Введение в биотехнологию. Презентационные материалы. Банк тестовых заданий в системе UniTest». Ю. О. Сазыкин С. Н. Орехов И. И. Чакалева
 Скачать 7.47 Mb.
|
|
Контрольные вопросы. Каково влияние механизма ретроингибирования на выход конечных продуктов биосинтеза лекарственных средств 2. Как влияет изменение содержания источников углерода, азота и фосфора в питательной среде на биосинтез антибиотиков. Каковы механизмы регуляции экспрессии генов и их использование в биотехнологических процессах. Какова роль системы регуляции метаболизма, обусловленной гуа- нозин-тетрафосфатом в биосинтезе целевых продуктов. Какую роль играет катаболитная репрессия в биосинтезе лекарственных средств. Что представляют собой мутанты с измененной регуляцией азотного метаболизма и каковы возможности интенсификации биосинтеза ряда первичных, вторичных метаболитов и некоторых ферментов. Что такое системы внутриклеточного транспорта и секреции биотехнологических продуктов у микроорганизмов. Каковы механизмы защиты клетки, если она является «суперпро дуцентом»? 9. Как можно сохранить активность промышленных штаммов микроорганизмов. Как переносится вещество через мембраны клетки Глава ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА. Общая характеристика Процесс биотехнологического производства фармацевтических препаратов состоит из определенного количества составляющих рис. 9) и имеет разную степень сложности. Его сложность обусловлена слагаемыми конкретного биотехнологического процесса, которые варьируют в зависимости от продуцента — биообъек та (микроорганизма, растения, млекопитающего и др, и зависит от целевого конечного продукта. Если целевым продуктом является биомасса (например, живые клетки молочнокислых бактерий, то технологическая линия короче если это субстрат для производства высокоочищенных инъекционных препаратов, то схема производства сложнее (технологическая линия длиннее. Если Рис. 9. Общая схема биотехнологического производства же источником целевого продукта является микроорганизм (например, при производстве антибиотиков, то для его культивирования обязательны асептические условия, соответствующее оборудование и специальная подготовка к проведению процесса. Свои особенности имеет биотехнологическое производство, основанное на использовании микроорганизмов-рекомбинантов, которое требует усиленного контроля за стабильностью продуцента, и, кроме того, тщательного и постоянного соблюдения мер, предотвращающих возможность попадания этого биообъекта в окружающую среду. Такие меры предусматривают использование специального оборудования и соблюдения определенных правил, относящихся непосредственно к технологическому режиму. В современном биотехнологическом производстве наиболее частым биообъектом — продуцентом целевого продукта является штамм микроорганизма, выращиваемый в специальных ферментационных аппаратах (ферментерах или ферментаторах) разных типов (рис. 10). Ферментер снабжен приспособлениями (так называемой обвязкой, позволяющими создавать оптимальные условия для роста биообъекта и биосинтеза целевого продукта (не всегда эти условия совпадают). Ферментационные аппараты, используемые фармацевтической промышленностью, в основном изготавливаются из коррозион но-стойкой стали. Их объем варьирует от десяти до ста кубических метров. Обычно ферментер, установленный в цехе ферментации, выглядит как вертикально расположенный цилиндр с полукруглым дном, в котором имеется приспособление для слива культу ральной жидкости. В верхней части ферментера имеется полукруглая крышка с рядом входных устройств (вводов для питательной среды, посевного материала, пропускаемого через специальное устройство воздуха (аэрация) и выходного устройства для вывода воздуха, прошедшего через толщу питательной среды. В центре ферментера по его вертикальной оси находится мешалка (одноярусная, многоярусная, обеспечивающая массообмен. Во внутреннем пространстве ферментера находятся «отбойники», предотвращающие возникновение застойных (мертвых) зон при работе мешалки. Этим обеспечивается равномерность концентрации растворимых веществ и коллоидных частиц в среде. Постоянство оптимальной для процесса температуры в ферментере обычно поддерживается его наружной рубашкой, через которую пропускается вода с заданной температурой. Важнейшим условием успешного осуществления ферментации является соблюдение стерильности процесса. В реальных условиях добиться стерильности непросто. Этому мешают большой объем ферментера и сложность состава среды, а также большой объем пропускаемого через него воздуха и сложность конструкции ферментера. Попадание в культуральную среду и размножение в ней Рис. 10. Типы ферментеров (реакторов): а — реактор с механическим перемешиванием б — барботажная колонна в — эрлифтный реактор с внутренней рециркуляцией г — эрлифтный реактор с внешней системой рециркуляции 1 — гиотор; 2 — культуральная среда 3 — лопасги; 4 — центральная труба 5 — газожидкостной сепаратор стрелками показано направление потока культуральной жидкости разных микроорганизмов вовремя ферментации приводят к изменению ее состава, pH и реологических свойств, что, в конечном счете, ведет к снижению выхода целевого продукта. Также в нем могут присутствовать в виде примесей (или микропримесей) новые соединения, образовавшиеся в результате жизнедеятельности посторонней микрофлоры. Нестерильные ферментации недопустимы. Ввиду этого перед проведением каждого ферментационного цикла проводится стерилизация всех внутренних поверхностей ферментера и входящих в него трубопроводов пропускаемого через ферментер воздуха (так называемого технологического воздуха, подаваемого в ферментер под давлением питательных сред. Как правило, ферментер заполняется питательной средой только на две трети своей емкости. Вносимый в ферментер посевной материал должен быть представлен чистой культурой биообъекта не зараженной другими микроорганизмами). Следует иметь ввиду, что при нарушении стерильности водном месте контаминируется вся система, и содержимое ферментера, по жаргонному выражению производственников, сливается в трап, те. выбрасывается. Сложность ситуации заключается ив том, что для обнаружения заражения воды, воздуха и компонентов питательных сред микробиологическим путем необходимо от 24 ч до нескольких суток, чтобы содержание (число) посторонних клеток в 1 мл увеличилось до тысячи — видимого в микробиологическом мазке их количества. Подготовка и стерилизация технологического воздуха Эта подготовительная операция требуется для обеспечения дыхания микроорганизмов — биообъектов, большинство которых являются аэробами. Использовать для аэрации кислород можно, но экономически и по технике безопасности это нецелесообразно. Поэтому используется воздух, который под давлением поступает в ферментер непосредственно с территории предприятия. Какое же количество воздуха нужно для обеспечения одной ферментации в промышленном масштабе Приведем такой пример в ферментер объемом 50 м ежечасно подается порядка 3 ООО м стерильного воздуха, а время ферментации измеряется сутками. Для очистки и стерилизации воздуха его многократно фильтруют (рис. На первом этапе получения пригодного для пропускания через ферментер (технологического) воздуха его очищают от пыли в Рис. 11. Схема очистки технологического воздуха (стрелками показано направление потока воздуха аза пределами цеха ферментации б — в цехе ферментации фильтре предварительной очистки, а зртем подают последовательно в компрессор с системой холодильников, фильтр грубой очистки, систему стерилизации (головной фильтр, фильтры тонкой очистки. Таким образом, воздух подвергается не менее чем трехкратной фильтрации и, как минимум, дважды пропускается через стерилизующие фильтры. При этом, если головной фильтр является общим для всех аппаратов в цехе или вне цеха ферментации, то каждый из фильтров тонкой очистки относится к конкретному аппарату. На стадии грубой очистки (головной фильтр) используются волокнистые фильтрующие материалы с волокнами диаметром от 15 до 50 мкм из стекла и базальта и грубозернистые пористые перегородки. Эффективность очистки на этой стадии достигает 98 На стадии тонкой очистки (индивидуальные фильтры) применяются тонковолокнистые материалы (картон и бумага) сволок нами диаметром 0,5 мкм зернистые жесткие фильтрующие перегородки — керамические и металлокерамические, из разных полимеров. Используются также мембранные фильтры. При выборе фильтрующих материалов учитывают размер бактериальной клетки (например, для кокковых форм диаметр волокна 1 мкм, а для такой широко распространенной бактерии, как кишечная палочка, — 2 мкм. Естественно, возникает вопрос о защите находящихся в ферментере биообъектов — бактерий, актиномицетов, грибов от фагов. Это трудная задача, которая решается прежде всего получением фагоустойчивых штаммов био объекта. 78 Постоянное использование фильтров, стерилизующих технологический воздух, требует также периодической стерилизации самих фильтров, так как задержанные фильтром микроорганизмы могут при благоприятных условиях размножаться. Слои фильтрующего материала будут при этом прорастать, микроорганизм появляется на чистой стороне фильтра и затем с потоком воздуха, проходящего через фильтр, распространяется по воздуховодами внутренней поверхности ферментера. Стерилизация фильтров может быть проведена обработкой антисептиками, ионизирующим облучением и, наконец, горячим паром. Последний метод наиболее надежен и экономичен. При выборе режима стерилизации, с одной стороны, обязательно уничтожить все микробные клетки и все споры, ас другой стороны, желательно сохранить свойства фильтрующего материала стем, чтобы продлить срок службы фильтров. Температура при обработке паром 120—125 С, время обработки 20—30 мин. Герметизация и стерилизация оборудования Асептические условия производства требуют стерилизации перед началом процесса всей аппаратуры (изнутри) и всех материальных потоков. Этого, однако, недостаточно. Стерильность должна быть сохранена в течение всего рабочего цикла. Иными словами, технологический процесс должен быть защищен от контаминации за счет обеспечения герметичности всех соединений в аппаратуре. В монтажной схеме любого ферментера имеется несколько десятков разного рода герметизирующих элементов. Наиболее распространенные из них — фланцевые соединения и запорная арматура уязвимы в отношении герметичности при монтаже с обвязкой ферментера. В системах, работающих в асептических условиях, должна быть обеспечена возможность стерилизации всех точек внутренних объектов аппаратов и коммуникаций. Для этого перед загрузкой ферментеров через них пропускают насыщенный водяной пар под давлением. Однако здесь существуют свои сложности. Это касается, например, открытых трубных окончаний — участков труб, одним концом соединенных с полостью ферментера, а другим соприкасающихся с атмосферой. К ним относятся узел отвода отработанного, те. прошедшего через ферментер, воздуха и узлы отбора проб. Повышенное давление в открытом трубном окончании создать невозможно, следовательно, и температура там будет не выше 100 С. Из-за этого приходится увеличивать продолжительность обработки. Обычно в трубе делают врезку, и вовремя работы пар Рис. 11. Схема очистки технологического воздуха (стрелками показано направление потока воздуха аза пределами цеха ферментации б — в цехе ферментации фильтре предварительной очистки, а зртем подают последовательно в компрессор с системой холодильников, фильтр грубой очистки, систему стерилизации (головной фильтр, фильтры тонкой очистки. Таким образом, воздух подвергается не менее чем трехкратной фильтрации и, как минимум, дважды пропускается через стерилизующие фильтры. При этом, если головной фильтр является общим для всех аппаратов в цехе или вне цеха ферментации, то каждый из фильтров тонкой очистки относится к конкретному аппарату. На стадии грубой очистки (головной фильтр) используются волокнистые фильтрующие материалы с волокнами диаметром от 15 до 50 мкм из стекла и базальта и грубозернистые пористые перегородки. Эффективность очистки на этой стадии достигает 98 На стадии тонкой очистки (индивидуальные фильтры) применяются тонковолокнистые материалы (картон и бумага) сволок нами диаметром 0,5 мкм зернистые жесткие фильтрующие перегородки — керамические и металлокерамические, из разных полимеров. Используются также мембранные фильтры. При выборе фильтрующих материалов учитывают размер бактериальной клетки (например, для кокковых форм диаметр волокна 1 мкм, а для такой широко распространенной бактерии, как кишечная палочка, — 2 мкм. Естественно, возникает вопрос о защите находящихся в ферментере биообъектов — бактерий, актиномицетов, грибов от фагов. Это трудная задача, которая решается прежде всего получением фагоустойчивых штаммов био объекта. 78 Постоянное использование фильтров, стерилизующих технологический воздух, требует также периодической стерилизации самих фильтров, так как задержанные фильтром микроорганизмы могут при благоприятных условиях размножаться. Слои фильтрующего материала будут при этом прорастать, микроорганизм I появляется на чистой стороне фильтра и затем с потоком воздуха, проходящего через фильтр, распространяется по воздуховодами внутренней поверхности ферментера. Стерилизация фильтров может быть проведена обработкой антисептиками, ионизирующим облучением и, наконец, горячим I паром. Последний метод наиболее надежен и экономичен. При I выборе режима стерилизации, с одной стороны, обязательно уничтожить все микробные клетки и все споры, ас другой стороны, I желательно сохранить свойства фильтрующего материала стем чтобы продлить срок службы фильтров. Температура при обработке паром 120— 125 С, время обработки 20—30 мин .3. Герметизация и стерилизация оборудования Асептические условия производства требуют стерилизации перед началом процесса всей аппаратуры (изнутри) и всех материальных потоков. Этого, однако, недостаточно. Стерильность должна быть сохранена в течение всего рабочего цикла. Иными словами, технологический процесс должен быть защищен от контаминации за счет обеспечения герметичности всех соединений в I аппаратуре В монтажной схеме любого ферментера имеется несколько десятков разного рода герметизирующих элементов. Наиболее распространенные из них — фланцевые соединения и запорная арматура уязвимы в отношении герметичности при монтаже с обвязкой ферментера В системах, работающих в асептических условиях, должна быть обеспечена возможность стерилизации всех точек внутренних I объектов аппаратов и коммуникаций. Для этого перед загрузкой ( ферментеров через них пропускают насыщенный водяной пар под I давлением. Однако здесь существуют свои сложности. Это касается, например, открытых трубных окончаний — участков труб, одним концом соединенных с полостью ферментера, а другим соприкасающихся с