Введение в биотехнологию. Презентационные материалы. Банк тестовых заданий в системе UniTest». Ю. О. Сазыкин С. Н. Орехов И. И. Чакалева
 Скачать 7.47 Mb.
|
|
На примере промышленного получения кортизона можно показать, каких успехов можно достичь при использовании методов биотрансформации. Первоначальный химический синтез кортизона насчитывал 37 стадий, и стоимость 1 г вещества составляла 200 долл. США В 1952 г. было обнаружено, что штамм Rhizopus nigricans способен гидроксилировать прогестерон (промежуточный продукт синтеза кортизона). В результате синтез кортизона сократился до 11 стадий, а стоимость гормона упала до 6 долл. за 1 г. Кроме того, в случае применения биотрансформации брожение происходило при 37 Си атмосферном давлении (10 5 Пав водной среде, тогда как химический синтез требовал экстремальных температур и давлений, осложняя и удорожая технологию производства. Дальнейшее совершенствование биотехнологического производства (использование мутантных штаммов) позволило кг. снизить цену кортизона в США до 0,3 долл. за 1 г, те. в 600 с лишним раз меньше по сравнению сценой в 1930 г. Внедрение биотрансформации в процессы получения стероидных гормональных препаратов вызвало буквально переворот в фармацевтической промышленности, позволив многократно удешевить и сделать эти ценные лекарственные препараты доступными для большинства нуждающихся людей. Для синтеза указанных гормонов используют природные соединения, содержащие стероидную структуру, которую необходимо химически модифицировать перед введением функциональных заместителей того или иного гормона. В качестве исходного сырья для производства этих препаратов используются стерины растений (класс фитостеринов). Прежде всего, это — эргостерин, обнаруженный у многочисленных представителей растительного мира, а также у грибов и микроорга низмов. Особенно много эргостерина в дрожжевых микроорганизмах для его промышленного получения используют пекарские дрож жи). Следующий представитель фитостеринов — стигмастерин, который в значительных количествах присутствует в соевом масле и сахарном тростнике. Весьма близок к нему по структуре (сито стерин, отличаясь лишь отсутствием двойной связи в боковой цепи в формуле показано стрелкой): Ситостерины присутствуют в больших количествах в хлопковом масле, в зародышах пшеницы, в натуральном каучуке, в сахарном тростнике. Получают ситостерин и при переработке древесины в целлюлозно-бумажном производстве. В условиях промышленного производства из ситостерина получают андростендион (АД) путем окисления боковой цепи стери- нас образованием 17-кетоандростана с помощью мутантных штаммов Mycobacterium vacca (штаммы, у которых блокированы системы, ответственные за полный распад стероидного скелета. В этой комплексной технологии помимо химических стадий используются методы микробиологической трансформации для введения гидроксильной группы в положение стероидной структуры и двойной связи в положение. Для этих групп известны альтернативные химические варианты, но они уступают по эффективности биотрансформации из-за многостадийности, более низкого выхода и по экологическим показателям. О высокой региосе- лективности микробиологического отщепления боковой цепи си тостерина (без затрагивания стероидного скелета) свидетельствует высокий выход (70— 80%) продукта трансформации. Кроме выхода целевого продукта важным показателем, определяющим экономичность процесса микробиологической трансформации стероидного субстрата, является концентрация стероида в культуральной жидкости. В данном процессе концентрация ситостерина составляет 10— 15 гл, при этом стерин вносится в культуральную жидкость в микронизированном виде. Поскольку стероиды труднорастворимы вводе, то и целевой продукт трансформации — АД на 99 % выделяется в виде кристаллов. Это свойство стероида определяет метод его извлечения. Сначала методом фильтрации культуральную жидкость отделяют от биомассы и кристаллов АД. Затем последние растворяют в ацетоне и еще раз фильтруют для отделения от биомассы. Концентрированием ацетонового раствора выделяют АД, который наконечной стадии перекристаллизовывают. Аналитический контроль реакции трансформации ведут отбором проб через определенные временные интервалы и анализом их методом тонкослойной хроматографии на силуфоле в присутствии свидетелей — исходного стероида, целевого продукта трансформации и некоторых промежуточных и побочных продуктов, которые участвуют