеокая. Это приводит к образованию избыточного количества соответствующего конечного продукта. Репрессия синтеза ферментов, необходимых, например, для образования аминокислот, обусловливается ря-дом реакций в специфических генах, детерминирующих синтез этих ферментов. Если ген-регулятор i закодирован на продуцирование внутриклеточного неактивного белка-репрессора (апо- репрессора), а соответствующий конечный продукт—аминокислота — представлен в клетке в малых концентрациях, то ген- оператор о не будет блокирован белком-апорепрессором, РНК-полимераза сможет перемещаться от гена-промотора р и транскрибировать структурный ген. Следовательно, будут образовываться необходимые для синтеза аминокислоты ферменты, например аспартаткиназы — конститутивные ферменты (рис. 1.8, вверху слева).Напротив, при высоких концентрациях в клетке аминокислоты или когда она содержится в питательной среде, апорепрессор активируется аминокислотой или продуктом ее превращения, например комплексом аминоацил-тРНК. (рис. 1.8, внизу слева). Затем активированный апорепрессор (холорепрессор) взаимодействует с геном-оператором и предотвращает транскрипцию структурного гена в мРНК; следовательно, ферменты образовываться не будут.Мутации (дефект) генов i или о приводят либо к образованию дефектного апорепрессора, не способного взаимодействовать даже с избытком аминокислоты, или к возникновению неактивной в отношении к холорепрессору конформации структурного гена; в обоих случаях эффект одинаков (рис. 1.8, справа). В таких мутантах наблюдают, как правило, сверхпродуцирование ферментов, а значит, целевой аминокислоты. Следствием этих дефектов может быть индукция ферментов. При этом ин- дуцибельные ферменты становятся конститутивными, т. е. не зависят от наличия субстрата в клетке, а катаболитная репрессия исчезает. Мутанты с дефектами регуляции принято называть регуляторными мутантами; их функцией является синтез конститутивных ферментов.Наконец, включение механизма ингибирования по принципу обратной связи—-еще одного регуляционного способа контроля жизнедеятельности микроорганизма (см. рис. 1.4)—достигается при наличии в штамме-продуценте мутационного нарушения регуляции, дефекта (разрыва) в биохимической последовательности образования конечного продукта. Способность клетки к образованию и накоплению внутриклеточных конечных продуктов — ингибиторов ограничивается, поскольку отсутствует (или выключен) соответствующий фермент. При ограничении накопления конечного продукта становится возможным рост клеток продуцента. В то же время в клетке накапливаются высокие концентрации промежуточного целевого продукта. Мутанты с ограничением накопления конечных продуктов метаболизма принято называть ауксотрофными.Часто сверхпродуценты являются многократными мутантами, которые имеют оба вида дефектов (ауксотрофно-регуляторные мутанты).
  |