атмосферой. К ним относятся узел отвода отработанного, те. прошедшего через ферментер, воздуха и узлы этбора проб. Повышенное давление в открытом трубном окончании создать невозможно, следовательно, и температура там будет не выше 100 С. Из-за этого приходится увеличивать продолжительность обработки. Обычно в трубе делают врезку, и вовремя работы пар непрерывно подается в открытое трубное окончание. В случае так называемых тупиковых полостей трудно обеспечить вытеснение воздуха и циркуляцию пара. Обычно в трубопровод врезают два вентиля, между которыми — подвод пара и отвод образующегося конденсата. Промышленные ферментеры большого объема стерилизуют в течение часа при 125— 130 С. Стерилизация питательных сред Используемые в промышленности среды (как правило, жидкие, комплексные, реже синтетические) стерилизуются тепловым методом (насыщенным паром). Устойчивость микроорганизмов к тепловому воздействию определяется многими факторами, в частности видовой принадлежностью микроорганизма. Учитывается, что споры гораздо устойчивее к нагреванию, чем вегетативные клетки. На эффективность тепловой стерилизации влияет количество клеток в среде чем их меньше, тем легче достигается стерилизующий эффект. Из этого следует, что перед стерилизацией необходимо понижать количество микробных клеток в среде. Определяющее значение при тепловой стерилизации имеют температура и время ее поддержания. Чем выше температура, тем быстрее достигается стерилизующий эффект. Для оценки эффективности процесса стерилизации используют физические (по температуре и давлению пара, химические (по температуре плавления или изменению цвета, микробиологические (с высевом на стандартные среды, биоиндикаторные (с использованием Bacillus stearothermophilus) методы. При тепловой стерилизации помимо гибели контаминирующих микроорганизмов могут разрушаться термолабильные вещества среды витамины, ферменты, некоторые аминокислоты. С этим явлением, ухудшающим качество питательных сред, борются, повышая температуру и уменьшая время стерилизации. Тепловая стерилизация жидкостей выполняется двумя способами периодическими непрерывным. При периодическом способе стерилизация происходит в самом ферментере. Одновременно нагревается весь объем жидкости (среды) до температуры стерилизации, которая выдерживается определенное время, после чего понижается до заданной. Этот способ прости применяется в случае небольших аппаратов. Его недостатки значительный градиент температуры по объему и «недостери- лизация» в тупиках. При непрерывном способе (более прогрессивном и производительном) стерилизация осуществляется в специальных установках В результате температуру можно увеличить до 130— 150 С при этом время стерилизации уменьшается домин, что положительно сказывается на качестве среды. Недостатком в данном случае является увеличение протяженности трубопроводов, что повышает вероятность вторичной контаминации .5 . Подготовка посевного материала Необходимо подчеркнуть, что каждая производственная культура, которая используется в качестве продуцента целевого продукта, должна иметь свой паспорт, в котором указаны ее название, род (вид, коллекционный номер, средний уровень активности, серия, дата выпуска, срок годности, характеристика среды для выращивания и хранения культуры. Процесс подготовки посевного материала многоступенчатый, состоит из нескольких последовательных этапов. Сначала исходная культура выращивается на агаризированной среде в пробирке. На этом этапе при высеивании исходной культуры на агаризированной среде можно посмотреть ее морфологию с целью изучения чистоты этой культуры. Далее выращивание ведется в колбах в жидкой среде на качалке. На этой стадии уже включается процесс аэрации и происходит перемешивание исходной культуры с жидкой питательной средой при определенной температуре. Затем исходную культуру, перемешанную с жидкой питательной средой, переливают в посевной аппарат (инокулятор) в количестве 10 — 25 % объема инокулятора. Здесь также осуществляются перемешивание и аэрация. Иногда посевной аппарат называют маленьким ферментером, а производственный аппарат — большим, функциональных различий между ними нет. При подготовке посевного материала происходит ступенчатое увеличение биомассы. Поэтому могут использоваться один или несколько посевных аппаратов, возрастающие по объему (выращивание посевного материала осуществляется примерно до уровня 5 — 10% объема основного ферментера. У инокулятора есть устройство подачи и фильтрации воздуха. Этот ферментер, как и основной, снабжен технологическими окнами, датчиками, отбой никами и т.д. В посевном аппарате питательная среда стабильна. В ферментере же по мере накопления целевого продукта концентрация углерода и азота падает, тес течением времени состав питательной среды изменяется. Поэтому микроорганизмы начинают испытывать дефицит питания, и их ответом на такое воздействие является выработка (выброс, например, антибиотика |