в данном процессе. Дальнейшей химической модификацией АД получают такие препараты, как тестостерон, метилтестостерон, оксипроге- стерона капронат, спиронолактон и др. Биотрансформация стероидов — аэробный процесс глубинной ферментации, для проведения которой используется оборудование, отвечающее высокой степени массообмена. Трансформация может осуществляться как растущей на среде культурой, таки отмытыми от питательной среды клетками микроорганизма. Последний вариант предпочтительнее, поскольку облегчает выделение и очистку целевого продукта. Но, как показала производственная практика, не все микроорганизмы переносят промышленное сепарирование без потери активности так, представители муко- ровых грибов очень чувствительны к сепарированию, тогда как представители несовершенных грибов теряют свою активность незначительно. Способность трансформировать стероиды обнаружена в самых разных группах микроорганизмов. Используются, как правило естественные штаммы, выделенные из почвы или из других объектов. Условно можно сказать, что процессы гидроксилирования наиболее распространены среди грибов. Так, процесс 11а-гидро- ксилирования способны осуществлять представители 300 видов микроорганизмов, причем 50 % из них — несовершенные грибы и 20 % — фикомицеты. Бактериальным культурам больше присущи процессы окисления гидроксильных групп до кетонов, восстановление кетонов до оксигрупп, введение в кольцо стероидной молекулы двойных связей. Наиболее известные 1 l a -гидроксилирующие культуры относятся к родам Absidia, Beanveria, Curvularia, CunningHamella. Для дегидрирования в положении 1 , 2 в основном применяют Согупе- bacterium simplex. Для изомеризации с одновременным окислением 3-оксигруппы в 3-кетогруппу широко используются штаммы Corynebacterium mediolanum (sin. Flavobacterium dehydrogenans). Отметим важность этой реакции, поскольку источники сырья (ди- осгенин, соласодин) содержат 3(3-оксигруппу, тогда как активные стероидные препараты должны иметь 3-кетогруппу. Специфическая особенность процесса биотрансформаций — использование чистых культур микроорганизмов. Поэтому все операции по подготовке и выращиванию трансформирующих культур проводят в стерильных условиях. Используют культуру трансформатор в стадии замедления роста, когда питательные компоненты среды в значительной степени израсходованы, а сильно разросшаяся культура подавляет рост посторонней микрофлоры. Что касается микробиологического контроля, то он осуществляется только на стадии выращивания трансформирующей культуры. Стероиды — малорастворимые вводе соединения их растворимость колеблется от 0,3 гл (гидрокортизон) до 0,01 гл (ацето- нид фторкортексолона). Важным аспектом эффективности процессов трансформации является выбор оптимальной концентрации субстрата, зависящий от биологической доступности последнего. Поэтому трансформационные процессы осуществляют обычно при концентрации субстрата в пределах 1 — 1 0 гл, что предполагает нахождение основной массы стероида в твердой фазе. В этом случае необходимым условием является высокая степень предварительного измельчения стероидного субстрата (поступает в среду в микронизированном виде) с использованием ультразвуковых или механических измельчителей. В случае, когда растворимость стероидного субстрата слишком мала для проявления присущей микроорганизму ферментативной активности, задействуют методы, повышающие водорастворимость стероидов. Первый — подача стероида в растворителе, смешивающемся с водой (ацетоне, метаноле, этаноле, диметилформамиде, диметилсульфоксиде и др. Ограничением для применения этого метода является токсичность определенных концентраций раство рителей. Второй — использование водорастворимых форм стероидов в виде натриевых солей 2,1-гемисукцинатов или фосфатов. Осложняющим моментом для широкого использования таких модификаций является высокая степень избирательности по отношению к ним со стороны микроорганизмов, например для дегидриру ющего микроорганизма Corynebacterium simplex эти формы стероидов оказались недоступны. Третий метод — заключение стероидов в растворимый комплекс с циклодекстрином. Использование комплекса стероидов с циклодекстрином не имеет ограничений предыдущих методов. Микробиологическое гидроксилирование — наиболее часто применяемый метод получения стероидных препаратов, так как присутствие гидроксильных групп в положениях молекулы стероида обусловливает, как правило, физиологическую активность для большинства гормональных стероидных препаратов. Широко используется в промышленности микробиологический синтез одного из основных кортикостероидов — гидрокортизона (кортизола) и его синтетических аналогов преднизолона и декс- аметазона. В этом случае исходным продуктом для 1 ip-гидрокси- 154 лирования может служить вещество Рейхштейна (кортексолон), которое для краткости принято называть вещество S»: 1 9 2 ° С = 0 17 \ 2 3 о Само по себе вещество S» является модифицированным продуктом биотрансформации (с помощью культуры Corynebacterium mediolanum) моноацетата вещества Процесс ферментативного превращения моноацетата вещества R» в вещество S» с помощью вышеуказанной культуры состоит из гидролиза 21-ацетофуппы и окисления Зр-гидроксигруппы в 3-ке- тофуппу с одновременной мифацией двойной связи. Отметим, что данная трансформация имеет принципиальное значение в производстве кортикостероидов, так как практически определяет количественный выход вещества S», что в свою очередь в значительной степени влияет наконечный выход продуктов следующих трансформаций. Применение в качестве субстрата не вещества S», а моноаце тата вещества R» позволило увеличить выход гидрокортизона с 50 до 7 0 - 7 3 % Вместе стем было установлено, что использование в производстве гидрокортизона промышленного штамма грибковой культуры Curvalaria lunata имеет преимущество по выходу целевого продукта и по наименьшему количеству примесей перед другими микроорганизмами, например, Absidia ovchidis. Гидроксилирова- НО 155 ние в lip -положении сопряжено с образованием а, аи гидроксипроизводных в качестве нежелательных, побочных продуктов данной реакции. Широкую субстратную специфичность гидролаз демонстрируют многое микроорганизмы. Например, штамм CunninghameUa blakesleeana вводит оксигруппу в 1 ф-положение большого набора стероидов щ производных эстрана, тестостерона, кортексолона, прогестерона и т.д. Главным препятствием, стоящим на пути развития промышленного микробиологического гидроксилирования стероидов является низкая производительность ферментаций, несмотря на высокий процентный выход по субстрату. Причины этого, с одной стороны, практическая нерастворимость стероидных субстратов вводе, ас другой — токсичность применяемых растворителей и, следовательно, невозможность использования достаточно высоких концентраций субстрата. М икробиологическое дегидрирование стероидов также имеет большое значение, поскольку введение двойной связи способствует повышению физиологической активности. Например, преднизалон: являясь 1 , 2 -дегидроаналогом гидрокортизона, превосходит последний по противовоспалительной и антиаллергической активности, проявляя при этом значительно меньше побочных эффектов. В реакции дегидрирования принимает участие внутриклеточный фермент 3-оксистероид- 1 , 2 -дегидрогеназа, локализованный на внешней стороне цитоплазматической мембраны. В процессе реакции электроны с фермента переносятся на кислород через дыхательную цепь потребление кислорода происходит стехиометрически. Биотрансформация гидрокортизона в преднизалон осуществляется штаммами Mycobacterium globiforme, дегидрогеназы которых обладают широкой субстратной специфичностью, что позволяет получать целевые продукты с высоким количественным выходом — до 85 %. Поэтому данный процесс экономически выгоден ив целом обеспечивает рентабельность производства. Возможны случаи, когда для биотрансформации требуются смешанные культуры или последовательное добавление микробных штаммов или видов, каждый из которых строго индивидуален в осуществлении каждой специфической стадии. Значитель- СН 3 ОН С—СН2ОН Оный эффект биотрансф орм ации связан с использованием иммобилизованных клеток (более стабильных, чем ферменты или клеточные культуры. В пользу данного метода свидетельствует тот факт, что участвующие в этом процессе ферменты — дегидрогеназы представлены довольно лабильными белками, выделение и очистка которых является трудоемкой и дорогой процедурой. Кроме того, интактные клетки микроорганизмов обладают более совершенными защитными механизмами и возможностью регенерировать кофакторы, необходимые для ферментативных реакций. Также этот метод позволяет положительно решать проблемы, связанные с нерастворимостью стероидных субстратов. Наконец, данный метод дает возможность многократного использования иммобилизованных клеток с применением последующей автоматизации процесса, что в конечном итоге приводит к значительному уменьшению затратна выделение и очистку продуктов реакции. К методам применяемой иммобилизации относятся адсорбция ковалентное связывание, микрокапсулирование, а также включение в разные полимеры. Например, включение в альгинатные гели относится к мягким методам иммобилизации, те. клетки после иммобилизации остаются жизнеспособными и могут осуществлять полиферментны е процессы. Положительным качеством геля является возможность размножения в нем клеток, а также его способность к растворению при изменении и температуры что позволяет выделять жизнеспособные клетки. В заключение отметим, что в промышленном производстве стероидных препаратов биотехнологические методы имеют конкретные преимущества перед методами химического синтеза возможность реакций, недоступных для химического синтеза превращение субстрата в биологически активную форму соединения в течение одной стадии процесса (в отличие от многостадийного и весьма затратного химического синтеза удобство, экономичность и экологичность производства. Витамины Витамины представляют низкомолекулярные органические соединения, необходимые для жизнедеятельности организма, синтез которых в организме либо ограничен, либо отсутствует. Не подлежит сомнению исключительно высокая биологическая активность витаминов. Потребность в них для организма человека вполне достаточна в очень небольших количествах (от нескольких микрограммов до нескольких десятков миллиграммов в день). Витамины, не являясь пластическим материалом или источником энергии, служат активными биокатализаторами разных метаболических процессов в организме. Почти все водорастворимые витамины, а также жирорастворимый витамин К являются коферментами или кофакторами биохимических реакций. Витамины A, D , Е регулируют генетический аппарат клетки. Помимо этого абсолютно каждому витамину свойственна своя, специфическая функция в организме. Все это указывает на незаменимость витаминов для жизнедеятельности организма. В современных социально-экономических условиях вследствие индустриализации и достижений цивилизации человек изменил характер питания и стал употреблять много рафинированных икон сервированных продуктов, обладающих меньшей витаминной ценностью. В качестве примера можно привести муку высших сортов при производстве которой теряется до 80—90 % всех витаминов. Другой пример, при операции экстрагирования, дезодорирования и осветления растительных масел разрушаются жирорастворимые витамины. Витамины А, Е, К и каротин достаточно устойчивы к термообработке, но весьма чувствительны к свету и кислороду воздуха. Для стран со слаборазвитой экономикой дефицит витаминов приобретает массовое явление вследствие достаточно низкого прожиточного минимума для большинства населения этих стран, одновременно с этим снижается качество питания из-за отсутствия в нем свежих овощей, фруктов, мяса, рыбы. Ш ирокое распространение полигиповитаминозов, снижение резистентности организма к болезнетворным микроорганизмам сопровождающееся вредными экологическими факторами (радиацией, канцерогенами, промышленными токсинами) — все это повышает роль витаминов в профилактической и лечебной работе врачей, поэтому в экономически развитых странах стали реализо вываться государственные программы искусственной витамини зации пищевых продуктов (муки, хлеба, молока, соков и др.). В основе классификации витаминов (табл. 1) находятся их фи зико-химические свойства, в соответствии с которыми все витамины делят на водо- и жирорастворимые. Известно, что водорастворимые витамины в тканях не накапливаются (за исключением витамина Виз чего следует необходимость их ежедневного поступления в организм. Жирорастворимые витамины способны накапливаться в тканях, поэтому их недостаточность или дефицит встречаются реже. Для них несвойственна и коферментная функция (кроме витамина К. Интересно, что, выполняя функцию индукторов синтеза белков, представители жиро растворимых витаминов проявляют сходство со стероидными гормонами, особенно это имеет отношение к витамину D. И, наконец все жирорастворимые витамины являются структурными компонентами клеточных мембран, проявляя антиоксидантное действие. Обращаясь к источникам витаминов, можно сказать, что приоритет в этом случае остается за растениями. Не секрет, что на содержание витаминов в пищевых продуктах существенно влияет Таблица Классификация витаминов Буквенное обозна чение Химическое название Активная форма витамина Лечебный эффект |